RU2701850C2 - Конструирование систем, способы и оптимизированные направляющие композиции для манипуляции с последовательностями - Google Patents

Конструирование систем, способы и оптимизированные направляющие композиции для манипуляции с последовательностями Download PDF

Info

Publication number
RU2701850C2
RU2701850C2 RU2015128098A RU2015128098A RU2701850C2 RU 2701850 C2 RU2701850 C2 RU 2701850C2 RU 2015128098 A RU2015128098 A RU 2015128098A RU 2015128098 A RU2015128098 A RU 2015128098A RU 2701850 C2 RU2701850 C2 RU 2701850C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
sequence
crispr
tracr
cas system
guide
Prior art date
Application number
RU2015128098A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015128098A (ru
RU2015128098A3 (ru
Inventor
Фэн ЧЖАН
Лэ ЦУН
Патрик ХСЮ
Фэй РАН
Original Assignee
Те Брод Инститьют, Инк.
Массачусетс Инститьют Оф Текнолоджи
Президент Энд Феллоуз Оф Харвард Коллидж
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49920627&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2701850(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Те Брод Инститьют, Инк., Массачусетс Инститьют Оф Текнолоджи, Президент Энд Феллоуз Оф Харвард Коллидж filed Critical Те Брод Инститьют, Инк.
Publication of RU2015128098A publication Critical patent/RU2015128098A/ru
Publication of RU2015128098A3 publication Critical patent/RU2015128098A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2701850C2 publication Critical patent/RU2701850C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/30—Detection of binding sites or motifs
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/50—Mutagenesis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описана система CRISPR-Cas для редактирования генома в эукариотической клетке, содержащая: белок Cas9, содержащий по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации, и химерную РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, содержащую: (a) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, (b) парную tracr-последовательность, способную гибридизоваться с tracr-последовательностью, и (c) tracr-последовательность, где (a), (b) и (c) расположены в 5’-3’ ориентации, где одна или несколько из направляющей, tracr- и парной tracr-последовательностей модифицированы для повышения стабильности и где необязательно белок Cas9 образует комплекс с химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas. Представлена векторная система CRISPR-Cas для модификации целевой последовательности в эукариотической клетке, содержащая один или несколько векторов, содержащих: I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей химерную РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, содержащую: (a) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, (b) парную tracr-последовательность, способную гибридизоваться с tracr-последовательностью, и (c) tracr-последовательность, где (a), (b) и (c) расположены в 5’-3’ ориентации, и II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок Cas9, содержащий по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации, где компоненты I и II находятся в одном и том же или в разных векторах системы, где одна или несколько из направляющей, tracr- и парной tracr-последовательностей модифицированы для повышения стабильности. Изобретение расширяет арсенал средств, контролирующих экспрессию. 2 н. и 47 з.п. ф-лы, 23 ил., 4 табл., 8 пр.

Description

Родственные заявки и включение при помощи ссылки
Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США 61/836127, озаглавленной "КОНСТРУИРОВАНИЕ СИСТЕМ, СПОСОБЫ И ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МАНИПУЛЯЦИИ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ" (ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION), поданной 17 июня 2013 г. Данная заявка также заявляет приоритет предварительных заявок на патент США 61/758468; 61/769046; 61/802174; 61/806375; 61/814263; 61/819803 и 61/828130, каждая из которых озаглавлена "КОНСТРУИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМ, СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МАНИПУЛЯЦИИ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ" (ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION), поданных 30 января 2013 г.; 25 февраля 2013 г.; 15 марта 2013 г.; 28 марта 2013 г.; 20 апреля 2013 г.; 6 мая 2013 г. и 28 мая 2013 г., соответственно. Также заявляется приоритет предварительных заявок на патент США 61/736527 и 61/748427, обе из которых озаглавлены "СИСТЕМЫ, СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МАНИПУЛЯЦИИ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ" (SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION), поданных 12 декабря 2012 г. и 2 января 2013 г., соответственно. Также заявляется приоритет предварительных заявок на патент США 61/791409 и 61/835931, обе из которых озаглавлены BI-2011/008/44790.02.2003 и BI-2011/008/44790.03.2003, поданных 15 марта 2013 г. и 17 июня 2013 г., соответственно.
Также делается ссылка на предварительные заявки на патент США 61/835936, 61/836101, 61/836080, 61/836123 и 61/835973, каждая из которых подана 17 июня 2013 г.
Вышеприведенные заявки и все документы, цитируемые в них или во время их рассмотрения ("цитируемые документы заявки"), и все документы, цитируемые или упомянутые в цитируемых документах заявки, и все документы, цитируемые или упомянутые в данном документе ("документы, цитируемые в данном документе"), и все документы, цитируемые или упомянутые в документах, цитируемых в данном документе, совместно с любыми инструкциями изготовителя, описаниями, характеристиками продукта и технологическими картами для любых продуктов, упомянутых в данном документе или в любом документе, включенном с помощью ссылки в данный документ, таким образом, включены в данный документ с помощью ссылки и могут быть использованы в практическом осуществлении настоящего изобретения. Более конкретно, все документы, на которые ссылаются, включены при помощи ссылки в такой же мере, как если бы конкретно и отдельно было указано, что каждый отдельный документ включен при помощи ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение в целом относится к системам, способам и композициям, применяемым для контроля экспрессии генов, включающего целенаправленное воздействие на последовательность, такое как внесение изменений в геном или редактирование гена, при котором можно использовать векторные системы, близкие к коротким палиндромным повторам, регулярно расположенным группами, (CRISPR) и их компонентам.
Утверждение касательно финансируемого из федерального бюджета исследования Настоящее изобретение было разработано при правительственной поддержке, выданной Национальными институтами здравоохранения, NIH Pioneer Award DP1MH100706. Правительство обладает определенными правами на настоящее изобретение.
Предпосылки изобретения
Недавние достижения в технологиях секвенирования генома и способах анализа значительно ускорили возможность каталогизации и картирования генетических факторов, ассоциированных с широким разнообразием биологических функций и заболеваний. Технологии точного целенаправленного воздействия на геном необходимы для обеспечения систематичного обратного конструирования казуальных генетических изменений путем обеспечения возможности селективного внесения изменений в отдельные генетические элементы, а также для продвижения применений в области синтетической биологии, биотехнологии и медицины. Несмотря на то, что технологии редактирования генома, такие как конструктор доменов "цинковые пальцы", подобные транскрипционным активаторам эффекторы (TALE) или хоминг мегануклеазы, доступны для осуществления внесений изменений в целевой геном, все еще существует необходимость в новых технологиях конструирования генома, которые являются доступными, простыми в осуществлении, масштабируемыми и характеризуются возможностью целенаправленного воздействия на несколько положений в эукариотическом геноме.
Краткое описание изобретения
Существует актуальная необходимость в альтернативных и функциональных системах и технологиях для целенаправленного воздействия на последовательность с широким спектром применений. Настоящее изобретение удовлетворяет этой необходимости и предусматривает связанные с этим преимущества. CRISPR/Cas или система CRISPR-Cas (оба выражения используют взаимозаменяемо по всей данной заявке) не предусматривает получение индивидуализированных белков для целенаправленного воздействия на конкретные последовательности, но скорее один фермент Cas может быть запрограммирован короткой молекулой РНК для узнавания специфичной ДНК-мишени, другими словами, фермент Cas может связываться со специфичной ДНК-мишенью при помощи указанной короткой молекулы РНК. Добавление системы CRISPR-Cas к спектру технологий секвенирования генома и способов анализа может значительно упростить методику и ускорить возможность каталогизации и картирования генетических факторов, ассоциированных с широким разнообразием биологических функций и заболеваний. Для того чтобы эффективно использовать систему CRISPR-Cas для редактирования генома без вредного действия, важно понимать аспекты конструирования и оптимизации этих средств для конструирования генома, которые являются аспектами заявленного изобретения.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает векторную систему, содержащую один или несколько векторов. В некоторых вариантах осуществления система содержит (а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с парной tracr-последовательностью и одним или несколькими сайтами встраивания для встраивания одной или нескольких направляющих последовательностей выше парной tracr-последовательности, где при экспрессии направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью в клетке, к примеру, эукариотической клетке, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью; и (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей указанный фермент CRISPR, содержащий последовательность ядерной локализации; где компоненты (а) и (b) находятся в одном и том же или в разных векторах системы. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) дополнительно содержит tracr-последовательность ниже парной tracr-последовательности под контролем первого регуляторного элемента. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) дополнительно содержит две или более направляющие последовательности, функционально связанные с первым регуляторным элементом, где при экспрессии каждая из двух или более направляющих последовательностей управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR со своей целевой последовательностью в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления система содержит tracr-последовательность под контролем третьего регуляторного элемента, такого как промотор полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность характеризуется по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% комплементарности последовательности по длине парной tracr-последовательности при оптимальном выравнивании. В некоторых вариантах осуществления комплекс CRISPR содержит одну или несколько последовательностей ядерной локализации, достаточно эффективных, чтобы управлять накоплением указанного комплекса CRISPR в обнаруживаемом количестве в ядре эукариотической клетки. Не желая быть связанными теорией, полагают, что последовательность ядерной локализации не является необходимой для активности комплекса CRISPR у эукариот, но что включение таких последовательностей повышает активность системы, особенно в отношении нацеливания на молекулы нуклеиновых кислот в ядре. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом системы CRISPR II типа. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент Cas9 представляет собой Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes или S. thermophilus и может включать мутированный Cas9, полученный из этих организмов. Фермент может быть гомологом или ортологом Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или двух нитей в определенной точке целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления у фермента CRISPR отсутствует активность для расщепления нитей ДНК. В некоторых вариантах осуществления первый регуляторный элемент является промотором полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления второй регуляторный элемент является промотором полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность составляет по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 нуклеотидов, или от 10 до 30, или от 15 до 25, или от 15 до 20 нуклеотидов в длину. В целом и по всему данному описанию выражение "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Векторы включают, без ограничения, молекулы нуклеиновых кислот, которые являются одноцепочечными, двухцепочечными или частично двухцепочечными; молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат один или несколько свободных концов, не содержат свободных концов (к примеру, кольцевые); молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат ДНК, РНК или и ту, и другую; и другие разновидности полинуклеотидов, известных в уровне техники. Одним типом вектора является "плазмида", которая означает кольцевую петлю двухцепочечной ДНК, в которую можно встраивать дополнительные сегменты ДНК, как, например, при помощи стандартных технологий молекулярного клонирования. Другим типом вектора является вирусный вектор, где полученные из вируса последовательности ДНК или РНК присутствуют в векторе для упаковки в вирус (к примеру, ретровирусы, ретровирусы с дефективной системой репликации, аденовирусы, аденовирусы с дефективной системой репликации и аденоассоциированные вирусы). Вирусные векторы также включают полинуклеотиды, переносимые вирусами для трансфекции клетки-хозяина. Определенные векторы способны к саморегулируемой репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (к примеру, бактериальные векторы с бактериальной точкой начала репликации и эписомные векторы для млекопитающих). Другие векторы (к примеру, векторы для млекопитающих, отличные от эписомных) интегрируются в геном клетки-хозяина после введения в клетку- хозяина и, таким образом, реплицируются наряду с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе называют "векторами экспрессии". Общепринятые пригодные в технологиях рекомбинантной ДНК векторы экспрессии часто находятся в форме плазмид.
Рекомбинантные векторы экспрессии могут содержать нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные векторы экспрессии включают один или несколько регуляторных элементов, которые могут быть выбраны с учетом клеток-хозяев, которые предполагается использовать для экспрессии, которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, экспрессия которой предполагается. В контексте рекомбинантного вектора экспрессии выражение "функционально связанный" предназначено означать, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторным(и) элементом(ами) таким образом, при котором обеспечивается экспрессия нуклеотидной последовательности (к примеру, в in vitro системе транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда вектор вводят в клетку-хозяина).
Выражение "регуляторный элемент" предназначено включать промоторы, энхансеры, участки внутренней посадки рибосомы (IRES) и другие контролирующие экспрессию элементы (к примеру, сигналы терминации транскрипции, такие как сигналы полиаденилирования и поли-U-последовательности). Такие регуляторные элементы описаны, например, в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Регуляторные элементы включают такие, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и такие, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (к примеру, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Тканеспецифичный промотор может управлять экспрессией преимущественно в представляющей интерес целевой ткани, такой как мышца, нейрон, кость, кожа, кровь, конкретных органах (к примеру, печени, поджелудочной железе) или определенных типах клеток (к примеру, лимфоцитах). Регуляторные элементы также могут управлять экспрессией зависимым от времени образом, как, например, зависимым от клеточного цикла или зависимым от стадии развития образом, который может быть или может не быть также тканеспецифичным или специфичным к типу клеток. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит один или несколько промоторов pol III (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов pol III), один или несколько промоторов pol II (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов pol II), один или несколько промоторов pol I (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5 или более промоторов pol I) или их комбинации. Примеры промоторов pol III включают без ограничения промоторы U6 и H1. Примеры промоторов pol II включают без ограничения ретровирусный промотор LTR вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно с энхансером CMV) [см., например, Boshart et al, Cell, 41: 521-530 (1985)], промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы, промотор β-актина, промотор глицерофосыаткиназы (PGK) и промотор EF1α. Также выражением "регуляторный элемент" охвачены энхансерные элементы, такие как WPRE; энхансеры CMV; сегмент R-U5' в LTR HTLV-I (Mol. Cell. Biol., Vol.8(1), p.466-472, 1988); энхансер SV40; и интронная последовательность между экзонами 2 и 3 β-глобина кролика (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.78(3), p.1527-31, 1981). Специалистам в данной области будет понятно, что структура вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, подлежащей трансформации, желательный уровень экспрессии и т.п. Вектор можно вводить в клетки-хозяева с получением, таким образом, транскриптов, белков или пептидов, в том числе слитых белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, которые описаны в данном документе (к примеру, транскриптов коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), белков, ферментов, их мутантных форм, их слитых белков и т.п.).
Преимущественные векторы включают лентивирусы и аденоассоциированные вирусы, и типы таких векторов также могут быть выбраны для целенаправленного воздействия на определенные типы клеток.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает вектор, содержащий регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий одну или несколько последовательностей ядерной локализации. В некоторых вариантах осуществления указанный регуляторный элемент управляет транскрипцией фермента CRISPR в эукариотической клетке, так что указанный фермент CRISPR накапливается в обнаруживаемом количестве в ядре эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент является промотором полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом системы CRISPR II типа. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент Cas9 представляет собой Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes или S. thermophilus и может включать мутированный Cas9, полученный из этих организмов. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или двух нитей в определенной точке целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления у фермента CRISPR отсутствует активность для расщепления нитей ДНК.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает фермент CRISPR, содержащий одну или несколько последовательностей ядерной локализации, достаточно эффективных, чтобы управлять накоплением указанного фермента CRISPR в обнаруживаемом количестве в ядре эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом системы CRISPR II типа. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент Cas9 представляет собой Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes или S. thermophilus и может включать мутированный Cas9, полученный из этих организмов. Фермент может быть гомологом или ортологом Cas9. В некоторых вариантах осуществления у фермента CRISPR отсутствует способность расщеплять одну или несколько нитей целевой последовательности, с которой он связывается.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает эукариотическую клетку-хозяина, содержащую (а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с парной tracr-последовательностью и одним или несколькими сайтами встраивания для встраивания одной или нескольких направляющих последовательностей выше парной tracr-последовательности, где при экспрессии направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью в эукариотической клетке, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью; и/или (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей указанный фермент CRISPR, содержащий последовательность ядерной локализации. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит компоненты (а) и (b). В некоторых вариантах осуществления компонент (а), компонент (b) или компоненты (а) и (b) стабильно интегрируются в геном эукариотической клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) дополнительно содержит tracr-последовательность ниже парной tracr-последовательности под контролем первого регуляторного элемента. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) дополнительно содержит две или более направляющие последовательности, функционально связанные с первым регуляторным элементом, где при экспрессии каждая из двух или более направляющих последовательностей управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR со своей целевой последовательностью в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит третий регуляторный элемент, такой как промотор полимеразы III, функционально связанный с указанной tracr- последовательностью. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность характеризуется по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% комплементарности последовательности по длине парной tracr-последовательности при оптимальном выравнивании. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR содержит одну или несколько последовательностей ядерной локализации, достаточно эффективных, чтобы управлять накоплением указанного фермента CRISPR в обнаруживаемом количестве в ядре эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом системы CRISPR II типа. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент Cas9 представляет собой Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes или S. thermophilus и может включать мутированный Cas9, полученный из этих организмов. Фермент может быть гомологом или ортологом Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или двух нитей в определенной точке целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления у фермента CRISPR отсутствует активность для расщепления нитей ДНК. В некоторых вариантах осуществления первый регуляторный элемент является промотором полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления второй регуляторный элемент является промотором полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность составляет по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 нуклеотидов, или от 10 до 30, или от 15 до 25, или от 15 до 20 нуклеотидов в длину. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает отличный от человека эукариотический организм, предпочтительно многоклеточный эукариотический организм, содержащий эукариотическую клетку-хозяина согласно любому из описанных вариантов осуществления. В других аспектах настоящее изобретение предусматривает эукариотический организм, предпочтительно многоклеточный эукариотический организм, содержащий эукариотическую клетку-хозяина согласно любому из описанных вариантов осуществления. Организм в некоторых вариантах осуществления данных аспектов может быть животным, например, млекопитающим. Также организмом может быть членистоногое, как, например, насекомое. Организмом также может быть растение. Кроме того, организмом может быть гриб.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает набор, содержащий один или несколько компонентов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления набор содержит векторную систему и инструкции по применению набора. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит (а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с парной tracr-последовательностью и одним или несколькими сайтами встраивания для встраивания одной или нескольких направляющих последовательностей выше парной tracr-последовательности, где при экспрессии направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью в эукариотической клетке, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью; и/или (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей указанный фермент CRISPR, содержащий последовательность ядерной локализации. В некоторых вариантах осуществления набор содержит компоненты (а) и (b), находящиеся в одном и том же или в разных векторах системы. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) дополнительно содержит tracr-последовательность ниже парной tracr-последовательности под контролем первого регуляторного элемента. В некоторых вариантах осуществления компонент (а) дополнительно содержит две или более направляющие последовательности, функционально связанные с первым регуляторным элементом, где при экспрессии каждая из двух или более направляющих последовательностей управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR со своей целевой последовательностью в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления система дополнительно содержит третий регуляторный элемент, такой как промотор полимеразы III, функционально связанный с указанной tracr-последовательностью. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность характеризуется по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% комплементарности последовательности по длине парной tracr-последовательности при оптимальном выравнивании. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR содержит одну или несколько последовательностей ядерной локализации, достаточно эффективных, чтобы управлять накоплением указанного фермента CRISPR в обнаруживаемом количестве в ядре эукариотической клетки. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом системы CRISPR II типа. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является ферментом Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент Cas9 представляет собой Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes или S. thermophilus и может включать мутированный Cas9, полученный из этих организмов. Фермент может быть гомологом или ортологом Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или двух нитей в определенной точке целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления у фермента CRISPR отсутствует активность для расщепления нитей ДНК. В некоторых вариантах осуществления первый регуляторный элемент является промотором полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления второй регуляторный элемент является промотором полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность составляет по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 нуклеотидов, или от 10 до 30, или от 15 до 25, или от 15 до 20 нуклеотидов в длину.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ модификации целевого полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом для осуществления расщепления указанного целевого полинуклеотида с модификацией, таким образом, целевого полинуклеотида, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление включает расщепление одной или двух нитей в определенной точке целевой последовательности указанным ферментом CRISPR. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление приводит к сниженной транскрипции целевого гена. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает репарацию указанного расщепленного целевого полинуклеотида при помощи гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, где указанная репарация приводит к мутации, включающей вставку, делецию или замену одного или нескольких нуклеотидов указанного целевого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления указанная мутация приводит к одной или нескольким аминокислотным заменам в белке, экспрессируемом с гена, содержащего целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает доставку одного или нескольких векторов в указанную эукариотическую клетку, где один или несколько векторов управляют экспрессией одного или нескольких из: фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности. В некоторых вариантах осуществления указанные векторы доставляют в эукариотическую клетку в субъекте. В некоторых вариантах осуществления указанная модификация имеет место в указанной эукариотической клетке в клеточной культуре. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение указанной эукариотической клетки из субъекта перед указанной модификацией. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает возвращение указанной эукариотической клетки и/или клеток, полученных из субъекта, указанному субъекту.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с полинуклеотидом так, что указанное связывание приводит к повышенной или пониженной экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает доставку одного или нескольких векторов в указанные эукариотические клетки, где один или несколько векторов управляют экспрессией одного или нескольких из: фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения модельной эукариотической клетки, содержащей мутированный ген, ответственный за развитие заболевания. В некоторых вариантах осуществления ген, ответственный за развитие заболевания, является любым геном, ассоциированным с повышением риска наличия или развития заболевания. В некоторых вариантах осуществления способ включает (а) введение одного или нескольких векторов в эукариотическую клетку, где один или несколько векторов управляют экспрессией одного или нескольких из: фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности; и (b) обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом для осуществления расщепления целевого полинуклеотида в указанном гене, ответственном за развитие заболевания, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью в целевом полинуклеотиде, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, таким образом, получая модельную эукариотическую клетку, содержащую мутированный ген, ответственный за развитие заболевания. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление включает расщепление одной или двух нитей в определенной точке целевой последовательности указанным ферментом CRISPR. В некоторых вариантах осуществления указанное расщепление приводит к сниженной транскрипции целевого гена. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает репарацию указанного расщепленного целевого полинуклеотида при помощи гомологичной рекомбинации с экзогенным матричным полинуклеотидом, где указанная репарация приводит к мутации, включающей вставку, делецию или замену одного или нескольких нуклеотидов указанного целевого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления указанная мутация приводит к одной или нескольким аминокислотным заменам при экспрессии белка с гена, содержащего целевую последовательность.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения биологически активного средства, которое модулирует процесс передачи сигнала в клетке, ассоциированный с геном, ответственным за развитие заболевания. В некоторых вариантах осуществления ген, ответственный за развитие заболевания, является любым геном, ассоциированным с повышением риска наличия или развития заболевания. В некоторых вариантах осуществления способ включает (а) приведение тестового соединения в контакт с модельной клеткой по любому одному из описанных вариантов осуществления и (b) обнаружение изменения при считывании, которое свидетельствует об уменьшении или усилении процесса передачи сигнала в клетке, ассоциированного с указанной мутацией в указанном гене, ответственном за развитие заболевания, с получением, таким образом, указанного биологически активного средства, которое модулирует указанный процесс передачи сигнала в клетке, ассоциированный с указанным геном, ответственным за развитие заболевания.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает рекомбинантный полинуклеотид, содержащий направляющую последовательность выше парной tracr- последовательности, где направляющая последовательность при экспрессии управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с соответствующей целевой последовательностью, присутствующей в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность является вирусной последовательностью, присутствующей в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность является протоонкогеном или онкогеном.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ отбора одной или нескольких прокариотических клеток путем введения одной или нескольких мутаций в ген в одной или нескольких прокариотических клетках, при этом способ включает введение одного или нескольких векторов в прокариотическую(ие) клетку(и), где один или несколько векторов управляют экспрессией одного или нескольких из: фермента CRISPR, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, tracr-последовательности и матрицы редактирования; где матрица редактирования содержит одну или несколько мутаций, которые прекращают расщепление фермента CRISPR; обеспечение гомологичной рекомбинации матрицы редактирования с целевым полинуклеотидом в отбираемой(ых) клетке(ах); обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом для осуществления расщепления целевого полинуклеотида в указанном гене, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью в целевом полинуклеотиде, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, где связывание комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом индуцирует гибель клеток, с обеспечением тем самым отбора одной или нескольких прокариотических клеток, в которые были введены одна или несколько мутаций. В предпочтительном варианте осуществления фермент CRISPR представляет собой Cas9. В другом аспекте настоящего изобретения отбираемая клетка может быть эукариотической клеткой. Аспекты настоящего изобретения предусматривают отбор конкретных клеток без необходимости наличия маркера отбора или двухстадийного способа, который может включать систему негативного отбора.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую полинуклеотидную последовательность химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-CAS, где полинуклеотидная последовательность содержит (а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке, (b) парную tracr-последовательность и (с) tracr-последовательность, где (а), (b) и (с) расположены в 5'-3' ориентации, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью,
или
ферментную систему CRISPR, где система кодируется векторной системой, содержащей один или несколько векторов, которые содержат I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-CAS, где полинуклеотидная последовательность содержит (а) одну или несколько направляющих последовательностей, способных гибридизироваться с одной или несколькими целевыми последовательностями в эукариотической клетке, (b) парную tracr-последовательность и (с) одну или несколько tracr-последовательностей, и II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации, где (а), (b) и (с) расположены в 5'-3' ориентации, где компоненты I и II находятся в одном и том же или в разных векторах системы, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, или мультиплексную ферментную систему CRISPR, где система кодируется векторной системой, содержащей один или несколько векторов, которые содержат I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с (а) одним или несколькими направляющими последовательностями, способными гибридизироваться с целевой последовательностью в клетке, и (b) по меньшей мере одной или несколькими парными tracr-последовательностями, II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, и III. третий регуляторный элемент, функционально связанный с tracr-последовательностью, где компоненты I, II и III находятся в одном и том же или в разных векторах системы, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, и где в мультиплексной системе используется множество направляющих последовательностей и одна tracr-последовательность; и где одна или несколько из направляющих, tracr- и парных tracr-последовательностей модифицируются с повышением стабильности.
В аспектах настоящего изобретения модификация включает сконструированную вторичную структуру. Например, модификация может включать уменьшение участка гибридизации между парной tracr-последовательностью и tracr-последовательностью. Например, модификация также может включать слияние парной tracr-последовательности и tracr-последовательности посредством искусственной петли. Модификация может включать tracr-последовательность с длиной от 40 до 120 п.о. В вариантах осуществления настоящего изобретения tracr-последовательность составляет от 40 п.о. до полной длины tracr. В определенных вариантах осуществления длина tracRNA включает по меньшей мере нуклеотиды 1-67, а в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере нуклеотиды 1-85 tracRNA дикого типа. В некоторых вариантах осуществления можно использовать по меньшей мере нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 1-67 или 1-85 tracRNA Cas9 S. pyogenes дикого типа. В тех случаях, когда в системе CRISPR используются ферменты, отличные от Cas9 или отличные от SpCas9, тогда в релевантной tracRNA дикого типа могут присутствовать соответствующие нуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления длина tracRNA включает не более чем нуклеотиды 1-67 или 1-85 tracRNA дикого типа. Модификация может включать оптимизацию последовательности. В определенных аспектах оптимизация последовательности может включать снижение частоты встречаемости полиТ-последовательностей в tracr- и/или парной tracr-последовательности. Оптимизацию последовательности можно совмещать с уменьшением участка гибридизации между парной tracr-последовательностью и tracr- последовательностью; например, tracr-последовательностью уменьшенной длины.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает уменьшение полиТ- последовательностей в tracr- и/или парной tracr-последовательности. В некоторых аспектах настоящего изобретения один или несколько Т, присутствующих в полиТ-последовательности соответствующей последовательности дикого типа (то есть, фрагмент из более 3, 4, 5, 6 или более смежных Т-оснований; в некоторых вариантах осуществления фрагмент из не более 10, 9, 8, 7, 6 смежных Т-оснований), могут быть заменены на отличный от Т нуклеотид, к примеру, А, так что цепочка распадается на меньшие фрагменты из Т, при этом каждый фрагмент имеет 4 или менее 4 (например, 3 или 2) смежных Т. Основания, отличные от А можно использовать для замены, например, С или G, или не встречающиеся в природе нуклеотиды, или модифицированные нуклеотиды. Если цепочка из Т участвует в образовании "шпильки" (или структуры по типу "петля-на-стебле"), тогда предпочтительно, чтобы комплементарное основание для отличного от Т основания было изменено на комплементарное отличному от Т нуклеотиду. Например, если отличным от Т основанием является А, тогда его комплементарное основание может быть изменено на Т, к примеру, для сохранения или содействия сохранению вторичной структуры. К примеру, 5'-ТТТТТ может быть изменено с получением 5'-ТТТАТ, а комплементарная 5'-ААААА может быть изменена на 5'- АТААА.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает добавление терминаторной полиТ-последовательности. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает добавление терминаторной полиТ-последовательности в tracr- и/или парные tracr-последовательности. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает добавление терминаторной полиТ-последовательности в направляющую последовательность. Терминаторная полиТ-последовательность может содержать 5 смежных Т-оснований или более 5.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает изменение петель и/или "шпилек". В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает обеспечение минимум двух "шпилек" в направляющей последовательности. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает обеспечение "шпильки", образованной при помощи комплементации между tracr- и парной tracr-последовательностью (прямой повтор). В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает обеспечение одной или нескольких дополнительных "шпилек" на 3'-конце последовательности tracrRNA или по направлению к нему. Например, "шпилька" может быть образована путем обеспечения самокомплементарных последовательностей в последовательности tracRNA, соединенных петлей так, что "шпилька" образуется при самосворачивании. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает обеспечение дополнительных "шпилек", добавленных на 3' направляющей последовательности. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает удлинение 5'-конца направляющей последовательности. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает обеспечение одной или нескольких "шпилек" на 5'-конце направляющей последовательности. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает введение последовательности (5'-AGGACGAAGTCCTAA) на 5'-конце направляющей последовательности. Другие последовательности, подходящие для образования "шпилек", известны специалисту в данной области, и их можно использовать в определенных аспектах настоящего изобретения. В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрено по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более дополнительных "шпилек". В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрено не более 10, 9, 8, 7, 6 дополнительных "шпилек". В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает две "шпильки". В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает три "шпильки". В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает самое большее пять "шпилек".
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает обеспечение образования перекрестных связей или обеспечение одного или нескольких модифицированных нуклеотидов в полинуклеотидной последовательности. Модифицированные нуклеотиды и/или образование перекрестных связей могут предусматриваться в любой или во всех из tracr-, парных tracr- и/или направляющих последовательностей, и/или кодирующей фермент последовательности, и/или в векторных последовательностях. Модификации могут включать включение по меньшей мере одного не встречающегося в природе нуклеотида или модифицированного нуклеотида, или их аналогов. Модифицированные нуклеотиды могут быть модифицированы по фрагменту рибозы, фосфата и/или основания. Модифицированные нуклеотиды могут включать 2'-O-метил-аналоги, 2'-дезокси-аналоги или 2'-фтор-аналоги. Остов нуклеиновой кислоты можно модифицировать, например, можно использовать фосфотиоатный остов. Также возможно использование закрытых нуклеиновых кислот (LNA) или мостиковых нуклеиновых кислот (BNA). Дополнительные примеры модифицированных оснований включают без ограничения 2-аминопурин, 5-бромуридин, псевдоуридин, инозин, 7-метилгуанозин.
Будет понятно, что любая или все из вышеперечисленных модификаций могут быть предусмотрены в отдельности или в комбинации в данной системе CRISPR-Cas или ферментной системе CRISPR. Такая система может включать одну, две, три, четыре, пять или более указанных модификаций.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где фермент CRISPR является ферментом системы CRISPR II типа, к примеру, ферментом Cas9. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где фермент CRISPR состоит менее чем из одной тысячи аминокислот, или менее чем из четырех тысяч аминокислот. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где фермент Cas9 представляет собой StCas9 или StlCas9, или фермент Cas9 является ферментом Cas9 из организма, выбранного из группы, состоящей из рода Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium или Corynebacter. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где фермент CRISPR является нуклеазой, управляющей расщеплением обеих нитей в определенной точке целевой последовательности.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где первый регуляторный элемент является промотором полимеразы III. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где второй регуляторный элемент является промотором полимеразы II.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где направляющая последовательность содержит по меньшей мере пятнадцать нуклеотидов.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где модификация включает оптимизированную tracr- последовательность, и/или оптимизированную направляющую последовательность РНК, и/или совместно свернутую структуру tracr-последовательности и/или парной(ых) tracr- последовательности(ей), и/или стабилизирующие вторичные структуры tracr- последовательности, и/или tracr-последовательности с уменьшенным участком спаривания оснований, и/или tracr-последовательности, слитой с РНК-элементами; и/или в мультиплексной системе находятся две РНК, содержащие tracer и содержащие множество гидов, или одна РНК, содержащая множество химерных элементов.
В аспектах настоящего изобретения архитектура химерной РНК дополнительно оптимизирована в соответствии с результатами исследований мутационного процесса. В химерной РНК с двумя или более "шпильками" мутации в проксимальном прямом повторе для стабилизации "шпильки" могут привести к разрушению активности комплекса CRISPR. Мутации в дистальном прямом повторе для укорачивания или стабилизации "шпильки" могут не производить никакого воздействия на активность комплекса CRISPR. Рандомизация последовательности в петлевом участке между проксимальным и дистальным повторами может значительно снизить активность комплекса CRISPR. Замены одной пары оснований или рандомизация последовательности в линкерном участке между "шпильками" может привести к полной потере активности комплекса CRISPR. Стабилизация "шпильки" дистальных "шпилек", которые следуют за первой "шпилькой" после направляющей последовательности, может привести к сохранению или улучшению активности комплекса CRISPR. Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения архитектура химерной РНК может быть дополнительно оптимизирована путем получения меньшей химерной РНК, которая может иметь практическую значимость в отношении возможностей доставки для терапевтических целей и других применений, и этого можно достичь путем изменения дистального прямого повтора для того, чтобы укоротить или стабилизировать "шпильку". В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения архитектура химерной РНК может быть дополнительно оптимизирована путем стабилизации одной или нескольких дистальных "шпилек". Стабилизация "шпилек" может включать модификацию последовательностей, подходящих для образования "шпилек". В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрено по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более дополнительных "шпилек". В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрено не более 10, 9, 8, 7, 6 дополнительных "шпилек". В некоторых аспектах настоящего изобретения стабилизацией может быть образование перекрестных связей и другие модификации. Модификации могут включать включение по меньшей мере одного не встречающегося в природе нуклеотида или модифицированного нуклеотида, или их аналогов. Модифицированные нуклеотиды могут быть модифицированы по фрагменту рибозы, фосфата и/или основания. Модифицированные нуклеотиды могут включать 2'-O-метил-аналоги, 2'-дезокси-аналоги или 2'-фтор-аналоги. Остов нуклеиновой кислоты можно модифицировать, например, можно использовать фосфотиоатный остов. Также возможно использование закрытых нуклеиновых кислот (LNA) или мостиковых нуклеиновых кислот (BNA). Дополнительные примеры модифицированных оснований включают без ограничения 2-аминопурин, 5-бромуридин, псевдоуридин, инозин, 7-метилгуанозин.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает систему CRISPR-Cas или ферментную систему CRISPR, где фермент CRISPR кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке.
Соответственно, в некоторых аспектах настоящего изобретения длина tracRNA, необходимая для конструкции согласно настоящему изобретению, к примеру, химерной конструкции, необязательно должна быть фиксированной, и в некоторых аспектах настоящего изобретения она может составлять от 40 до 120 п.о., а в некоторых аспектах настоящего изобретения может составлять до полной длины tracr, к примеру, в некоторых аспектах настоящего изобретения, до 3'-конца tracr, которая прерывается сигналом терминации транскрипции в бактериальном геноме. В определенных вариантах осуществления длина tracRNA включает по меньшей мере нуклеотиды 1-67, а в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере нуклеотиды 1-85 tracRNA дикого типа. В некоторых вариантах осуществления можно использовать по меньшей мере нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 1-67 или 1-85 tracRNA Cas9 S. pyogenes дикого типа. В тех случаях, когда в системе CRISPR используются ферменты, отличные от Cas9 или отличные от SpCas9, тогда в релевантной tracRNA дикого типа могут присутствовать соответствующие нуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления длина tracRNA включает не более чем нуклеотиды 1-67 или 1-85 tracRNA дикого типа. В отношении оптимизации последовательности (к примеру, уменьшения полиТ-последовательностей), к примеру, касательно цепочек из Т, внутренних по отношению к парной tracr (прямой повтор) или tracrRNA, в некоторых аспектах настоящего изобретения один или несколько Т, присутствующих в полиТ-последовательности соответствующей последовательности дикого типа (то есть фрагмент из более 3, 4, 5, 6 или более смежных Т-оснований; в некоторых вариантах осуществления фрагмент из не более 10, 9, 8, 7, 6 смежных Т-оснований), могут быть заменены на отличный от Т нуклеотид, к примеру, А, так что цепочка распадается на меньшие фрагменты из Т, при этом каждый фрагмент имеет 4 или менее 4 (например, 3 или 2) смежных Т. Если цепочка из Т участвует в образовании "шпильки" (или структуры по типу "петля-на-стебле"), тогда предпочтительно, чтобы комплементарное основание для отличного от Т основания было изменено на комплементарное отличному от Т нуклеотиду. Например, если отличным от Т основанием является А, тогда его комплементарное основание может быть изменено на Т, к примеру, для сохранения или содействия сохранению вторичной структуры. К примеру, 5'-ТТТТТ может быть изменено с получением 5'-ТТТАТ, а комплементарная 5'-ААААА может быть изменена на 5'-ATAAA. В отношении присутствия терминаторных полиТ-последовательностей в транскрипте tracr + парная tracr, к примеру, поли-Т-терминатора (ТТТТТ или больше), в некоторых аспектах настоящего изобретения предпочтительно, чтобы таковой был добавлен к концу транскрипта, будь то в форме с двумя РНК (tracr и парной tracr) или с одной направляющей РНК. Касательно петель и "шпилек" в транскриптах tracr и парной tracr, в некоторых аспектах настоящего изобретения предпочтительно, чтобы минимум две "шпильки" присутствовали в химерной направляющей РНК. Первая "шпилька" может быть "шпилькой", образованной при помощи комплементации между tracr-последовательностью и парной tracr-последовательностью (прямой повтор). Вторая "шпилька" может быть на 3'-конце последовательности tracrRNA, и это может обеспечивать вторичную структуру для взаимодействия с Cas9. Дополнительные "шпильки" могут быть добавлены на 3' направляющей РНК, к примеру, в некоторых аспектах настоящего изобретения для того, чтобы повысить стабильность направляющей РНК. Кроме того, 5'-конец направляющей РНК в некоторых аспектах настоящего изобретения может быть удлинен. В некоторых аспектах настоящего изобретения можно рассматривать 20 п.о. на 5'-конце в качестве направляющей последовательности. 5'-часть может быть удлинена. Одна или несколько "шпилек" могут быть предусмотрены на 5'-части, к примеру, в некоторых аспектах настоящего изобретения это также может повышать стабильность направляющей РНК. В некоторых аспектах настоящего изобретения конкретная "шпилька" может быть обеспечена путем введения последовательности (5'-AGGACGAAGTCCTAA) на 5'-конце направляющей последовательности, а в некоторых аспектах настоящего изобретения это может помочь повысить стабильность. Другие последовательности, подходящие для образования "шпилек", известны специалисту в данной области, и их можно использовать в определенных аспектах настоящего изобретения. В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрено по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более дополнительных "шпилек". В некоторых аспектах настоящего изобретения предусмотрено не более 10, 9, 8, 7, 6 дополнительных "шпилек". Вышеизложенное также предусматривает аспекты настоящего изобретения, включающие вторичную структуру в направляющие последовательности. В некоторых аспектах настоящего изобретения могут иметь место образование перекрестных связей и другие модификации, к примеру, для повышения стабильности. Модификации могут включать включение по меньшей мере одного не встречающегося в природе нуклеотида или модифицированного нуклеотида, или их аналогов. Модифицированные нуклеотиды могут быть модифицированы по фрагменту рибозы, фосфата и/или основания. Модифицированные нуклеотиды могут включать 2'-O-метил-аналоги, 2'-дезокси-аналоги или 2'-фтор-аналоги. Остов нуклеиновой кислоты можно модифицировать, например, можно использовать фосфотиоатный остов. Также возможно использование закрытых нуклеиновых кислот (LNA) или мостиковых нуклеиновых кислот (BNA). Дополнительные примеры модифицированных оснований включают без ограничения 2-аминопурин, 5-бромуридин, псевдоуридин, инозин, 7-метилгуанозин. Такие модификации или образование перекрестных связей могут иметь место в направляющей последовательности или других последовательностях, смежных с направляющей последовательностью.
Соответственно, целью настоящего изобретения не является охват в пределах настоящего изобретения любого ранее известного продукта, способа получения продукта или способа применения продукта, так что заявители оставляют за собой право и настоящим раскрывают отказ от прав на любой ранее известный продукт, процесс или способ. Следует дополнительно отметить, что настоящее изобретение не предназначено охватывать в пределах объема настоящего изобретения любой продукт, способ получения продукта или способ применения продукта, который не соответствует письменному описанию и требованиям достаточного раскрытия сути изобретения USPTO (первый пункт § 112 статьи 35 USC) или ЕРО (статья 83 ЕРС), так что заявители оставляют за собой право и настоящим раскрывают отказ от прав на любой ранее описанный продукт, способ получения продукта или способ применения продукта.
Следует отметить, что в данном раскрытии и особенно в формуле изобретения и/или параграфах такие выражения, как "содержит", "содержащийся", "содержащий" и т.п., могут иметь значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они могут означать "включает", "включенный", "включающий" и т.п., и что такие выражения, как "состоящий, по сути, из" и "состоит, по сути, из" имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они допускают не указанные прямо элементы, но исключают элементы, которые имеются в известном уровне техники или которые влияют на основные или новые характеристики настоящего изобретения. Эти и другие варианты осуществления раскрыты или являются очевидными, исходя из следующего подробного описания, и охвачены им.
Краткое описание графических материалов
Новые признаки настоящего изобретения изложены с характерными особенностями в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения будет доступно благодаря ссылке на следующее подробное описание, в котором изложены показательные варианты осуществления, в которых используют принципы настоящего изобретения, и на сопутствующие графические материалы.
На фигуре 1 изображена схематическая модель системы CRISPR. Нуклеаза Cas9 из Streptococcus pyogenes (желтый) нацелена на геномную ДНК при помощи синтетической направляющей РНК (sgRNA), состоящей из 20-нуклеотидной направляющей последовательности (голубой) и каркаса (красный). Направляющая последовательность образует пары оснований с ДНК-мишенью (голубой) непосредственно выше необходимого мотива, смежного с протоспейсером (РАМ; пурпурный) 5'-NGG, и Cas9 опосредует двухцепочечный разрыв (DSB) на ~3 п.о. выше РАМ (красный треугольник).
На фигурах 2A-F изображена показательная система CRISPR, возможный механизм действия, иллюстративная адаптация для экспрессии в эукариотических клетках и результаты тестов, оценивающих ядерную локализацию и активность CRISPR.
На фигурах 3А-С изображена показательная кассета экспрессии для экспрессии элементов системы CRISPR в эукариотических клетках, предсказанные структуры иллюстративных направляющих последовательностей и активность системы CRISPR, которая измерена в эукариотических и прокариотических клетках.
На фигурах 4A-D показаны результаты оценивания специфичности SpCas9 в отношении иллюстративной мишени.
На фигурах 5A-G изображена показательная векторная система и результаты ее применения при управлении гомологичной рекомбинацией в эукариотических клетках.
На фигурах 6А-С показано сравнение различных транскриптов tracrRNA для опосредованного Cas9 целенаправленного воздействия на ген.
На фигурах 7A-D изображена показательная система CRISPR, иллюстративная адаптация для экспрессии в эукариотических клетках и результаты тестов, оценивающих активность CRISPR.
На фигурах 8А-С изображены иллюстративные манипуляции с системой CRISPR для целенаправленного воздействия на локусы генома в клетках млекопитающего.
На фигурах 9А-В показаны результаты анализа с помощью нозерн-блоттинга процессинга crRNA в клетках млекопитающего.
На фигурах 10А-С показаны схематическое изображение химерных РНК и результаты анализа с помощью SURVEYOR относительно активности системы CRISPR в эукариотических клетках.
На фигурах 11А-В показано графическое изображение результатов анализа с помощью SURVEYOR относительно активности системы CRISPR в эукариотических клетках.
На фигуре 12 показаны предсказанные вторичные структуры для показательных химерных РНК, содержащих направляющую последовательность, парную tracr- последовательность и tracr-последовательность.
На фигуре 13 представлено филогенетическое дерево генов Cas.
На фигурах 14A-F показан филогенетический анализ, выявляющий пять семейств Cas9, включая три группы больших Cas9 (~1400 аминокислот) и две малых Cas9 (~1100 аминокислот).
На фигуре 15 показан график, показывающий функцию разных оптимизированных направляющих РНК.
На фигуре 16 показана последовательность и структура разных направляющих химерных РНК.
На фигуре 17 показана совместно свернутая структура tracrRNA и прямого повтора.
На фигуре 18А и В показаны данные, полученные в результате in vitro оптимизации химерной направляющей РНК StlCas9.
На фигуре 19А-В показано расщепление либо неметилированных, либо метилированных мишеней при помощи клеточного лизата с SpCas9.
На фигурах 20A-G показана оптимизация архитектуры направляющей РНК для SpCas9-опосредованного редактирования генома млекопитающих, (а) Схематическое изображение бицистронного вектора экспрессии (РХ330) для управляемой промотором U6 одиночной направляющей РНК (sgRNA) и управляемого промотором CBh человеческого кодон-оптимизированного Cas9 Streptococcus pyogenes (hSpCas9), применяемых для всех последующих экспериментов. sgRNA, усеченная в разных указанных положениях, состоит из 20-нт направляющей последовательности (голубой) и каркаса (красный). (b) Анализ с помощью SURVEYOR в отношении опосредованных SpCas9 вставок/делеций в локусах ЕМХ1 и PVALB человека. Стрелки указывают на ожидаемые фрагменты, полученные в результате расщепления с помощью SURVEYOR (n=3). (с) Анализ с помощью нозерн-блотгинга для четырех усеченных архитектур sgRNA с U1 в качестве загрузочного контроля, (d) Как SpCas9 дикого типа (wt), так и никаза-мутант (D10A) SpCas9 способствовали вставке сайта HindIII. в ген ЕМХ1 человека. Однонитевые о лито нуклеотиды (ssODN), ориентированные либо в смысловом, либо антисмысловом направлении по отношению к геномной последовательности, использовали в качестве матриц для гомологичной рекомбинации, (е) Схематическое изображение локуса SERPINB5 человека. sgRNA и РАМ указаны при помощи цветных полос над последовательностями; метилцитозины (Me) выделены (розовый) и пронумерованы по отношению к сайту инициации транскрипции (TSS, +1). (f) Статус метилирования SERPINB5, оцененный при помощи бисульфитного секвенирования 16 клонов. Заполненные круги, метилированный CpG; белые круги, неметилированный CpG. (g) Эффективность модификации у трех sgRNA, нацеливающих на метилированный участок SEKPINB5, оцененная при помощи "глубокого" секвинирования (n=2). "Усы" указывают на интервалы Уилсона (способы он-лайн).
На фигурах 21А-В показана дополнительная оптимизация архитектуры sgRNA CRISPR-Cas. (а) Схематическое изображение четырех дополнительных архитектур sgRNA, I-IV. Каждая состоит из 20-нт направляющей последовательности (голубой), соединенной с прямым повтором (DR, серый), который гибридизируется с tracrRNA (красный). Гибрид DR-tracrRNA усечен в +12 или +22, которые указаны, искусственной структурой по типу "петля-на-стебле" GAAA. Положения усечения tracrRNA пронумерованы в соответствии с предварительно сообщенным сайтом инициации транскрипции для tracrRNA. Архитектуры II и IV sgRNA несут мутации в их полиU отрезках, которые могут служить в качестве терминаторов для осуществления преждевременной терминации транскрипции. (b) Анализ с помощью SURVEYOR в отношении опосредованных SpCas9 вставок/делеций в локусе ЕМХ1 человека для целевых сайтов 1-3. Стрелки указывают на ожидаемые фрагменты, полученные в результате расщепления с помощью SURVEYOR (n=3).
На фигуре 22 показана визуализация некоторых целевых сайтов в геноме человека.
На фигурах 23А-В показаны (А) схематическое изображение sgRNA и (В) анализ при помощи SURVEYOR пяти вариантов sgRNA касательно SaCas9 в отношении оптимальной усеченной архитектуры с наивысшей эффективностью расщепления.
Фигуры приведены в данном документе только в целях иллюстрации, и они не обязательно изображены в масштабе.
Подробное описание изобретения
Выражения "полинуклеотид", "нуклеотид", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" используют взаимозаменяемо. Они обозначают полимерную форму нуклеотидов любой длины, как дезоксирибонуклеотидов, так и рибонуклеотидов или их аналогов. Полинуклеотиды могут обладать любой пространственной структурой и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются следующие: кодирующие или некодирующе участки гена или фрагмента гена, локусы(локус), определенные в результате анализа сцепления, экзоны, интроны, информационная РНК (иРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, короткая интерферирующая РНК (siRNA), короткая шпилечная РНК (shRNA), микроРНК (miRNA), рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды для нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, как, например, метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. При наличии, модификации в нуклеотидную структуру могут быть внесены до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться отличными от нуклеотидов компонентами. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после полимеризации, как, например, путем конъюгации с компонентом для мечения.
В аспектах настоящего изобретения выражения "химерная РНК", "химерная направляющая РНК", "направляющая РНК", "одиночная направляющая РНК" и "синтетическая направляющая РНК" используют взаимозаменяемо, и они обозначают полинуклеотидную последовательность, содержащую направляющую последовательность, tracr-последовательность и парную tracr-последовательность. Выражение "направляющая последовательность" обозначает последовательность из приблизительно 20 п.о. в пределах направляющей РНК, которая определяет целевой сайт, и ее можно использовать взаимозаменяемо с выражениями "гид" или "спейсер". Выражение "парная tracr-последовательность" также можно использовать взаимозаменяемо с выражением "прямой(ые) повтор(ы)".
Используемое в данном документе выражение "дикий тип" является выражением из данной области, понятным специалисту в данной области, и означает типичную форму организма, штамма, гена или характеристики, которые встречаются в природе в отличие от мутантных или вариантных форм.
Используемое в данном документе выражение "вариант" следует понимать как означающее проявление качеств, которые характеризуются паттерном, который отличается от такового, встречающегося в природе.
Выражение "не встречающийся в природе" или "сконструированный" используют взаимозаменяемо, и оно указывает на вмешательство человека. Выражения, в тех случаях, когда они касаются молекул нуклеиновых кислот или полипептидов, означают, что молекула нуклеиновой кислоты или полипептид по меньшей мере практически не содержат по меньшей мере один отличный компонент, с которым они естественным образом связаны в природе и встречаются в природе.
"Комплементарность" означает способность нуклеиновой кислоты образовывать водородную(ые) связь(и) с другой последовательностью нуклеиновой кислоты при помощи либо традиционного спаривания оснований по Уотсону-Крику, либо других нетрадиционных типов. Процент комплементарности показывает процентную долю остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (к примеру, образование пар по Уотсону-Крику) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (к примеру, при этом 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 будут на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарны). "Точная комплементарность" означает, что все граничащие остатки последовательности нуклеиновой кислоты будут связаны водородными связями с тем же количеством граничащих остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. Выражение "практически комплементарный", используемое в данном документе, означает степень комплементарности, которая составляет по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% в пределах участка из 8, 9,10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35,40, 45, 50 или более нуклеотидов, или относится к двум нуклеиновым кислотам, которые гибиридизируются при жестких условиях.
Используемые в данном документе "жесткие условия" в отношении гибридизации означают условия, при которых нуклеиновая кислота с комплементарностью к целевой последовательности преимущественно гибридизируется с целевой последовательностью и практически не гибридизируется с нецелевыми последовательностями. Жесткие условия, как правило, являются зависимыми от последовательности и изменяются в зависимости от ряда факторов. Как правило, чем длиннее последовательность, тем выше температура, при которой последовательность специфично гибридизируется с целевой последовательностью. Неограничивающие примеры жестких условий описаны подробно в Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.
"Гибридизация" означает реакцию, при которой один или несколько полинуклеотидов реагируют с образованием комплекса, который стабилизируется посредством образования водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Образование водородных связей может происходить по принципу спаривания оснований по Уотсону-Крику, Хугстиновского связывания или любым другим специфичным к последовательности образом. Комплекс может содержать две нити, образующие дуплексную структуру, три или более нитей, образующих многонитевой комплекс, одиночную самогибридизирующуюся нить или любую их комбинацию. Реакция габридизапии может представлять собой стадию в более обширном способе, такую как начальная стадия ПЦР или расщепление полинуклеотида при помощи фермента. Последовательность, способную гибридизироваться с данной последовательностью, называют "комплементарной последовательностью" данной последовательности.
Используемое в данном документе выражение "стабилизация" или "повышение стабильности" в отношении компонентов системы CRISPR относится к предохранению или обеспечению устойчивости структуры молекулы. Это можно выполнить путем введения одной или нескольких мутаций, в том числе замен одной или нескольких пар оснований, увеличения количества "шпилек", образования перекрестных связей, разрушения определенных фрагментов нуклеотидов и других модификаций. Модификации могут включать включение по меньшей мере одного не встречающегося в природе нуклеотида или модифицированного нуклеотида, или их аналогов. Модифицированные нуклеотиды могут быть модифицированы по фрагменту рибозы, фосфата и/или основания. Модифицированные нуклеотиды могут включать 2'-O-метил-аналоги, 2'-дезокси-аналоги или 2'-фтор-аналоги. Остов нуклеиновой кислоты можно модифицировать, например, можно использовать фосфотиоатный остов. Также возможно использование закрытых нуклеиновых кислот (LNA) или мостиковых нуклеиновых кислот (BNA). Дополнительные примеры модифицированных оснований включают без ограничения 2-аминопурин, 5-бромуридин, псевдоуридин, инозин, 7-метилгуанозин. Такие модификации можно применять по отношению к любому компоненту системы CRISPR. В предпочтительных вариантах осуществления такие модификации осуществляют с РНК-компонентами, к примеру, направляющей РНК или химерной полинуклеотидной последовательностью.
Используемое в данном документе выражение "экспрессия" означает процесс, при котором полинуклеотид транскрибируется с ДНК-матрицы (как, например, с образованием мРНК или другого РНК-транскрипта), и/или способ, при помощи которого транскрибированная мРНК далее транслируется с образованием пептидов, полипептидов или белков. Транскрипты и кодируемые полипептиды можно в совокупности называть "продукт гена". Если полинуклеотид получен из геномной ДНК, то экспрессия может включать сплайсинг иРНК в эукариотической клетке.
Выражения "полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо в данном документе для обозначения полимеров из аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и его структура может прерываться отличными от аминокислот компонентами. Выражения также охватывают полимер из аминокислот, который был модифицирован; например, образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидизацией, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией, такой как соединение с компонентом для мечения. Используемое в данном документе выражение "аминокислота" включает природные и/или неприродные или синтетические аминокислоты, в том числе глицин и как D-, так и L-оптические изомеры, и аналога аминокислот, и пептидомиметики.
Выражения "субъект", "индивидуум" и "пациент" используют взаимозаменяемо в данном документе для обозначения позвоночного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека. Млекопитающие включают без ограничения мышей, обезьян, людей, сельскохозяйственных животных, животных для спорта и домашних животных. Также охватываются ткани, клетки и их потомство биологического организма, полученные in vivo или культивированные in vitro. В некоторых вариантах осуществления субъектом может быть беспозвоночное животное, например, насекомое или нематода; в то время как в других субъектом может быть растение или гриб.
Выражения "терапевтическое средство", "оказывающее терапевтический эффект средство" или "средство для лечения" используют взаимозаменяемо, и они означают молекулу или соединение, которые оказывают некоторое благоприятное воздействие при введении субъекту. Благоприятное воздействие включает осуществление диагностических определений; облегчение заболевания, симптома, нарушения или патологического состояния; ослабление или предупреждение начала проявления заболевания, симптома, нарушения или состояния; а также общее противодействие заболеванию, симптому, нарушению или патологическому состоянию.
Используемые в данном документе выражения "лечение", или "осуществление лечения", или "временное ослабление", или "облегчение" используют взаимозаменяемо. Эти выражения означают подход для получения благоприятных или желательных результатов, в том числе без ограничения терапевтической полезности и/или профилактической полезности. Под терапевтическим эффектом понимают любые терапевтически значимые улучшение или действие в отношении одного или нескольких заболеваний, состояний или симптомов при лечении. Для профилактического эффекта композиции можно вводить субъекту с риском развития конкретного заболевания, состояния или симптома или субъекту, который сообщает об одном или нескольких физиологических симптомах заболевания, даже если заболевание, состояние или симптом могли еще не проявиться.
Выражение "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" означает количество средства, которого достаточно для обеспечения благоприятных или желательных результатов. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от одного или нескольких из: субъекта и болезненного состояния, которые подлежат лечению, веса и возраста субъекта, тяжести болезненного состояния, способа введения и подобного, что специалист в данной области легко может определить. Выражение также применимо к дозе, с помощью которой можно получить изображение для определения любым одним из способов визуализации, описанных в данном документе. Конкретная доза может изменяться в зависимости от одного или нескольких из: конкретного выбранного средства, режима дозирования, которому следуют, того, вводят ли его в комбинации с другими средствами, выбора времени введения, визуализируемой ткани и физической системы доставки, в которой оно заключено.
Практическое применение настоящего изобретения предусматривает, если не указано иное, традиционные методики иммунологии, биохимии, химии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, геномики и технологию рекомбинантной ДНК, которые находятся в пределах квалификации специалиста в данной области. См. Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel, et al. eds., (1987)); серия METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).
Некоторые аспекты настоящего изобретения касаются векторных систем, содержащих один или несколько векторов, или векторов как таковых. Векторы могут быть разработаны для экспрессии транскриптов CRISPR (к примеру, транскриптов нуклеиновых кислот, белков или ферментов) в прокариотических или эукариотических клетках. Например, транскрипты CRISPR могут экспрессироваться в бактериальных клетках, как, например, Escherichia coli, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных векторов экспрессии), клетках дрожжей или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева дополнительно рассматриваются в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). В качестве альтернативы рекомбинантный вектор экспрессии может транскрибироваться и транслироваться in vitro, например, при помощи регуляторных последовательностей промотора Т7 и полимеразы Т7.
Векторы можно вводить и размножать в прокариоте. В некоторых вариантах осуществления прокариота используют для амплификации копий вектора, который предполагается вводить в эукариотическую клетку, или в качестве промежуточного вектора при получении вектора, который предполагается вводить в эукариотическую клетку (к примеру, путем амплификации плазмиды как части системы упаковки вирусного вектора). В некоторых вариантах осуществления прокариота используют для амплификации копий вектора и экспрессии одной или нескольких нуклеиновых кислот, как, например, для обеспечения источника одного или нескольких белков для доставки в клетку-хозяина или организм-хозяин. Экспрессию белков в прокариотах наиболее часто осуществляют в Escherichia coli с векторами, содержащими конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией либо слитых белков, либо отличных от слитых белков. В слитых векторах добавляют некоторое количество аминокислот к белку, закодированному в них, как, например, к амино-концу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы могут служить для одной или нескольких целей, как например: (i) для повышения экспрессии рекомбинантного белка; (ii) для повышения растворимости рекомбинантного белка и (iii) для содействия очистке рекомбинантного белка посредством функционирования в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто в слитые векторы экспрессии сайт протеолигического расщепления вводят в место соединения фрагмента слияния и рекомбинантного белка для облегчения отделения рекомбинантного белка от фрагмента слияния после очистки слитого белка. Такие ферменты и их когнатные распознающие последовательности включают фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Иллюстративные слитые векторы экспрессии включают pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс) и pRTT5 (Pharmacia, Пискатауэй, Нью-Джерси), в которых глутатион-S-трансфераза (GST), мальтоза-связывающий белок Е или белок А, соответственно, слиты с целевым рекомбинантным белком.
Примеры подходящих индуцибельных не являющихся слитыми векторов экспрессии Е. coli включают pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315) и pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89).
В некоторых вариантах осуществления вектор является вектором экспрессии для дрожжей. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerivisae включают pYepSecl (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, Сан-Диего, Калифорния) и picZ (InVitrogen Corp, Сан-Диего, Калифорния).
В некоторых вариантах осуществления вектор управляет экспрессией белка в клетках насекомых при помощи бакуловирусных векторов экспрессии. Бакуловирусные векторы, доступные для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых (к примеру, клетках SF9), включают группу рАс (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) и группу pVL (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39).
В некоторых вариантах осуществления вектор способен управлять экспрессией одной или нескольких последовательностей в клетках млекопитающих при помощи вектора экспрессии для млекопитающих. Примеры векторов экспрессии для млекопитающих включают pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) и рМТ2РС (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195). При использовании клеток млекопитающих функции контроля вектора экспрессии, как правило, обеспечиваются одним или несколькими регуляторными элементами. Например, широко используемые промоторы получают из вируса полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса, вируса обезьян 40 и других, раскрытых в данном документе и известных в уровне техники. Что качается других подходящих систем экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, см., к примеру, главы 16 и 17 в Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные векторы экспрессии для млекопитающих способны управлять экспрессией нуклеиновой кислоты преимущественно в определенном типе клеток (к примеру, тканеспецифичные регуляторные элементы используют для экспрессии нуклеиновой кислоты). Тканеспецифичные регуляторные элементы известны из уровня техники. Неограничивающие примеры подходящих тканеспецифичных промоторов включают промотор гена альбумина (специфичный к печени; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), специфичные к лимфоидной ткани промоторы (Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), в частности, промоторы рецепторов Т-клеток (Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) и иммуноглобулины (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748), нейрон-специфичные промоторы (к примеру, промотор гена нейрофиламента; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), специфичные к клеткам поджелудочной железы промоторы (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) и специфичные к клеткам молочной железы промоторы (к примеру, промотор молочной сыворотки; патент США №4873316 и публикация европейской заявки №264166). Регулируемые стадией развития промоторы также охвачены, к примеру, промоторы генов hox мыши (Kessel and Grass, 1990. Science 249: 374-379) и промотор гена α-фетопротеина (Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537- 546).
В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент является функционально связанным с одним или несколькими элементами системы CRISPR так, чтобы управлять экспрессией одного или нескольких элементов системы CRISPR. В целом, CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами), также известные как SPIDR (чередующиеся со спейсерами прямые повторы), составляют семейство локусов ДНК, которые, как правило, специфичны для определенного вида бактерий. Локус CRISPR включает определенный класс чередующихся коротких повторов последовательностей (SSR), которые были обнаружены у Е. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169: 5429-5433 [1987]; и Nakata et al., J. Bacteriol., 171: 3553-3556 [1989]), и ассоциированные гены. Подобные чередующиеся SSR были идентифицированы у Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena и Mycobacterium tuberculosis (см., Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: 1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: 254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307: 26-30 [1996]; и Mojica et al., Mol. Microbiol., 17: 85-93 [1995]). Локусы CRISPR, как правило, отличаются от других SSR по структуре повторов, которые были названы короткими повторами с регулярными интервалами (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol, 6:23-33 [2002]; и Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]). В целом, повторы являются короткими элементами, которые встречаются группами, которые регулярно разделены уникальными вставочными последовательностями с практически постоянной длинной (Mojica et al., [2000], выше). Несмотря на то, что последовательности повторов высоко консервативны между штаммами, некоторое количество чередующихся повторов и последовательностей спейсерных участков, как правило, отличаются от штамма к штамму (van Embden et al., J. Bacteriol., 182: 2393-2401 [2000]). Локусы CRISPR были идентифицированы у более чем 40 видов прокариот (см., к примеру, Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: 1565-1575 [2002]; и Mojica et al., [2005]), в том числе, без ограничения, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema и Thermotoga.
В целом, "система CRISPR" означает в совокупности транскрипты и другие элементы, участвующие в экспрессии CRISPR-ассоциированных ("Cas") генов или управлении их активностью, в том числе последовательности, кодирующие ген Cas, tracr-(транс-активируемую CRISPR) последовательность (к примеру, tracrRNA или активную частичную tracrRNA), парную tracr-последовательность (охватывающую "прямой повтор" и tracrRNA-процессированный неполный прямой повтор в контексте эндогенной системы CRISPR), направляющую последовательность (также называемую "спейсером" в контексте эндогенной системы CRISPR) или другие последовательности и транскрипты с локуса CRISPR. В некоторых вариантах осуществления один или несколько элементов системы CRISPR получены из системы CRISPR I типа, II типа или Ш типа. В некоторых вариантах осуществления один или несколько элементов системы CRISPR получены из определенного организма, содержащего эндогенную систему CRISPR, как, например, Streptococcus pyogenes. В целом, система CRISPR характеризуется элементами, которые способствуют образованию комплекса CRISPR на сайте целевой последовательности (также называемой протоспейсером в контексте эндогенной системы CRISPR). В контексте образования комплекса CRISPR "целевая последовательность" означает последовательность, по отношению к которой направляющая последовательность разработана так, чтобы обладать комплементарностью, где гибридизация между целевой последовательностью и направляющей последовательностью способствует образованию комплекса CRISPR. Полная комплементарность не обязательна при условии, что имеет место достаточная комплементарность для осуществления гибридизации и способствования образованию комплекса CRISPR. Целевая последовательность может содержать любой полинуклеотид, как, например, ДНК- или РНК-полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность расположена в ядре или цитоплазме клетки. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может находиться в органелле эукариотической клетки, например, митохондрии или хлоропласте. Последовательность или матрицу, которую можно применять для рекомбинации в целевом локусе, содержащем целевые последовательности, называют "матрицей редактирования", или "полинуклеотидом для редактирования", или "последовательностью для редактирования". В аспектах настоящего изобретения экзогенный матричный полинуклеотид можно называть матрицей редактирования. В одном аспекте настоящего изобретения рекомбинация является гомологичной рекомбинацией.
Как правило, в контексте эндогенной системы CRISPR образование комплекса CRISPR (содержащего направляющую последовательность, гибридизирующуюся с целевой последовательностью и образующую комплекс с одним или несколькими белками Cas) приводит к расщеплению одной или обеих нитей в или около (к примеру, в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований от) целевой последовательности. Не желая быть связанными теорией, полагают, что tracr-последовательность, которая может содержать или состоять из всей или части tracr-последовательности дикого типа (к примеру, приблизительно или более чем приблизительно 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 или более нуклеотидов tracr-последовательности дикого типа), может также образовывать часть комплекса CRISPR, как, например, путем гибридизации вдоль по меньшей мере части tracr-последовательности со всей или частью парной tracr-последовательности, которая функционально связана с направляющей последовательностью. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность обладает достаточной комплементарностью с парной tracr-последовательностью для гибридизации и участия в образовании комплекса CRISPR. Как и в случае с целевой последовательностью, полагают, что полная комплементарность не является необходимой при условии, что она является достаточной для выполнения функции. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность характеризуется по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% комплементарности последовательности по длине парной tracr-последовательности при оптимальном выравнивании. В некоторых вариантах осуществления один или несколько векторов, управляющих экспрессией одного или нескольких элементов системы CRISPR, вводят в клетку-хозяина, так что экспрессия элементов системы CRISPR управляет образованием комплекса CRISPR на одном или нескольких целевых сайтах. Например, каждое из фермента Cas, направляющей последовательности, связанной с парной tracr-последовательностью, и tracr-последовательности может быть функционально связано с отдельными регуляторными элементами в отдельных векторах. В качестве альтернативы, два или более элементов, экспрессируемых с одних и тех же или разных регуляторных элементов, можно объединять в одном векторе, с одним или несколькими дополнительными векторами, обеспечивая любые компоненты системы CRISPR, не включенные в первый вектор. Элементы системы CRISPR, которые объединены в один вектор, могут быть расположены в любой удобной ориентации, как, например, один элемент, расположенный 5' ("выше") относительно или 3' ("ниже") относительно второго элемента. Кодирующая последовательность одного элемента может быть расположена на той же или противоположной нити кодирующей последовательности второго элемента и направлена в том же или противоположном направлении. В некоторых вариантах осуществления один промотор управляет экспрессией транскрипта, кодирующего фермент CRISPR, и одной или нескольких из направляющей последовательности, парной tracr-последовательности (необязательно функционально связанной с направляющей последовательностью) и tracr-последовательности, встроенных в одну или несколько интронных последовательностей (к примеру, каждая в разном интроне, две или более по меньшей мере в одном интроне или все в одном интроне). В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR, направляющая последовательность, парная tracr-последовательность и tracr-последовательность функционально связаны с одним и тем же промотором и экспрессируются с него.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит один или несколько сайтов встраивания, как, например, последовательность узнавания рестрикционной эндонуклеазой (также называемая "сайтом клонирования"). В некоторых вариантах осуществления один или несколько сайтов встраивания (к примеру, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более сайтов встраивания) расположены выше и/или ниже одного или нескольких элементов последовательности одного или нескольких векторов. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит сайт встраивания выше парной tracr-последовательности и необязательно ниже регуляторного элемента, функционально связанного с парной tracr-последовательностью, так что после встраивания направляющей последовательности в сайт встраивания и при экспрессии направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит два или более сайта встраивания, при этом каждый сайт встраивания расположен между двумя парными tracr-последовательностями с тем, чтобы обеспечить возможность встраивания направляющей последовательности в каждый сайт. В таком расположении две или более направляющие последовательности могут содержать две или более копий одной направляющей последовательности, две или более различных направляющих последовательностей или их комбинации. В тех случаях, когда применяют несколько различных направляющих последовательностей, может быть использована одна экспрессирующая конструкция для целенаправленного воздействия активности CRISPR на несколько различных соответствующих целевых последовательностей в клетке. Например, один вектор может содержать приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более направляющих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более таких содержащих направляющие последовательности векторов могут быть предусмотрены и необязательно доставлены в клетку.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, как, например, белок Cas. Неограничивающие примеры белков Cas включают Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (также известный как Csn1 и Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Csc1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csxl5, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, их гомологи или их модифицированные варианты. Эти ферменты известны; например, аминокислотную последовательность белка Cas9 S. pyogenes можно найти в базе данных SwissProt под номером доступа Q99ZW2. В некоторых вариантах осуществления немодифицированный фермент CRISPR характеризуется активностью для расщепления ДНК, как, например, Cas9. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR представляет собой Cas9, и им может быть Cas9 из S. pyogenes или S. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или обеих нитей в определенной точке целевой последовательности, как, например, в пределах целевой последовательности и/или в пределах комплементарной последовательности целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или обеих нитей в пределах приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 или более пар оснований от первого или последнего нуклеотида целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует фермент CRISPR, который является мутированным по отношению к соответствующему ферменту дикого типа, так что у мутированного фермента CRISPR отсутствует способность расщеплять одну или обе нити целевого полинуклеотида, содержащего целевую последовательность. Например, замена аспартата на аланин (D10A) в каталитическом домене RuvC I Cas9 из S. pyogenes трансформирует Cas9 из нуклеазы, которая расщепляет обе нити, в никазу (расщепляет одну нить). Другие примеры мутаций, которые превращают Cas9 в никазу, включают без ограничения Н840А, N854A и N863A. В некоторых вариантах осуществления никазу Cas9 можно использовать в комбинации с направляющей(ими) последовательностью(ями), к примеру, двумя направляющими последовательностями, которые целенаправленно воздействуют, соответственно, на смысловую и антисмысловую нити ДНК-мишени. Эта комбинация позволяет надрезать обе нити и использовать их для индукции NHEJ. Авторы данной заявки показали (данные не показаны) эффективность двух мишеней для никаз (т.е. sgRNA, нацеленных на одну и ту же точку, но на различные нити ДНК) при индуцировании мутагенного NHEJ. Одиночная никаза (Cas9-D10A с одной sgRNA) не способна индуцировать NHEJ и создавать вставки/делеции, но авторы данной заявки показали, что двойная никаза (Cas9- D10A и две sgRNA, нацеленные на различные нити в одной и той же точке) способна делать это в эмбриональных стволовых клетках человека (hESC). Эффективность составляет приблизительно 50% таковой нуклеазы (т.е. нормального Cas9 без мутации D10) в hESC.
В качестве дополнительного примера два или более каталитических доменов Cas9 (RuvC I, RuvC II и RuvC III) можно подвергать мутациям с получением мутированного Cas9, у которого практически отсутствует вся активность для расщепления ДНК. В некоторых вариантах осуществления мутацию D10A объединяют с одной или несколькими из мутаций Н840А, N854A или N863A с получением фермента Cas9, у которого практически отсутствует вся активность для расщепления ДНК. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR рассматривают как такой, у которого практически отсутствует вся активность для расщепления ДНК, в случаях, когда активность для расщепления ДНК мутированного фермента составляет менее приблизительно 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% или меньше по отношению к его не мутированной форме. Могут быть целесообразными другие мутации; в тех случаях, когда Cas9 или другой фермент CRISPR получен из вида, отличного от S. pyogenes, могут быть произведены мутации в соответствующих аминокислотах для достижения подобных эффектов.
В некоторых вариантах осуществления кодирующая фермент последовательность, кодирующая фермент CRISPR, является кодон-оптимизированной для экспрессии в определенных клетках, как, например, эукариотических клетках. Эукариотические клетки могут быть клетками определенного организма или полученными из него, как, например, млекопитающего, в том числе, без ограничения, человека, мыши, крысы, кролика, собаки или отличного от человека примата. В целом, оптимизация кодонов означает способ модификации последовательности нуклеиновой кислоты для повышения экспрессии в представляющих интерес клетках-хозяевах путем замещения по меньшей мере одного кодона (к примеру, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более кодонов) нативной последовательности кодонами, которые чаще или наиболее часто используют в генах этой клетки-хозяина, в то же время сохраняя нативную аминокислотную последовательность. Разные виды проявляют определенное "предпочтение" в отношении конкретных кодонов определенной аминокислоты. "Предпочтение" кодонов (различия в частоте использования кодонов между организмами) часто соотносят с эффективностью трансляции информационной РНК (иРНК), которая, в свою очередь, как полагают, зависит, среди прочего, от свойств кодонов, которые транслируются, и доступности конкретных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке, как правило, является отражением кодонов, используемых наиболее часто при синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть приспособлены для оптимальной экспрессии генов в данном организме с использованием оптимизации кодонов. Таблицы частоты использования кодонов общедоступны, например, в "Базе данных частот использования кодонов" ("Codon Usage Database"), и эти таблицы можно адаптировать различными способами. См. Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Также доступны компьютерные алгоритмы для оптимизации кодонов определенной последовательности для экспрессии в определенной клетке-хозяине, как, например, также доступный Gene Forge (Aptagen; Джакобус, Пенсильвания). В некоторых вариантах осуществления один или несколько кодонов (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более или все кодоны) в последовательности, кодирующей фермент CRISPR, соответствуют наиболее часто используемому кодону для определенной аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует фермент CRISPR, содержащий одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS), как, например, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR содержит приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 или более NLS на амино-конце или рядом с ним, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS на карбокси-конце или рядом с ним или комбинацию этого (к примеру, одну или несколько NLS на амино-конце и одну или несколько NLS на карбокси-конце). В тех случаях, когда присутствуют несколько NLS, каждая может быть выбрана независимо от других, так что одна NLS может присутствовать в нескольких копиях и/или в комбинации с одной или несколькими другими NLS, присутствующими в одной или нескольких копиях. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фермент CRISPR содержит самое большее 6 NLS. В некоторых вариантах осуществления считают, что NLS находится рядом с N- или С-концом в тех случаях, когда самая близкая аминокислота NLS находится в пределах приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или более аминокислот вдоль полипетидной цепи от N- или С-конца. Обычно, NLS состоит из одной или нескольких коротких последовательностей положительно заряженных молекул лизина или аргинина, расположенных на поверхности белка, но известны другие типы NLS. Неограничивающие примеры NLS включают NLS-последовательности, полученные из: NLS из большого Т-антигена вируса SV40 с аминокислотной последовательностью PKKKRKV; NLS из нуклеоплазмина (к примеру, двойной NLS из нуклеоплазмина с последовательностью KRPAATKKAGQAKKKK); NLS из c-myc с аминокислотной последовательностью PAAKRVKLD или RQRRNELKRSP; NLS из hRNPA1 М9 с последовательностью NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY; последовательность RMRIZFKNKGKTDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV домена IBB из импортина-альфа; последовательности VSRKRPRP и PPKKARED из Т-белка миомы; последовательность POPKKKPL из р53 человека; последовательность SALIKKKKKMAP из c-abl IV мыши; последовательности DRLRR и PKQKKRK из NS1 вируса гриппа; последовательность PKLKKKIKKL из дельта-антигена вируса гепатита; последовательность REKKKFLKRR из белка Mxl мыши; последовательность KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK из поли(АДФ-рибоза)-полимеразы человека и последовательность RKCLQAGMNLEARKTKK из рецепторов стероидных гормонов для глюкокортикоидов (человека).
В целом, одна или несколько NLS являются достаточно эффективными, чтобы управлять накоплением фермента CRISPR в обнаруживаемом количестве в ядре эукариотической клетки. В целом, степень проявления активности ядерной локализации может быть результатом следующего: количества NLS в ферменте CRISPR, конкретных(ой) используемых(ой) NLS или комбинации этих факторов. Обнаружение накопления в ядре можно выполнять при помощи любой подходящей методики. Например, детектируемый маркер может быть слит с ферментом CRISPR, так что расположение в клетке может быть визуализировано, как, например, в комбинации со средствами для обнаружения расположения ядра (к примеру, окрашивающим средством, специфичным к ядру, таким как DAPI). Примеры детектируемых маркеров включают флуоресцентные белки (такие как зеленые флуоресцентные белки или GFP; RFP; CFP) и эпитопные метки (НА-метку, flag-метку, SNAP-метку). Ядра клеток также можно выделять из клеток, содержимое которых можно затем анализировать при помощи любого подходящего способа для обнаружения белка, как, например, иммуногистохимии, вестерн-блоттинга или анализа на активность фермента. Накопление в ядре также можно определить опосредованно, как, например, при помощи анализа действия образования комплекса CRISPR (к примеру, анализа на расщепление ДНК или мутацию в целевой последовательности или анализа на измененную при помощи образования комплекса CRISPR и/или активности фермента CRISPR активность экспрессии генов) по сравнению с контролем, который не подвергали воздействию фермента или комплекса CRISPR или подвергали воздействию фермента CRISPR, у которого отсутствуют одна или несколько NLS.
В целом, направляющая последовательность представляет собой любую полинуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью с целевой полинуклеотидной последовательностью для габридизапии с целевой последовательностью и управления специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между направляющей последовательностью и ее соответствующей целевой последовательностью при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания составляет приблизительно или более чем приблизительно 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. Оптимальное выравнивание можно определять при помощи любого подходящего алгоритма для выравниваемых последовательностей, неограничивающие примеры которого включают алгоритм Смита-Ватермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза-Уилера (к примеру, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies), ELAND (Illumina, Сан-Диего, Калифорния), SOAP (доступный на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступный на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность составляет приблизительно или более чем приблизительно 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность составляет менее чем приблизительно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20,15, 12 или менее нуклеотидов в длину. Способность направляющей последовательности управлять специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью можно оценить при помощи любого подходящего анализа. Например, компоненты системы CRISPR, достаточные для образования комплекса CRISPR, в том числе направляющая последовательность, которую необходимо исследовать, могут быть доставлены в клетку-хозяина с соответствующей целевой последовательностью, как, например, при помощи трансфекции векторами, кодирующими компоненты последовательности CRISPR, с последующей оценкой предпочтительного расщепления в пределах целевой последовательности, как, например, при помощи анализа с помощью Surveyor, который описан в данном документе. Подобным образом, расщепление целевой полинуклеотидной последовательности может быть установлено в пробирке путем обеспечения целевой последовательности, компонентов комплекса CRISPR, в том числе направляющей последовательности, которую необходимо исследовать, и контрольной направляющей последовательности, отличной от тестовой направляющей последовательности, и сравнения воздействий тестовой и контрольной направляющей последовательности на связывание или скорость расщепления целевой последовательности. Другие анализы возможны и будут очевидны специалисту в данной области.
Направляющая последовательность может быть выбрана для целенаправленного воздействия на любую целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность является последовательностью в пределах генома клетки. Иллюстративные целевые последовательности включают те, которые являются уникальными в целевом геноме. Например, для Cas9 S. pyogenes уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 в виде
Figure 00000001
, где
Figure 00000002
(N представляет собой A, G, Т или С; и X может быть любым) характеризуется единичным появлением в геноме. Уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 S. pyogenes в виде
Figure 00000003
где
Figure 00000004
(N представляет собой A, G, T или С; и X может быть любым) характеризуется единичным появлением в геноме. Для Cas9 CRISPR1 S. thermophilus уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 в виде
Figure 00000005
, где
Figure 00000006
(N представляет собой A, G, Т или С; X может быть любым; и W представляет собой А или Т) характеризуется единичным появлением в геноме. Уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 CRISPR1 S. thermophilus в виде
Figure 00000007
, где
Figure 00000008
(N представляет собой A, G, Т или С; X может быть любым; и W представляет собой А или Т) характеризуется единичным появлением в геноме. Для Cas9 S. pyogenes уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 в виде
Figure 00000009
, где
Figure 00000010
(N представляет собой A, G, Т или С; и X может быть любым) характеризуется единичным появлением в геноме. Уникальная целевая последовательность в геноме может включать целевой сайт для Cas9 S. pyogenes в виде
Figure 00000011
где
Figure 00000012
(N представляет собой A, G, Т или С; и X может быть любым) характеризуется единичным появлением в геноме. В каждой из этих последовательностей "М" может представлять собой A, G, Т или С и не должен учитываться при идентификации последовательности как уникальной.
В некоторых вариантах осуществления направляющая последовательность выбрана для снижения доли вторичной структуры в направляющей последовательности. Вторичную структуру можно определить при помощи любого подходящего алгоритма сворачивания полинуклеотида. Некоторые программы основаны на вычислении минимальной свободной энергии Гиббса. Примером одного такого алгоритма является mFold, который описан Zuker и Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148). Другим примером алгоритма сворачивания является доступный в режиме онлайн веб-сервер RNAfold, разработанный в Институте теоретической химии при Венском университете, в котором используется алгоритм прогнозирования структуры на основе центроидного метода (см., к примеру, A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; и PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62). Дополнительные алгоритмы можно найти в заявке на патент США с серийным номером ТВА (общая ссылка В1-2012/084 44790.11.2022); включенной в данный документ при помощи ссылки.
В общем, парная tracr-последовательность включает любую последовательность, которая характеризуется достаточной комплементарностью с tracr-последовательностью для содействия одному или нескольким из следующих: (1) вырезания направляющей последовательности, фланкированной парными tracr-последовательностями, в клетке, содержащей соответствующую tracr-последовательность; и (2) образования комплекса CRISPR на целевой последовательности, где комплекс CRISPR содержит парную tracr-последовательность, габридизирующуюся с tracr-последовательностью. В общем, степень комплементарности указана на основании оптимального выравнивания парной tracr-последовательности и tracr-последовательности по длине более короткой из двух последовательностей. Оптимальное выравнивание можно определить при помощи любого подходящего алгоритма выравнивания и можно дополнительно высчитать для вторичных структур, как, например, самокомплементарность в пределах либо tracr-последовательности, либо парной tracr-последовательности. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между tracr-последовательностью и парной tracr-последовательностью по длине более короткой из двух при оптимальном выравнивании составляет приблизительно или более чем приблизительно 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. Примерные иллюстрации оптимального выравнивания между tracr-последовательностью и парной tracr-последовательностью представлены на фигурах 12В и 13В. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность составляет приблизительно или более чем приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность и парная tracr-последовательность содержатся в одном транскрипте, так что габридизация между ними двумя дает транскрипт со вторичной структурой, такой как "шпилька". Предпочтительные петлеобразующие последовательности для использования в "шпилечных" структурах составляют четыре нуклеотида в длину и наиболее предпочтительно имеют последовательность GAAA. Однако можно использовать более короткие или длинные последовательности петли, а также альтернативные последовательности. Последовательности предпочтительно включают нуклеотидный триплет (например, AAA) и дополнительный нуклеотид (например, С или G). Примеры петлеобразующих последовательностей включают СААА и AAAG. В одном варианте осуществления настоящего изобретения транскрипт или транскрибированная полинуклеотидная последовательность характеризуются по меньшей мере двумя или более "шпильками". В предпочтительных вариантах осуществления транскрипт характеризуется двумя, тремя, четырьмя или пятью "шпильками". В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения транскрипт характеризуется самое большее пятью "шпильками". В некоторых вариантах осуществления один транскрипт дополнительно включает последовательность терминапии транскрипции; предпочтительно она является полиТ-последовательностью, например, из шести нуклеотидов Т. Примерная иллюстрация такой "шпилечной" структуры представлена в нижней части фигуры 13В, где часть последовательности в 5' направлении по отношению к концевому "N" и выше петли соответствует парной tracr-последовательности, а часть последовательности в 3' направлении по отношению к петле соответствует tracr-последовательности. Дополнительными неограничивающими примерами отдельных полинуклеотидов, содержащих направляющую последовательность, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность, являются следующие (перечисленные от 5' к 3'), где "N" представляет собой основание направляющей последовательности, первый блок букв нижнего регистра представляет собой парную tracr-последовательность, а второй блок букв нижнего регистра представляет собой tracr-последовательность, и конечная поли-Т-последовательность представляет собой терминатор транскрипции:
(1)
Figure 00000013
Figure 00000014
;
(2)
Figure 00000015
Figure 00000016
;
(3)
Figure 00000017
Figure 00000018
;
(4)
Figure 00000019
Figure 00000020
;
(5)
Figure 00000021
Figure 00000022
и (6)
Figure 00000023
Figure 00000024
. В некоторых вариантах осуществления последовательности (1)-(3) используют в комбинации с Cas9 из CRISPR1 S. thermophilus. В некоторых вариантах осуществления последовательности (4)-(6) используют в комбинации с Cas9 из S. pyogenes. В некоторых вариантах осуществления tracr-последовательность является транскриптом, отдельным от транскрипта, содержащего парную tracr-последовательность (как, например, показанная в верхней части фигуры 13В).
В некоторых вариантах осуществления также предусмотрена матрица для рекомбинации. Матрица для рекомбинации может быть компонентом другого вектора, который описан в данном документе, может содержаться в отдельном векторе или предусматриваться в виде отдельного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления матрица для рекомбинации разработана так, чтобы служить в качестве матрицы при гомологичной рекомбинации, как, например, в пределах или рядом с целевой последовательностью, надрезанной или расщепленной ферментом CRISPR, в качестве части комплекса CRISPR. Матричный полинуклеотид может быть любой подходящей длины, как, например, приблизительно или более чем приблизительно 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления матричный полинуклеотид комплементарен части полинуклеотида, содержащего целевую последовательность. При оптимальном выравнивании матричный полинуклеотид может перекрываться с одним или несколькими нуклеотидами целевых последовательностей (к примеру, с приблизительно или более чем приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более нуклеотидами). В некоторых вариантах осуществления при оптимальном выравнивании матричной последовательности и полинуклеотида, содержащего целевую последовательность, наиболее близкий нуклеотид матричного полинуклеотида находится в пределах приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 или более нуклеотидов от целевой последовательности.
В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является частью слитого белка, содержащего один или несколько доменов гетерологичного белка (к примеру, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 или более доменов в дополнение к ферменту CRISPR). Слитый белок, содержащий фермент CRISPR, может содержать любую дополнительную последовательность белка и необязательно линкерную последовательность между любыми двумя доменами. Примеры белковых доменов, которые могут быть слиты с ферментом CRISPR, включают, без ограничения, эпитопные метки, последовательности генов-репортеров и белковые домены с одним или несколькими из следующих видов активности: метилазной активности, деметилазной активности, активности для активации транскрипции, активности для репрессии транскрипции, активности фактора освобождения при транскрипции, активности для модификации гистонов, активности для расщепления ДНК и активности для связывания нуклеиновой кислоты. Неограничивающие примеры эпитопных меток включают гастидиновые (His) метки, V5-метки, FLAG-метки, метки гемагглютинина вируса гриппа (НА), Мус-метки, VSV-G-метки и тиоредоксиновые (Trx) метки. Примеры генов-репортеров включают, без ограничения, глутатион-S-трансферазу (GST), пероксидазу хрена (HRP), хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (CAT), бета-галактозидазу, бета-глюкуронидазу, люциферазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), HcRed, DsRed, голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и автофлуорисцирующие белки, в том числе синий флуоресцевлный белок (BFP). Фермент CRISPR может быть слит с последовательностью гена, кодирующей белок или фрагмент белка, которые связываются с молекулой ДНК или связываются с другими клеточными молекулами, в том числе, без ограничения, связывающим мальтозу белком (МБР), S-меткой, продуктами слияния Lex А и ДНК-связывающего домена (DBD), продуктами слияния GAL4 и ДНК-связывающего домена и продуктами слияния белка BP 16 вируса простого герпеса (HSV). Дополнительные домены, которые могут образовывать часть слитого белка, содержащего фермент CRISPR, описаны в US 20110059502, включенном в данный документ при помощи ссылки. В некоторых вариантах осуществления меченный фермент CRISPR используют для идентификации расположения целевой последовательности.
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способы, включающие доставку одного или нескольких полинуклеотидов, как, например, или одного или нескольких векторов, которые описаны в данном документе, одного или нескольких их транскриптов и/или одного или нескольких белков, транскрибируемых с них, в клетку-хозяина. В некоторых аспектах настоящее изобретение дополнительно предусматривает клетки, полученные при помощи таких способов, и организмы (такие как животные, растения или грибы), содержащие такие клетки или полученные из них. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR в комбинации с (и необязательно образующий комплекс с) направляющей последовательностью доставляют в клетку. Традиционные способы переноса генов с использованием вирусов и без использования вирусов можно применять для введения нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих или целевые ткани. Такие способы можно использовать для введения нуклеиновых кислот, кодирующих компоненты системы CRISPR, в клетки в культуре и в организме-хозяине. Системы доставки на основе отличных от вирусных векторов включают ДНК-плазмиды РНК (к примеру, транскрипт вектора, описанного в данном документе), "оголенную" нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту, образующую комплекс со средством доставки, как, например, липосому. Системы доставки на основе вирусного вектора включают ДНК- и РНК-вирусы, которые имеют либо эписомальный, либо интегрированный геномы после доставки в клетку. В отношении обзора процедур генной терапии см. Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1): 31-44 (1995); Haddada et al., в Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and
Figure 00000025
(eds) (1995); и Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994).
Способы отличной от вирусной доставки нуклеиновых кислот включают липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, баллистическую трансфекцию, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, поликатион или конъюгаты липид: нуклеиновая кислота, "оголенную" ДНК, искусственные вирионы и повышенное при помощи средства поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патентах США №№5049386, 4946787 и 4897355), и реагенты для липофекции реализуются в промышленных масштабах (к примеру, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, которые подходят для эффективной липофекции полинуклеотидов с узнаванием рецептора, включают таковые из Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. Доставка может осуществляться в клетки (к примеру, in vitro или ex vivo введение) или целевые ткани (к примеру, in vivo введение).
Получение комплексов липид: нуклеиновая кислота, в том числе целенаправленно воздействующих липосом, как, например, иммунолилидных комплексов, хорошо известно специалистам в данной области (см., к примеру, Crystal, Science 270: 404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992); патенты США №№4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 и 4946787).
При применении систем на основе РНК- и ДНК-вирусов для доставки нуклеиновых кислот используют тщательно разработанные способы обеспечения целенаправленного воздействия вируса на конкретные клетки в организме и перемещения полезных последовательностей вируса в ядро. Вирусные векторы можно вводить непосредственно пациентам (in vivo) или их можно использовать для обработки клеток in vitro и модифицированные клетки можно необязательно вводить пациентам (ex vivo). Традиционные системы на основе вирусов могут включать ретровирусные, лентивирусные, аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса и вируса простого герпеса для переноса генов. Интеграция в геном хозяина возможна со способами переноса генов на основе ретровируса, лентивируса и аденоассоциированного вируса, что часто приводит к длительной экспрессии встроенного трансгена. Кроме того, высокие показатели эффективности трансдукции наблюдали у многих различных типов клеток и целевых тканей.
Тропизм ретровирусов может быть изменен путем включения чужеродных белков оболочки с расширением возможной целевой популяции целевых клеток. Лентивирусные векторы являются ретровирусными векторами, которые способны трансфицировать или инфицировать неделящиеся клетки и, как правило, дают высокие вирусные титры. Выбор системы переноса генов на основе ретровирусов, таким образом, будет зависеть от целевой ткани. Ретровирусные векторы состоят из действующих в цис-положении длинных концевых повторов с упаковывающей способностью до 6-10 п.о. чужеродной последовательности. Минимальных действующих в цис-положении LTR достаточно для репликации и упаковки векторов, которые затем используют для интеграции терапевтического гена в целевую клетку с получением постоянной экспрессии трансгена. Широко применяемые ретровирусные векторы включают такие, которые основаны на вирусе лейкоза мышей (MuLV), вирусе лейкоза гиббонов (GaLV), вирусе иммунодефицита обезьян (SIV), вирусе иммунодефицита человека (HTV) и их комбинациях (см., к примеру, Buchscher et al., J. Virol. 66: 2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
В применениях, в которых транзиентная экспрессия является предпочтительной, можно применять системы на основе аденовирусов. Векторы на основе аденовирусов способны проявлять очень высокую эффективность трансдукции во многих типах клеток и не требуют деления клеток. С такими векторами были получены высокие титры и уровни экспрессии. Такой вектор можно получать в больших количествах в относительно простой системе. Векторы на основе аденоассоциированного вируса ("AAV") также можно использовать для трансдукции клеток целевыми нуклеиновыми кислотами, к примеру, при получении in vitro нуклеиновых кислот и пептидов, и для процедур генной терапии in vivo и ex vivo (см., к примеру, West et al., Virology 160: 38-47 (1987); патент США №4797368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994). Создание рекомбинантных AAV-векторов описано в ряде публикаций, в том числе в патенте США №5173414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466-6470 (1984); и Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1989).
Упаковывающие клетки, как правило, используют для получения вирусных частиц, которые способны инфицировать клетку-хозяина. Такие клетки включают клетки 293, которые упаковывают аденовирус, и клетки ψ2 или клетки РАЗ 17, которые упаковывают ретровирус. Вирусные векторы, используемые в генной терапии, как правило, создают путем получения линии клеток, которые упаковывают вектор на основе нуклеиновой кислоты в вирусную частицу. Векторы обычно содержат минимальные вирусные последовательности, необходимые для упаковки и последующей интеграции в хозяина, при этом другие вирусные последовательности замещены кассетой экспрессии для экспрессии полинуклеотида(ов). Отсутствующие вирусные функции, как правило, обеспечивают во вспомогательном объекте при помощи линии упаковывающих клеток. Например, AAV-векторы, применяемые в генной терапии, как правило, имеют только ITR-последовательности из генома AAV, которые необходимы для упаковки и интеграции в геном хозяина. Вирусная ДНК упакована в линии клеток, которая содержит вспомогательную плазмиду, кодирующую другие гены AAV, а именно rep и cap, но без ITR-последовательностей. Линия клеток также может быть инфицирована аденовирусом в качестве вируса-помощника. Вирус-помощник способствует репликации AAV-вектора и экспрессии генов AAV из вспомогательной плазмиды. Вспомогательная плазмида не упакована в значительном количестве в связи с отсутствием ITR-последовательностей. Контаминация аденовирусом может быть снижена, к примеру, при помощи тепловой обработки, к которой аденовирус более чувствителен, чем AAV. Дополнительные способы доставки нуклеиновых кислот в клетки известны специалистам в данной области. См., например, US 20030087817, включенный в данный документ при помощи ссылки.
В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин транзиентно или не транзиентно трасфипирована одним или несколькими векторами, описанными в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка трансфицирована так, как это в естественных условиях происходит у субъекта. В некоторых вариантах осуществления клетка, которую трансфицируют, взята от субъекта. В некоторых вариантах осуществления клетка получена из клеток, взятых от субъекта, как, например, линия клеток. Широкий спектр линий клеток для культуры тканей известен из уровня техники. Примеры линий клеток включают, без ограничения, С8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, эпителиальные клетки почки обезьяны BS-C-1, эмбриональные фибробласты мыши BALB/ 3T3, 3T3 Swiss, 3T3-L1, фетальные фибробласты человека 132-d5; фибробласты мыши 10.1, 293-Т, 3Т3, 721, 9L, А2780, A2780ADR, A2780cis, А172, А20, А253, А431, А-549, ALC, В16, В35, клетки ВСР-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10Т1/2, С6/36, Cal-27, СНО, СНО-7, CHO-IR, СНО-K1, СНО-K2, СНО-Т, СНО Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, СМТ, СТ26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, ЕМ2, ЕМ3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, Н1299, Н69, НВ54, НВ55, НСА2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, НМЕС, НТ-29, Jurkat, клетки JY, клетки K562, Ku812, KCL22, KG1, KY01, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, линии клеток OPCN/OPCT, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, клетки Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, линию клеток THP1, U373, U87, U937, VCaP, клетки Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR и их трансгенные варианты. Линии клеток доступны из ряда источников, известных специалистам в данной области (см., к примеру, Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) (Манассас, Вирджиния)). В некоторых вариантах осуществления клетку, трансфицированную одним или несколькими векторами, описанными в данном документе, используют для получения новой линии клеток, содержащей одну или несколько полученных из вектора последовательностей. В некоторых вариантах осуществления клетку, транзиентно трансфицированную компонентами системы CRISPR, которая описана в данном документе (как, например, путем транзиентной трансфекции одним или несколькими векторами или трансфекции РНК), и модифицированную при помощи активности комплекса CRISPR, используют для получения новой линии клеток, содержащей клетки, которые содержат модификацию, но у которых отсутствует любая другая экзогенная последовательность. В некоторых вариантах осуществления клетки, транзиентно или не транзиентно трансфицированные одним или несколькими векторами, описанными в данном документе, или линии клеток, полученные из таких клеток, использовали при оценивании одного или нескольких тестовых соединений.
В некоторых вариантах осуществления один или несколько векторов, описанных в данном документе, используют для получения отличного от человека трансгенного животного или трансгенного растения. В некоторых вариантах осуществления трансгенным животным является млекопитающее, как, например, мышь, крыса или кролик. В определенных вариантах осуществления организмом или субъектом является растение. В определенных вариантах осуществления организмом, или субъектом, или растением является водоросль. Способы получения трансгенных растений и животных известны в уровне техники и, как правило, начинаются со способа трансфекции клетки, такого как описанный в данном документе. Также представлены трансгенные животные, как и трансгенные растения, в частности, сельскохозяйственные культуры и водоросли. Трансгенное животное или растение могут быть полезными в других путях применения, помимо обеспечения модели заболевания. Они могут включать производство пищи или кормопроизводство посредством биосинтеза, например, белков, углеводов, питательных веществ или витаминов на более высоких уровнях, чем будет наблюдаться в обычных условиях у дикого типа. В этом отношении предпочтительными являются трансгенные растения, в особенности зернобобовые и клубнеплоды, и животные, в особенности млекопитающие, такие как крупный рогатый скот (коровы, овцы, козы и свиньи), но также домашняя птица и съедобные насекомые.
Трансгенные водоросли или другие растения, такие как рапс, могут быть особенно применимыми в производстве растительных масел или таких видов биотоплива, как, например, спирты (особенно метанол и этанол). Они могут быть сконструированы для синтеза или сверхсинтеза масла или спиртов на высоких уровнях для применения в масложировой или биотопливной промышленности.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы модификации целевого полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с целевым полинуклеотидом для осуществления расщепления указанного целевого полинуклеотида с модификацией, таким образом, целевого полинуклеотида, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ модификации экспрессии полинуклеотида в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение связывания комплекса CRISPR с полинуклеотидом так, что указанное связывание приводит к повышенной или пониженной экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, гибридизирующейся с целевой последовательностью в указанном целевом полинуклеотиде, где указанная направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью.
С учетом недавних достижений в области геномики сельскохозяйственных культур возможность применения системы CRISPR-Cas для осуществления эффективных и экономичных редактирования генов и манипуляции с ними обеспечит возможность быстрого отбора и сравнения одиночных и мультиплексных генетических манипуляций для трансформирования таких геномов в отношении повышенного производства и улучшенных признаков. В связи с этим делается ссылка на патенты США и публикации патентов США: патент США №6603061 - опосредованный агробактериями способ трансформации растений (Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method); патент США №7868149 - последовательности генома растений и их применение (Plant Genome Sequences and Uses Thereof) и US 2009/0100536 - трансгенные растения с улучшенными агротехническими признаками (Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits), все содержания и раскрытия каждого из которых включены в данный документ при помощи ссылки в полном объеме. При осуществлении на практике настоящего изобретения содержание и раскрытие Morrell et al "Crop genomics:advances and applications" Nat Rev Genet. 2011 Dec 29;13(2): 85-96 также включены в данный документ при помощи ссылки в полном объеме. В преимущественном варианте осуществления настоящего изобретения систему CRISPR/Cas9 используют для конструирования микроводорослей (пример 14). Соответственно, в данном документе ссылка на клетки животных также может быть применима, с учетом необходимых изменений, по отношению к клеткам растений, если явно не следует иное.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы модификации целевого полинуклеотида в эукариотической клетке, что может происходить in vivo, ex vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления способ включает забор клетки или популяции клеток от человека, или отличного от человека животного, или растения (в том числе микроскопических водорослей) и модификацию клетки или клеток. Культивирование можно осуществлять на любой стадии ex vivo. Клетку или клетки можно даже повторно вводить отличному от человека животному или в растение (в том числе микроскопические водоросли).
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает наборы, содержащие любой один или несколько из элементов, раскрытых в приведенных выше способах и композициях. В некоторых вариантах осуществления набор содержит векторную систему и инструкции по применению набора. В некоторых вариантах осуществления векторная система содержит (а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с парной tracr-последовательностью и одним или несколькими сайтами встраивания для встраивания направляющей последовательности выше парной tracr-последовательности, где при экспрессии направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью в эукариотической клетке, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью; и/или (b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей указанный фермент CRISPR, содержащий последовательность ядерной локализации. Элементы могут быть предоставлены отдельно или в комбинациях и могут быть предоставлены в любом подходящем контейнере, как, например, пузырьке, флаконе или пробирке. В некоторых вариантах осуществления набор включает инструкции на одном или нескольких языках, например, на более чем одном языке.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько реагентов для применения в способе, в котором используется один или несколько элементов, описанных в данном документе. Реагенты могут быть предоставлены в любом подходящем контейнере. Например, набор может предусматривать один или несколько реакционных буферов или буферов для хранения. Реагенты могут быть предоставлены в форме, которая применима в конкретном анализе, или в форме, которая предусматривает добавление одного или нескольких других компонентов перед применением (к примеру, в форме концентрата или лиофилизированной форме). Буфер может быть любым буфером, в том числе без ограничения буфером с карбонатом натрия, буфером с бикарбонатом натрия, боратным буфером, Tris-буфером, буфером MOPS, буфером HEPES и их комбинациями. В некоторых вариантах осуществления буфер является щелочным. В некоторых вариантах осуществления буфер имеет значение рН от приблизительно 7 до приблизительно 10. В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько олигонуклеотидов, соответствующих направляющей последовательности, для встраивания в вектор для того, чтобы имела место функциональная связь направляющей последовательности и регуляторного элемента. В некоторых вариантах осуществления набор содержит матричный полинуклеотид для гомологичной рекомбинации.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы применения одного или нескольких элементов системы CRISPR. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению обеспечивает эффективное средство модификации целевого полинуклеотида. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению характеризуется большим разнообразием полезных свойств, включая модификацию (например, делению, вставку, транслокацию, инактавацию, активацию) целевого полинуклеотида во множестве типов клеток. Комплекс CRISPR по настоящему изобретению как таковой имеет широкий спектр применений, к примеру, в генной терапии, скрининге лекарственных средств, диагностике и прогнозировании заболеваний. Иллюстративный комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с направляющей последовательностью, которая гибридизируется с целевой последовательностью в целевом полинуклеотиде. Направляющая последовательность связана с парной tracr-последовательностью, которая, в свою очередь, гибридизируется с tracr-последовательностью.
Целевым полинуклеотидом комплекса CRISPR может быть любой полинуклеотид, эндогенный или экзогенный по отношению к эукариотической клетке. Например, целевой полинуклеотид может быть полинуклеотидом, находящимся в ядре эукариотической клетки. Целевой полинуклеотид может быть последовательностью, кодирующей продукт гена (к примеру, белок), или некодирующей последовательностью (к примеру, регуляторным полинуклеотидом или избыточной ДНК). Не желая быть связанными теорией, полагают, что целевая последовательность должна быть ассоциирована с РАМ (мотивом, смежным с протоспейсером); то есть короткой последовательностью, узнаваемой комплексом CRISPR. Определенные требования в отношении последовательности и длины РАМ различаются в зависимости от применяемого фермента CRISPR, но РАМ, как правило, является последовательностью в 2-5 пар оснований, смежной с протоспейсером (то есть целевой последовательности). Примеры последовательностей РАМ приведены в разделе "Примеры" ниже, и специалист в данной области сможет выявить дополнительные последовательности РАМ для применения с данным ферментом CRISPR.
Целевой полинуклеотид комплекса CRISPR может включать некоторое количество ассоциированных с заболеваниями генов и полинуклеотидов, а также ассоциированных с биохимическими путями проведения сигнала генов и полинуклеотидов, которые перечислены в предварительных заявках на патент США 61/736527 и 61/748427 с общей ссылкой BI-2011/008/WSGR, номер в реестре 44063-701.101, и BI-2011/008/WSGR, номер в реестре 44063-701.102, соответственно, обе озаглавленные "СИСТЕМЫ, СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МАНИПУЛЯЦИЯ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ" (SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION), поданные 12 декабря 2012 г. и 2 января 2013 г., соответственно, содержания всех из которых включены в данный документ при помощи ссылки в полном объеме.
Примеры целевых полинуклеотидов включают последовательность, ассоциированную с биохимическими путями передачи сигнала, к примеру, ген или полинуклеотид, ассоциированные с биохимическими путями передачи сигнала. Примеры целевых полинуклеотидов включают ассоциированный с заболеванием ген или полинуклеотид. "Ассоциированный с заболеванием" ген или полинуклеотид означает любой ген или полинуклеотид, который обеспечивает продукты транскрипции или трансляции на отклоняющемся от нормы уровне или в отклоняющейся от нормы форме в клетках, полученных из пораженных заболеванием тканей, по сравнению с тканями или клетками контроля без заболевания. Это может быть ген, который начинает экспрессироваться при ненормально высоком уровне; это может быть ген, который начинает экспрессироваться при ненормально низком уровне, где измененная экспрессия коррелирует с появлением и/или развитием заболевания. Ассоциированный с заболеванием ген также означает ген, несущий мутацию(и) или генетическое изменение, который непосредственно ответственен или находится в неравновесном сцеплении с геном(ами), который(е) ответственен(ны) за этиологию заболевания. Транскрибируемые или транслируемые продукты могут быть известными или неизвестными и могут быть на нормальном уровне или на отклоняющемся от нормального уровне.
Примеры ассоциированных с заболеваниями генов и полинуклеотидов доступны от Института генетической медицины Маккьюсика-Натанса (McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine) при Университете Джонса Хопкинса (Johns Hopkins University) (Балтимор, Мэриленд) и Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information) при Национальной библиотеке медицины (National Library of Medicine) (Бетесда, Мэриленд), доступных во всемирной сети Интернет.
Примеры ассоциированных с заболеваниями генов и полинуклеотидов перечислены в таблицах А и В. Конкретная информация в отношении заболеваний доступна от Института генетической медицины Маккьюсика-Натанса (McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine) при Университете Джонса Хопкинса (Johns Hopkins University) (Балтимор, Мэриленд) и Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information), Национальной библиотеки медицины (National Library of Medicine) (Бетесда, Мэриленд), доступных во всемирной сети Интернет. Примеры ассоциированных с биохимическими путями передачи сигнала генов и полинуклеотидов перечислены в таблице С.
Мутации в этих генах и путях могут приводить к продуцированию несоответствующих белков или белков в несоответствующих количествах, которые воздействуют на функцию. Дополнительные примеры генов, заболеваний и белков, таким образом, включены при помощи ссылки из предварительных заявок на патент США 61/736527 и 61/748427. Такие гены, белки и пути могут быть целевым полинуклеотидом комплекса CRISPR.
Figure 00000026
Figure 00000027
Figure 00000028
Figure 00000029
Figure 00000030
Figure 00000031
Figure 00000032
Figure 00000033
Figure 00000034
Figure 00000035
Figure 00000036
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
Figure 00000043
Варианты осуществления настоящего изобретения также относятся к способам и композициям, связанным с нокаутированием генов, амплифицированием генов и репарацией конкретных мутаций, ассоциированных с нестабильностью ДНК-повторов и неврологическими нарушениями (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Second Edition, Academic Press, Oct 13, 2011 - Medical). Как было обнаружено, определенные аспекты последовательностей тандемных повторов ответственны за более двадцати заболеваний человека (New insights into repeat instability: role of RNA•DNA hybrids. Mclvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. 2010 Sep-Oct; 7(5): 551-8). Система CRISPR-Cas может быть приспособлена для корректировки таких дефектов геномной нестабильности.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к использованию системы CRISPR-Cas для корректирования дефектов в генах ЕМР2А и ЕМР2 В, которые, как было обнаружено, ассоциированы с болезнью Лафора. Болезнь Лафора представляет собой аутосомно-рецессивное состояние, которое характеризуется прогрессирующей миоклонус-эпилепсией, которая может начинаться как эпелиптический приступ в подростковом возрасте. Некоторые случаи заболевания могут вызываться мутациями в генах, которые уже были выявлены. Заболевание вызывает приступы, мышечные спазмы, затрудненную ходьбу, слабоумие и, в конечном итоге, смерть. В настоящее время не существует терапии, которая показала эффективность против развития заболевания. На другие генетические расстройства, ассоциированные с эпилепсией, также можно целенаправленно воздействовать при помощи системы CRISPR-Cas, и лежащая в основе генетика дополнительно описана в Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, edited by Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology: 20; 2009).
В еще одном аспекте настоящего изобретения систему CRISPR-Cas можно использовать для корректировки офтальмологических дефектов, которые являются результатом нескольких генетических мутаций, дополнительно описанных в Genetic Diseases of the Eye, Second Edition, edited by Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012.
Некоторые дополнительные аспекты настоящего изобретения связаны с корректированием дефектов, ассоциированных с широким спектром генетических заболеваний, которые дополнительно описаны на веб-сайте Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health) в тематическом подразделе "Наследственные заболевания" ("Genetic Disorders"). Наследственные заболевания головного мозга могут включать без ограничения адренолейкодистрофию, агенезию мозолистого тела, синдром Айкарди, синдром Альперса, болезнь Альцгеймера, синдром Барта, болезнь Баттена, CADASIL, мозжечковую дегенерацию, болезнь Фабри, синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, болезнь Гентингтона и другие связанные с триплетным повтором нарушения, болезнь Лея, синдром Леша-Найхана, болезнь Менкеса, типы митохондриальной миопатии и кольпоцефалию по критериям NTNDS. Такие заболевания дополнительно описаны на веб-сайте Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health) в тематическом подразделе "Наследственные заболевания головного мозга" ("Genetic Brain Disorders").
В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть неоплазия. В некоторых вариантах осуществления, где состоянием является неоплазия, гены, на которые целенаправленно воздействуют, являются любыми из перечисленных в таблице А (в данном случае PTEN и так далее). В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть возрастная дегенерация желтого пятна. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть шизофреническое нарушение. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть связанное с тринуклеотидным повтором нарушение. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть синдром ломкой Х-хромосомы. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть связанное с активностью секретазы нарушение. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть связанное с прионами нарушение. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть ALS. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть привыкание к наркотическим средствам. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть аутизм. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть болезнь Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть воспаление. В некоторых вариантах осуществления состоянием может быть болезнь Паркинсона.
Примеры белков, ассоциированных с болезнью Паркинсона, включают без ограничения α-синуклеин, DJ-1, LRRK2, PINK1, паркин, UCHL1, синфилин-1 и NURR1.
Примеры связанных с привыканием белков могут включать, например, АВАТ.
Примеры связанных с воспалением белков могут включать, например, моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (monocyte chemoattractant protein-1) (МСР1), кодируемый геном Ccr2, С-С рецептор хемокина 5 типа (С-С chemokine receptor type 5) (CCR5), кодируемый геном Ccr5, IgG-рецептор IIB (IgG receptor IIB) (FCGR2b, также называемый CD32), кодируемый геном Fcgr2b, или белок Fc-эпсилон-R1g (Fc epsilon R1g) (FCER1g), кодируемый геном Fcer1g.
Примеры ассоциированных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы белков могут включать, например, IL1B (интерлейкин 1, бета (interleukin 1, beta)), XDH (ксантиндегидрогеназу (xanthine dehydrogenase)), TP53 (опухолевый белок р53 (tumor protein р53)), PTGIS (простагландин-I2(простациклин)-синтазу (prostaglandin I2 (prostacyclin) synthase)), MB (миоглобин (myoglobin)), IL4 (интерлейкин 4 (interleukin 4)), ANGPT1 (ангиопоэтин 1 (angiopoietin 1)), ABCG8 (АТФ-связывающую кассету, подсемейство G (WHITE), представитель 8 (ATP-binding cassette, sub-family G (WHITE), member 8)) или CTSK (катепсин K (cathepsin K)).
Примеры ассоциированных с болезнью Альцгеймера белков могут включать, например, белок, представляющий собой рецептор липопротеинов очень низкой плотности (very low density lipoprotein receptor protein) (VLDLR), кодируемый геном VLDLR, убиквитин-подобный модификатор-активирующий фермент 1 (ubiquitin-like modifier activating enzyme 1) (UBA1), кодируемый геном UBA1, или белок, являющийся каталитической субъединицей NEDD8-aKTHBHpyioniero фермента E1 (NEDD8-activating enzyme E1 catalytic subunit protein) (UBE1C), кодируемый геном UBA3.
Примеры белков, ассоциированных с расстройствами аутистического спектра, могут включать, например, белок 1, ассоциированный с периферическим бензодиазепиновым рецептором (benzodiazapine receptor (peripheral) associated protein 1) (BZRAP1), кодируемый геном BZRAP1, белок, представитель 2 семейства AF4/FMR2 (AF4/FMR2 family member 2 protein) (AFF2), кодируемый геном AFF2 (также называемый MFR2), белок-аутосомный гомолог 1, ассоциированный с умственной отсталостью, связанной с ломкой Х-хромосомой (fragile X mental retardation autosomal homolog 1 protein) (FXR1), кодируемый геном FXR1, или белок-аутосомный гомлог 2, ассоциированный с умственной отсталостью, связанной с ломкой Х-хромосомой (fragile X mental retardation autosomal homolog 2 protein) (FXR2), кодируемый геном FXR2.
Примеры белков, ассоциированных с дегенерацией желтого пятна, могут включать, например, АТФ-связываюшую кассету, белок-представитель 4 подсемейства А (АВС1) (ATP-binding cassette, sub-family А (АВС1) member 4 protein) (ABCA4), кодируемый геном ABCR, белок-аполипротеин E (apolipoprotein E protein) (APOE), кодируемый геном APOE, или белок-лиганд 2 хемокина (С-С мотив) (chemokine (С-С motif) Ligand 2 protein) (CCL2), кодируемый геном CCL2.
Примеры белков, ассоциированных с шизофренией, могут включать NRG1, ErbB4, CPLX1, ТРН1, ТРН2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISCI, GSK3B и их комбинации.
Примеры белков, вовлеченных в подавление опухоли, могут включать, например, ATM (мутированный, атаксия-телеангиэктазия (ataxia telangiectasia mutated)), ATR (атаксия-телеангиэктазия- и Rad3-родственный (ataxia telangiectasia and Rad3 related)), EGFR (рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor)), ERBB2 (гомолог 2 v-erb-b2 эритробластического лейкоза вирусного онкогена (v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2)), ERBB3 (гомолог 3 v-erb-b2 эритробластического лейкоза вирусного онкогена (v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3)), ERBB4 (гомолог 4 v-erb-b2 эритробластического лейкоза вирусного онкогена (v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4)), Notch 1, Notch 2, Notch 3 или Notch 4.
Примеры белков, ассоциированных с нарушением, связанным с активностью секретазы, могут включать, например, PSENEN (presenilin enhancer 2 homolog (С. elegans)), CTSB (катепсин В (cathepsin В)), PSEN1 (пресенилин 1 (presenilin 1)), APP (белок-предшественник бета-амилоида (A4) (amyloid beta (A4) precursor protein)), APH1B (anterior pharynx defective 1 homolog В (С.elegans)), PSEN2 (пресенилин 2 (болезнь Альцгеймера 4) (presenilin 2 (Alzheimer disease 4)) или BACE1 (АРР-расщепляющий фермент 1 по бета-сайту (beta-site APP-cleaving enzyme 1)).
Примеры белков, ассоциированных с амиотрофическим латеральным склерозом, могут включать, например, SOD1 (супероксиддисмутазу 1 (superoxide dismutase 1)), ALS2 (белок, ассоциированный с амиотрофическим латеральным склерозом 2 (amyotrophic lateral sclerosis 2)), FUS (РНК-связывающий белок FUS (fused in sarcoma)), TARDBP (TAR-ДНК связывающий белок (TAR DNA binding protein)), VAGFA (фактор роста эндотелия сосудов A (vascular endothelial growth factor A)), VAGFB (фактор роста эндотелия сосудов В (vascular endothelial growth factor В)) и VAGFC (фактор роста эндотелия сосудов С (vascular endothelial growth factor С)) и любую их комбинацию.
Примеры белков, ассоциированных с прионными болезнями, могут включать SOD1 (супероксиддисмутазу 1), ALS2 (белок, ассоциированный с амиотрофическим латеральным склерозом 2 (amyotrophic lateral sclerosis 2)), FUS (РНК-связывающий белок FUS (fused in sarcoma)), TARDBP (TAR-ДНК связывающий белок (TAR DNA binding protein)), VAGFA (фактор роста эндотелия сосудов A (vascular endothelial growth factor A)), VAGFB (фактор роста эндотелия сосудов В (vascular endothelial growth factor В)) и VAGFC (фактор роста эндотелия сосудов С (vascular endothelial growth factor С)) и любую их комбинацию.
Примеры белков, связанных с нейродегенеративными состояниями при прионных болезнях, могут включать, например, А2М (альфа-2-макроглобулин (Alpha-2-Macroglobulin)), AATF (фактор транскрипции, противодействующий апоптозу (Apoptosis antagonizing transcription factor)), ACPP (простатоспецифическую кислую фосфатазу (Acid phosphatase prostate)), ACTA2 (альфа-актин 2 гладкой мускулатуры аорты (Actin alpha 2 smooth muscle aorta)), ADAM22 (ADAM, металлопептидазный домен (ADAM metallopeptidase domain)), ADORA3 (аденозиновыи рецептор A3 типа (Adenosine A3 receptor)) или ADRA1D (альфа-1D адренергический рецептор для альфа-1D адренорецептора (Alpha-1D adrenergic receptor for Alpha-1D adrenoreceptor)).
Примеры белков, ассоциированных с иммунодефицитом, могут включать, например, А2М [альфа-2-макроглобулин (alpha-2-macroglobulin)]; AANAT [арилалкиламин-N-ацетилтрансферазу (arylalkylamine N-acetyltransferase)]; АВСА1 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 1 (ATP-binding cassette, sub-family А (АВС1), member 1)]; ABCA2 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 2 (ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 2)] или АВСАЗ [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 3 (ATP-binding cassette, sub-family А (АВС1), member 3)].
Примеры белков, ассоциированных с нарушениями, связанными с тринуклеотидным повтором, включают, например, AR (андрогеновый рецептор (androgen receptor)), FMR1 (белок 1, ассоциированный с умственной отсталостью, связанной с ломкой Х-хромосомой (fragile X mental retardation 1)), НТТ (хантигтин (huntmgtin)) или DMPK (протеинкиназу, ассоциированную с мышечной дистрофией (dystrophia myotonica-protein kinase)), FXN (фратаксин (frataxin)), ATXN2 (атаксин 2 (ataxin 2)).
Примеры белков, ассоциированных с нарушениями передачи нервных импульсов включают, например, SST (соматостатин (somatostatin)), NOS1 (синтазу оксида азота 1 (нейрональную) (nitric oxide synthase 1 (neuronal)), ADRA2A (адренергический, альфа-2А-, рецептор (adrenergic, alpha-2A-, receptor)), ADRA2C (адренергический, альфа-2С-, рецептор (adrenergic, alpha-2C-, receptor)), TACR1 (тахикининовый рецептор 1 (tachykinin receptor 1)) или HTR2c (5-гадрокситриптаминовый (серотониновый) рецептор 2С (5- hydroxytryptamine (serotonin) receptor 2C)).
Примеры последовательностей, ассоциированных с неврологическим развитием, включают, например, А2 ВР1 [атаксин 2-связывающий белок 1 (ataxin 2-binding protein 1)], AADAT [аминоадипатаминотрансферазу (aminoadipate aminotransferase)], AANAT [арилалкиламин-Н-ацетилтрансферазу (arylalkylamine N-acetyltransferase)], ABAT [4- аминобутиратаминтрансферазу (4-aminobutyrate aminotransferase)], ABCA1 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство A (ABC1), представитель 1 (ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1)] или ABCA13 [АТФ-связывающую кассету, подсемейство А (АВС1), представитель 13 (ATP-binding cassette, sub-family А (АВС1), member 13)].
Дополнительные примеры предпочтительных состояний, которые подлежат лечению с помощью данной системы, включают те, которые могут быть выбраны из синдрома Айкарди-Гутьереса; болезни Александера; синдрома Аллана-Херндона-Дадли; связанных с геном POLG нарушений; альфа-маннозидоза (II и III тип); синдрома Альстрема; синдрома Ангельмана; атаксии-телеангиэктазии; нейронного высоковидного липофусциноза; бета-талассемии; двусторонней атрофии зрительного нерва и (инфантильной) атрофии зрительного нерва 1 типа; ретинобластомы (двусторонней); болезни Канавана; церебро-окуло-фацио-скелетного синдрома 1 [COFS1]; церебротендинального ксантоматоза; синдрома Корнелии де Ланге; связанных с геном МАРТ нарушений; наследственных прионных болезней; синдрома Драве; семейной болезни Альцгеймера с ранним началом; атаксии Фридрейха [FRDA]; синдрома Фринса; фукозидоза; врожденной мышечной дистрофии Фукуямы; галактосиалидоза; болезни Гоше; органической ацидемии; гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза; синдрома прогерии Гетчинсона-Гилфорда; муколипидоза II; инфантильной болезни накопления свободной сиаловой кислоты; ассоциированной с геном PLA2G6 нейродегенерации; синдрома Джервелла-Ланге-Нильсена; узелкового врожденного буллезного эпидермолиза; болезни Гентингтона; болезни Краббе (инфантильной); ассоциированного с митохондриальной ДНК синдрома Ли и NARP; синдрома Леша-Найхана; ассоциированной с геном LIS1 лиссэнцефалии; синдрома Лоу; болезни "кленового сиропа"; синдрома дупликации МЕСР2; связанных с геном АТР7А нарушений обмена меди; связанной с геном LAMA2 мышечной дистрофии; недостаточности арилсульфатазы А; мукополисахаридоза I, II или III типов; связанных с биогенезом пероксисом нарушений, спектра заболеваний по типу синдрома Цельвегера; нарушений по типу нейродегенерации с накоплением железа в головном мозге; недостаточности кислой сфингомиелиназы; болезни Ниманна-Пика С типа; глициновой энцефалопатии; связанных с геном ARX нарушений; нарушений орнитинового цикла; связанного с геном COL1A1/2 несовершенного остеогенеза; синдромов удаления митохондриальной ДНК; связанных с геном PLP1 нарушений; синдрома Перри; синдрома Фелана-МакДермида; болезни накопления гликогена II типа (болезни Помпе) (инфантильной); связанных с геном МАРТ нарушений; связанных с геном МЕСР2 нарушений; эпифизарной точечной хондродисплазии 1 типа костей верхних конечностей или бедренной кости; синдрома Робертса; болезни Сандхоффа; болезни Шиндлера - 1 типа; аденозиндезаминазной недостаточности; синдрома Смита-Лемли-Опитца; спинальной мышечной атрофии; спинально-церебеллярной атаксии с возникновением в младенческом возрасте; недостаточности гексозаминидазы А; танатофорной дисплазии 1 типа; связанных с геном коллагена VI типа нарушений; синдрома Ашера I типа; врожденной мышечной дистрофии; синдрома Вольфа-Хиршхорна; недостаточности лизосомной кислой липазы и пигментной ксеродермы.
Длительное введение белковых терапевтических средств может вызвать нежелательные иммунные ответы на данный белок. Иммуногенность белковых лекарственных средств может объясняться наличием нескольких иммунодоминантных эпитопов для Т-лимфоцитов-хелперов (HTL). Путем снижения аффинности связывания этих эпитопов для HTL, содержащихся в данных белках, с МНС можно создавать лекарственные средства с более низкой иммуногенностью (Tangri S, et al. ("Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity" J Immunol. 2005 Mar 15; 174(6): 3187-96.) В настоящем изобретении иммуногенность фермента CRISPR, в частности, можно снизить, следуя подходу, впервые изложенному Tangri и соавт. в отношении эритропоэтина и впоследствии получившему развитие. Соответственно, для снижения иммуногенности фермента CRISPR (например, Cas9) у вида-хозяина (человека или другого вида) можно применять направленную эволюцию или рациональное проектирование.
У растений патогены часто являются специфичными по отношению к хозяину. Например, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici вызывает фузариозный вилт томата, но поражает только томат, a F. oxysporum f. dianthii и Puccinia graminis f. sp.tritici поражают только пшеницу. Растения обладают присущими и индуцированньгми защитными реакциями, обеспечивающими устойчивость к большинству патогенов. Мутации и события рекомбинации в поколениях растений приводят к генетической изменчивости, которая обуславливает восприимчивость, тем более, что патогены размножаются с большей частотой, чем растения. У растений может наблюдаться устойчивость видов - нехозяев, например, хозяин и патоген являются несовместимыми. Также может наблюдаться горизонтальная устойчивость, например, частичная устойчивость ко всем расам патогена, обычно контролируемая многими генами, и вертикальная устойчивость, например, полная устойчивость к некоторым расам патогена, но не к другим расам, обычно контролируемая несколькими генами. На уровне взаимодействия генов растения и патогены эволюционируют совместно, а генетические изменения одного уравновешивают изменения другого. Соответственно, используя естественную изменчивость, селекционеры комбинируют наиболее полезные гены для урожайности, качества, однородности, выносливости, устойчивости. Источники генов устойчивости включают нативные или чужеродные сорта, старинные сорта, родственные дикорастущие растения и индуцированные мутации, например, при обработке растительного материала мутагенными средствами. Применяя настоящее изобретение, селекционеры растений получают новый инструмент для индукции мутаций. Соответственно, специалист в данной области может проанализировать геном источников генов устойчивости, а в отношении сортов, имеющих желаемые характеристики или признаки, использовать настоящее изобретение для индукции появления генов устойчивости с большей точностью, чем в случае применявшихся ранее мутагенных средств, и, следовательно, ускорять и улучшать программы селекции растений.
Как будет понятно, предусматривается, что настоящую систему можно использовать для целенаправленного воздействия на любую представляющую интерес полинуклеотидную последовательность. Некоторые состояния или заболевания, которые можно эффективно лечить с использованием настоящей системы, включены в таблицы выше, и примеры известных на данный момент генов, ассоциированных с такими состояниями, также предоставлены в них. Тем не менее, гены, приведенные в качестве примеров, не являются исчерпывающими.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом. Данные примеры совместно со способами, описанными в данном документе, в настоящее время отражают предпочтительные варианты осуществления, являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Изменения в данном документе и другие применения, которые охватываются сутью настоящего изобретения, как определено объемом формулы изобретения, будут очевидны специалистам в данной области.
Пример 1: Активность комплекса CRISPR в ядре эукариотической клетки
Примером системы CRISPR II типа является локус CRISPR II типа из Streptococcus pyogenes SF370, который содержит кластер из 4 генов Cas9, Cas1, Cas2 и Csn1, а также два некодирующих элемента РНК, tracrRNA и характерный массив повторяющихся последовательностей (прямых повторов), чередующихся с короткими фрагментами неповторяющихся последовательностей (спейсерами, примерно 30 п.о. каждый). В этой системе двухцепочечный разрыв (DSB) целевой ДНК образовывается в ходе четырех последовательных стадий (фигура 2А). Во-первых, две некодирующие РНК, массив pre-crRNA и tracrRNA транскрибируются с локуса CRISPR. Во-вторых, tracrRNA гибридизируется с прямыми повторами pre-crRNA, которая затем процессируется в зрелые crRNA, содержащие индивидуальные спейсерные последовательности. В-третьих, комплекс зрелая crRNA: tracrRNA направляет Cas9 к ДНК-мишени, состоящей из протоспейсера и соответствующего РАМ, посредством образования гетеродуплекса между спейсерным участком crRNA и протоспейсерной ДНК. И наконец, Cas9 опосредует расщепление целевой ДНК выше РАМ с образованием DSB внутри протоспейсера (фигура 2А). В данном примере описывается иллюстративный способ для приспособления этой РНК-программируемой нуклеазной системы к управлению активностью комплекса CRISPR в ядрах эукариотических клеток.
Для улучшения экспрессии компонентов CRISPR в клетках млекопитающих два гена из локуса 1 SF370 Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) были кодон-оптимизированы, Cas9 (SpCas9) и РНКаза III (SpRNase III). Для обеспечения ядерной локализации клеточный сигнал ядерной локализации (NLS) включали в амино(N-) или карбоксильные(С-) терминальные области и SpCas9, и SpRNase III (Фигура 2В). Для обеспечения визуализации экспрессии белков ген флуоресцентного белка в качестве маркера также включали в N- или С-терминальные области обоих белков (фигура 2В). Также был создан вариант SpCas9 с NLS, прикрепленным и к N-, и к С-терминальным областям (2xNLS-SpCas9). Конструкции, содержащие слитый с NLS SpCas9 и SpRNase III трансфицировали в клетки почки эмбриона человека (HEK) 293FT, и было обнаружено, что относительное положение NLS относительно SpCas9 и SpRNase III влияет на их эффективность ядерной локализации. Хотя С-терминального NLS было достаточно для нацеливания SpRNase III в ядро, прикрепление одной копии этих конкретных NLS либо к N-, либо к C-терминальной области SpCas9 не было способно обеспечить адекватную ядерную локализацию в этой системе. В этом примере C-терминальный NLS был из нуклеоплазмина (KRPAATKKAGQAKKKK), а C-терминальный NLS был из большого Т-антигена SV40 (PKKKRKV). Из тестируемых вариантов SpCas9 только 2xNLS-SpCas9 проявлял ядерную локализацию (фигура 2 В).
tracrRNA из локуса CRISPR S. pyogenes SF370 содержал два сайта инициации транскрипции, дающие начало двум транскриптам из 89 нуклеотидов (нт) и 171 нт, которые затем подвергались процессингу в идентичные зрелые tracrRNA из 75 нт. Более короткие tracrRNA из 89 нт отбирали на предмет экспрессии в клетках млекопитающих (экспрессирующая конструкция изображена на фигуре 6, с функциональностью, как определено по результатам анализа с помощью Surveryor, показанным на фигуре 6В). Сайты инициации транскрипции обозначены как +1, а также указаны терминатор транскрипции и последовательность, гибридизирующаяся с зондом при нозерн-блоттинге. Экспрессию подвергнутой процессингу tracrRNA также подтверждали с помощью нозерн-блоттинга. На фигуре 7С показаны результаты анализа с помощью нозерн-блоттинга общей РНК, экстрагированной из клеток 293FT, трансфицированных экспрессирующими конструкциями U6, несущими длинную или короткую tracrRNA, а также SpCas9 и DR-EMX1(1)-DR. Левая и правая секции получены с клетками 293FT, трансфицированными без или с SpRNase III, соответственно. U6 являются показателем для контроля загрузки при блоттинге с зондом, нацеленным на малую ядерную РНК (snRNA) U6 человека. Трансфекция экспрессирующей конструкции с короткой tracrRNA приводит к избыточным уровням подвергшейся процессингу формы tracrRNA (~75 п.о.). Очень низкие количества длинных tracrRNA обнаруживали при нозерн-блоттинге.
Для стимуляции точной инициации транскрипции промотор U6 на основе РНК-полимеразы III выбирали для управления экспрессией tracrRNA (фигура 2С). Подобным образом, конструкцию на основе промотора U6 разрабатывали для экспрессии массива pre-crRNA, состоящего из одного спейсера, фланкированного двумя прямыми повторами (DR, также включены в выражение "парные tracr-последовательности"; фигура 2С). Исходный спейсер был разработан для целенаправленного воздействия на целевой сайт из 33 пар оснований (п.о.) (протоспейсер из 30 п.о., а также последовательность мотива CRISPR (РАМ) из 3 п.о., соответствующая мотиву узнавания NGG у Cas9) в локусе ЕМХ1 человека (фигура 2С), ключевом гене в развитии коры головного мозга.
Клетки НЕК 293FT трансфицировали комбинациями компонентов CRISPR для того, чтобы определить, возможно ли при гетерологичной экспрессии системы CRISPR (SpCas9, SpRNase III, tracrRNA и pre-crRNA) в клетках млекопитающих достичь целенаправленного расщепления хромосом млекопитающего. Поскольку DSB в ядрах млекопитающих подвергаются частичной репарации с помощью пути негомологичного соединения концов (NHEJ), который приводит к образованию вставок/делений, анализ с помощью Surveyor использовали для выявления возможной активности для расщепления в целевом локусе ЕМХ1 (см., например, Guschin et al., 2010, Methods Mol Biol 649: 247). Котрансфекция всех четырех компонентов CRISPR была способна индуцировать расщепления в протоспейсере до 5,0% (см. фигуру 2D). Котрансфекция всех компонентов CRISPR, за исключением SpRNase III, также индуцировала образование вставок/делеций в протоспейсере на уровне до 4,7%, что указывало на то, что могут существовать эндогенные РНКазы млекопитающих, которые способны помогать созреванию crRNA, такие как, например, родственные ферменты Dicer и Drosha. Удаление любого из трех остальных компонентов ликвидировало активность системы CRISPR для расщепления генома (фигура 2D). Секвенирование по Сэнгеру ампликонов, содержащих целевой локус, подтверждало активность для расщепления: на 43 подвергшихся секвенированию клонов было обнаружено 5 мутированных аллелей (11,6%). В подобных экспериментах с использованием ряда направляющих последовательностей процентные значения содержания вставок/делеций составляли до 29% (см. фигуры 4-7, 12 и 13). Эти результаты определяют трехкомпонентную систему для эффективной опосредованной CRISPR модификации генома в клетках млекопитающих.
Для оптимизации эффективности расщепления авторы данной заявки также определяли, влияют ли различные изоформы tracrRNA на эффективность расщепления, и обнаружили, что в этой иллюстративной системе только короткая (89 п.о.) форма транскрипта была способна опосредовать расщепление локуса генома ЕМХ1. На фигуре 9 представлен дополнительный анализ процессинга crRNA в клетках млекопитающих с помощью нозерн-блоттинга. На фигуре 9А показано схематическое изображение вектора экспрессии для одного спейсера, фланкированного двумя прямыми повторами (DR-EMX1(1)-DR). Спейсер из 30 п.о. нацеленный на протоспейсер 1 локуса ЕМХ1 человека и последовательности прямых повторов показаны в последовательности внизу фигуры 9А. Линия указывает на участок, обратно комплементарную последовательность которого использовали для создания зондов для нозерн-блоттинга для выявления crRNA ЕМХ1(1). На фигуре 9В показаны результаты анализа с помощью нозерн-блоттинга общей РНК, экстрагированной из клеток 293FT, трансфицированных экспрессирующими конструкциями U6, несущими DR-EMX1(1)-DR. Левая и правая секции получены с клетками 293FT, трансфицированными без или с SpRNase III, соответственно. DR-EMX1(1)-DR подвергался процессингу в зрелые crRNA только в присутствии SpCas9 и короткой tracrRNA и не зависел от присутствия SpRNase III. Зрелая crRNA, обнаруженная в общей РНК трансфицированных 293FT, имела длину ~33 п.о. и была короче, чем зрелая crRNA из S. pyogenes длиной 39-42 п.о. Данные результаты демонстрируют, что систему CRISPR можно перенести в эукариотические клетки и перепрограммировать для облегчения расщепления эндогенных целевых полинуклеотидов млекопитающих.
На фигуре 2 показана бактериальная система CRISPR, описанная в этом примере. На фигуре 2А показано схематическое изображение локуса 1 CRISPR из Streptococcus pyogenes SF370 и предполагаемый механизм опосредованного CRISPR расщепления ДНК с помощью этой системы. Зрелая crRNA, подвергшаяся процессингу из массива прямых повторов-спейсеров, направляет Cas9 к мишеням в геноме, состоящим из комплементарных протоспейсеров и мотива, смежного с протоспейсером (РАМ). При спаривании оснований мишень-спейсер Cas9 опосредует двухцепочечный разрыв в целевой ДНК. На фигуре 2 В показано конструирование Cas9 S. pyogenes (SpCas9) и РНКазы III (SpRNase III) с клеточными сигналами ядерной локализации (NLS) для обеспечения импорта в ядро млекопитающих. На фигуре 2С показана экспрессия SpCas9 и SpRNase III у млекопитающих, управляемая конститутивным промотором EF1a, и массива tracrRNA и pre-crRNA (DR-cneftcep-DR), управляемая промотором U6 РНК-полимеразы 3 для стимуляции точной инициации и терминации транскрипции. Протоспейсер из локуса ЕМХ1 человека с удовлетворительной последовательностью РАМ использовали в качестве спейсера в массиве pre-crRNA. На фигуре 2D показан анализ с помощью нуклеазы Surveyor для опосредованных SpCas9 минорных вставок и делеций. SpCas9 экспрессировался с SpRNase III, tracrRNA и массивом pre-crRNA, несущим целевой спейсер для ЕМХ1, и без таковых. На фигуре 2Е показано схематическое изображение спаривания оснований между целевым локусом и нацеленной на ЕМХ1 crRNA, а также иллюстративная хроматограмма, на которой показана микроделеция, смежная по отношению к сайту расщепления SpCas9. На фигуре 2F показаны мутированные аллели, идентифицированные в результате анализа секвенирования 43 клональных ампликонов, показывающие разнообразие микровставок и микроделеций. Штрихами указаны удаленные основания, а невыровненные или несовпадающие основания указывают на вставки или мутации. Масштабная метка =10 мкм.
Для дальнейшего упрощения трехкомпонентной системы адаптировали химерную crRNA-tracrRNA гибридную структуру, в которой зрелую crRNA (содержащую направляющую последовательность) сливали с частичной tracrRNA при помощи структуры по типу стебель-петля для имитации естественного дуплекса crRNA : tracrRNA (фигура 3А).
Направляющие последовательности можно встроить между сайтами BbsI с использованием гибридизированных олигонуклеотидов. Протоспейсеры на смысловой и антисмысловой нитях указаны выше и ниже последовательностей ДНК, соответственно. Степень модификации для локусов PVALB человека и Th мыши достигали 6,3% и 0,75%, соответственно, демонстрируя широкую применимость системы CRISPR при модификации различных локусов у многих организмов. Хотя при использовании химерных конструкций расщепление обнаруживали только с одним из трех спейсеров для каждого локуса, все целевые последовательности расщеплялись с эффективностью получения вставок/делений, достигающей 27%, при использовании схемы с коэкспрессируемой pre-crRNA (фигуры 4 и 5).
На фигуре 5 представлена дополнительная иллюстрация того, что SpCas9 можно перепрограммировать для целенаправленного воздействия на несколько локусов генома в клетках млекопитающих. На фигуре 5А представлено схематическое изображение локуса ЕМХ1 человека, на котором показано положение пяти протоспейсеров, указанных с помощью подчеркнутых последовательностей. На фигуре 5В представлено схематическое изображение комплекса pre-crRNA/trcrRNA, на котором показана гибридизация между участком прямого повтора в pre-crRNA и tracrRNA (вверху), и схематическое изображение химерной структуры РНК, содержащей направляющую последовательность из 20 п.о. и парную tracr-последовательность и tracr-последовательность, состоящие из неполного прямого повтора и последовательностей tracrRNA, гибридизованных в "шпилечную" структуру (внизу). Результаты анализа с помощью Surveyor со сравнением эффективности опосредованного Cas9 расщепления в пяти протоспейсерах в локусе ЕМХ1 человека показаны на фигуре 5С. Целенаправленное воздействие на каждый протоспейсер осуществляли либо с использованием подвергнутого процессингу комплекса pre-crRNA/tracrRNA (crRNA), либо с использованием химерной РНК (chiRNA).
Поскольку вторичная структура РНК может быть важной для межмолекулярных взаимодействий, алгоритм предсказания структуры на основе минимальной свободной энергии и ансамбля взвешенных структур по Больцману использовали для сравнения предполагаемой вторичной структуры всех направляющих последовательностей, используемых в эксперименте с целенаправленным воздействием на геном (фигура 3В) (см., например, Gruber et al., 2008, Nucleic Acids Research, 36: W70). Анализ выявил, что в большинстве случаев эффективные направляющие последовательности в контексте химерной crRNA, по сути, не содержали мотивов вторичной структуры, тогда как неэффективные направляющие последовательности с большей вероятностью образовывали внутренние вторичные структуры, которые могут препятствовать спариванию оснований с ДНК целевого протоспейсера. Следовательно, возможно, что вариабельность во вторичной структуре спейсера может оказывать воздействие на эффективность опосредованной CRISPR интерференции при использовании химерной crRNA.
На фигуре 3 показан пример векторов экспрессии. На фигуре 3А представлено схематическое изображение бицистронного вектора для управления экспрессией химерной синтетической конструкции crRNA-tracrRNA (химерной РНК), а также SpCas9. Химерная направляющая РНК содержит направляющую последовательность из 20 п.о., соответствующую протоспейсеру в геномном целевом сайте. На фигуре 3В представлено схематическое изображение, на котором показаны направляющие последовательности, нацеленные на локусы ЕМХ1, PVALB человека и Th мыши, а также их предсказанные вторичные структуры. Эффективность модификации в каждом целевом сайте указана ниже рисунка вторичной структуры РНК (ЕМХ1, n=216 считываемых фрагментов при секвенировании ампликонов; PVALB, n=224 считываемых фрагментов; Th, n=265 считываемых фрагментов). Представлены результаты по алгоритму укладки каждого основания, окрашенного соответственно его возможности принятия предсказанной вторичной структуры, как указано с помощью цветной шкалы, воспроизведенной на фигуре 3B в виде серой шкалы. Структуры дополнительных векторов для SpCas9 показаны на фигуре 3А, в том числе отдельные векторы экспрессии, включающие промотор U6, сцепленный с сайтом встраивания для направляющего олигонуклеотида, и промотор Cbh, сцепленный с кодирующей последовательностью SpCas9.
Для того, чтобы определить, способны ли спейсеры с вторичными структурами функционировать в прокариотических клетках, где в естественных условиях функционируют CRISPR, интерференцию при трансформации плазмидами, несущими протоспейсеры, исследовали в штамме Е. coli, гетерологично экспрессирующем локус 1 CRISPR S. pyogenes SF370 (фигура 3С). Локус CRISPR клонировали в низкокопийный вектор экспрессии Е. coli и массив crRNA замещали одним спейсером, фланкированным парой DR (pCRISPR). Штаммы E. coli, несущие разные плазмиды pCRISPR, трансформировали контрольными плазмидами, содержащими соответствующие протоспейсер и последовательности РАМ (фигура 3С). При анализе у бактерий все спейсеры способствовали эффективной CMSPR-интерференпии (фигура 3С). Эти результаты указывают на то, что могут существовать дополнительные факторы, влияющие на эффективность активности CRISPR в клетках млекопитающих.
Для исследования специфичности опосредованного CRISPR расщепления эффект однонуклеотидных мутаций в направляющей последовательности в отношении расщепления протоспейсера в геноме млекопитающих анализировали с использованием ряда целенаправленно воздействующих на ЕМХ химерных crRNA с единичными точковыми мутациями (фигура 4А). На фигуре 4 В показаны результаты анализа с помощью нуклеазы Surveyor со сравнением эффективности расщепления Cas9 при спаривании с различными мутантными химерными РНК. Несовпадение одного основания в участке вплоть до 12 п.о. с 5' в РАМ, по сути, прекращало расщепление генома SpCas9, тогда как спейсеры с мутациями в положениях, расположенных в более отдаленных положениях выше относительно хода транскрипции сохраняли активность в отношении исходного протоспейсера-мишени (фигура 4В). В дополнение к РАМ, SpCas9 характеризуется специфичностью в отношении одного основания в последних 12 п.о. спейсера. Кроме того, CRISPR способен опосредовать расщепление генома столь же эффективно, как и пара нуклеаз TALE (TALEN), целенаправленно воздействующих на тот же протоспейсер ЕМХ1. На фигуре 4С представлено схематическое изображение, на котором показана структура TALEN, целенаправленно воздействующих на ЕМХ1, и на фигуре 4D показано сравнение эффективности TALEN и Cas9 (n=3) при разгонке в геле продуктов, полученных в результате анализа с помощью Surveyor.
Установив набор компонентов для достижения опосредованного CRISPR редактирования генов в клетках млекопитающих посредством склонного к ошибкам механизма NHEJ, исследовали способность CRISPR к стимуляции гомологичной рекомбинации (HR), высокоточный путь репарации генов для создания точных редакционных изменений в геноме. SpCas9 дикого типа способен опосредовать сайт-специфические DSB, которые могут репарироваться как с помощью NHEJ, так и HR. Кроме того, замену аспартата на аланин (D10A) в каталитическом домене RuvCI в SpCas9 производили посредством методик генетической инженерии для превращения нуклеазы в никазу (SpCas9n; проиллюстрировано на фигуре 5А) (см., например, Sapranausaks et al., 2011, Cucleic Acis Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: E2579) так, чтобы надрезанная геномная ДНК подвергалась высокоточной репарации с использованием гомологичной рекомбинации (HDR). Анализ с помощью Surveyor подтвердил, что SpCas9n не создает вставок/делеций в протоспейсере-мишени ЕМХ1. Как показано на фигуре 5В, коэкспрессия целенаправленно воздействующей на ЕМХ1 химерной crRNA с SpCas9 давала вставки/делеции в целевом сайте, тогда как коэкспрессия с SpCas9n - нет (n=3). Более того, при секвенировании 327 ампликонов не обнаружили каких-либо вставок/делеций, индуцированных SpCas9n. Для исследования опосредованной CRISPR HR при совместной трансфекции клеток НЕК 293FT химерной РНК, целенаправленно воздействующей на ЕМХ1, hSpCas9 или hSpCas9n, выбирали тот же локус, также как и матрицу для HR для введения пары сайтов рестрикции (HindIII и NheI) возле протоспейсера. На фигуре 5 С приведена схематическая иллюстрация стратегии HR с относительными положениями точек рекомбинации и последовательностей для гибридизации праймеров (стрелки). SpCas9 и SpCas9n действительно катализировали интеграцию матрицы для HR в локус ЕМХ1. ПЦР амплификация целевого участка с последующим рестрикционным расщеплением HindIII выявила продукты расщепления, соответствующие ожидаемым размерам фрагментов (стрелки на результатах анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с помощью гель-электрофореза, показанных на фигуре 5D), причем SpCas9 и SpCas9n опосредуют подобные уровни эффективности HR. Заявители дополнительно подтверждали HR с использованием секвенирования геномных ампликонов по Сэнгеру (фигура 5Е). Эти результаты демонстрировали пригодность CRISPR для облегчения целенаправленной вставки генов в геном млекопитающего. С учетом специфичности к мишени в 14 п.о. (12 п.о. от спейсера и 2 п.о. от РАМ) SpCas9 дикого типа доступность никазы может значительно снизить вероятность нецелевой модификации, поскольку одноцепочечные разрывы не являются субстратами для склонного к ошибкам пути NHEJ.
Экспрессирующие конструкции, имитирующие естественную архитектуру локусов CRISPR с собранными в массив спейсерами (фигура 2А), создавали для исследования возможности мультиплексного целенаправленного воздействия на последовательности. При использовании одного массива CRISPR, кодирующего пару спейсеров, нацеленных на ЕМХ1 и PVALB, обнаруживали эффективное расщепление в обоих локусах (фигура 4F, на которой показаны как схематическая структура массива crRNA, так и блот, полученный после анализа с помощью Surveyor, показывающий эффективное опосредование расщепления). Также исследовали целенаправленную делецию геномных участков большего размера посредством одновременных DSB с использованием спейсеров против двух мишеней в ЕМХ1, разделенных 119 п.о., и обнаруженная эффективность делении составляла 1,6% (3 из 182 ампликонов; фигура 5G). Это демонстрирует, что система CRISPR может опосредовать мультиплексное редактирование в пределах одного генома.
Пример 2: модификации и альтернативы системы CRISPR
Возможность применения РНК для программирования специфичного к последовательности расщепления ДНК определяет новый класс инструментов для конструирования генома для разнообразных исследовательских и промышленных применений. Несколько аспектов системы CRISPR можно дополнительно улучшить для повышения эффективности и универсальности целенаправленного воздействия с помощью CRISPR. Оптимальная активность Cas9 может зависеть от доступности несвязанного Mg2+ на уровнях, которые превышают имеющиеся в ядре млекопитающего (см., например, Jinek et al., 2012, Science, 337: 816), и предпочтение в отношении мотива NGG непосредственно ниже протоспейсера ограничивает способность к целенаправленному воздействию в среднем на каждые 12 п.о. в геноме человека. Некоторые из этих затруднений можно преодолеть путем изучения разнообразия локусов CRISPR в микробном метагеноме (см., например, Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol, 9: 467). Другие локусы CRISPR можно переместить в микроокружение клетки млекопитающего с помощью способа, подобного описанному в примере 1. Эффективность модификации в каждом целевом сайте указана ниже вторичных структур РНК. Алгоритм, генерирующий цвета структуры каждого основания соответственно его возможности принятия предсказанной вторичной структуры. РНК направляющих спейсеров 1 и 2 индуцировали 14% и 6,4%, соответственно. Статистический анализ активности для расщепления по биологическим копиям в этих двух протоспейсерных сайтах также приведен на фигуре 7.
Пример 3: алгоритм выбора примерной целевой последовательности
Создали компьютерную программу для идентификации кандидатных целевых последовательностей CRISPR на обеих нитях вводимой последовательности ДНК на основе длины желаемой направляющей последовательности и мотива последовательности CRISPR (РАМ) для определенного фермента CRISPR. Например, целевые сайты для Cas9 из S. pyogenes с последовательностями РАМ NGG можно идентифицировать путем поиска в отношении 5'-Nx-NGG-3' как на вводимой последовательности, так и на последовательности, обратно-комплементарной вводимой. Подобным образом, целевые сайты для Cas9 CRISPR1 S. thermophilus с последовательностью РАМ NNAGAAW, можно идентифицировать путем поиска в отношении 5'-Nx-NNAGAAW-3' как на вводимой последовательности, так и на последовательности, обратно-комплементарной вводимой. Подобным образом, целевые сайты для Cas9 CRISPR3 S. thermophilus с последовательностью РАМ NGGNG можно идентифицировать путем поиска в отношении 5'-Nx-NGGNG-3' как на вводимой последовательности, так и на последовательности, обратно-комплементарной вводимой. Значение "х" в Nx может фиксироваться программой или может быть определено пользователем, как, например, 20.
Поскольку несколько случаев появления целевого сайта ДНК в геноме могут приводить к неспецифическому редактированию генома, после идентификации всех возможных сайтов программа профильтровывает последовательности, исходя из количества раз, когда они встречаются в соответствующем эталонном геноме. Для тех ферментов CRISPR, для которых специфичность к последовательности определяется "затравочной" последовательностью, такой как находящаяся в 11-12 п.о. в направлении 5' от последовательности РАМ, в том числе сама последовательность РАМ, стадия фильтрования может основываться на "затравочной" последовательности. Следовательно, во избежание редактирования в дополнительных локусах генома результаты фильтруют, исходя из числа случаев обнаружения последовательности затравки: РАМ в подходящем геноме. Пользователь может иметь возможность выбора длины затравочной последовательности. Пользователь также может иметь возможность определять число случаев обнаружения последовательности затравки: РАМ в геноме применительно к прохождению фильтра По умолчанию установлен скрининг в отношении уникальных последовательностей. Уровень фильтрования изменяют путем изменения как длины затравочной последовательности, так и числа случаев обнаружения последовательности в геноме. В качестве дополнения или альтернативы, программа может обеспечивать последовательность направляющей последовательности, комплементарную сообщенной(ым) целевой(ым) последовательности(ям) путем обеспечения последовательности, обратно комплементарной идентифицированной(ым) целевой(ым) последовательности(ям).
Дальнейшие детали способов и алгоритмов для оптимизации выбора последовательности можно найти в заявке на патент США с серийным номером ТВА (общая ссылка В1-2012/084 44790.11.2022); включенной в данный документ при помощи ссылки.
Пример 4: оценка гибридов нескольких химерных crRNA-tracrRNA
В данном примере описаны результаты, полученные для химерных РНК (chiRNA; содержащие направляющую последовательность, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность в одном транскрипте), имеющих tracr-последовательности, которые включают фрагменты последовательности tracrRNA дикого типа с разной длиной. На фигуре 18а показано схематическое изображение бицистронного вектора экспрессии для химерной РНК и Cas9. Cas9 управляется промотором CBh, а химерная РНК управляется промотором U6. Химерная направляющая РНК состоит из направляющей последовательности (Ns) из 20 п.о., соединенной с tracr-последовательностью (проходящей от первого "U" в нижней нити к концу транскрипта), которая усечена в разных указанных положениях. Направляющие и tracr-последовательности разделены парной tracr-последовательностью GUUUUAGAGCUA, за которой следует последовательность петли GAAA. Результаты анализов с помощью SURVEYOR в отношении опосредованных Cas9 вставок/делеций в локусах ЕМХ1 и PVALB человека показаны на фигурах 18b и 18с, соответственно. Стрелки указывают на ожидаемые фрагменты, полученные в результате расщепления с помощью SURVEYOR. ChiRNA показаны путем обозначения их "+n", a crRNA относится к гибридной РНК, в которой направляющие и tracr-последовательности экспрессируются в виде раздельных транскриптов. Количественный анализ этих результатов, выполненный в трех повторностях, проиллюстрирован с помощью гистограмм на фигурах 11а и 11b, соответствующих фигурам 10b и 10с, соответственно ("N.D." означает отсутствие обнаруженных вставок/делеций). ID (идентификационные данные) протоспейсеров и их соответствующей мишени в геноме, последовательность протоспейсера, последовательность РАМ и положение нити приведены в таблице D. Направляющие последовательности разработаны так, чтобы они были комплементарны полной последовательности протоспейсера в случае отдельных транскриптов в гибридной системе или только подчеркнутой части в случае химерных РНК.
Figure 00000044
Клеточная культура и трансфекция
Линию клеток почки эмбриона человека (HEK) 293FT (Life Technologies) поддерживали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone), 2 мМ GlutaMAX (Life Technologies), 100ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37°C с инкубированием при 5% СО СО2. Клетки 293FT засевали в 24-луночные планшеты (Corning) за 24 часа до трансфекции при плотности 150000 клеток на лунку. Клетки трансфицировали с применением Lipofectamine 2000 (Life Technologies), следуя рекомендованному производителем протоколу. Для каждой лунки 24-луночного планшета использовали в общей сложности 500 нг плазмид.
Анализ с помощью SURVEYOR на предмет наличия модификации генома
Клетки 293FT трансфицировали плазмидной ДНК, как описано выше. Клетки инкубировали при 37°C в течение 72 часов после трансфекции перед экстракцией геномной ДНК. Геномную ДНК экстрагировали с помощью раствора QuickExtract DNA Extraction Solution (Epicentre), следуя протоколу производителя. Вкратце, осажденные центрифугированием клетки ресуспендировали в растворе QuickExtract solution и инкубировали при 65°C в течение 15 минут и 98°C в течение 10 минут. Геномный участок, фланкирующий целевой сайт CRISPR каждого гена, амплифипировали с помощью ПЦР (праймеры перечислены в таблице Е) и продукты очищали с применением колонки QiaQuick Spin Column (Qiagen), следуя протоколу производителя. В общей сложности 400 нг очищенных ПЦР-продуктов смешивали с 2 мкл 10Х ПЦР-буфера для ДНК- полимеразы Taq (Enzymatics) и воды сверхвысокой чистоты до конечного объема 20 мкл и подвергали процессу повторного отжига для обеспечения образования гетеродуплекса: 95°C в течение 10 мин., линейное снижение температуры с 95°C до 85°C со скоростью 2°C/с, с 85°C до 25°C со скоростью 0,25°C/с и с выдерживанием при 25°C в течение 1 минуты. После повторного отжига продукты обрабатывали нуклеазой SURVEYOR и энхансером S SURVEYOR (Transgenomics), следуя рекомендованному производителем протоколу, и анализировали в 4-20% полиакриламидных гелях Novex ТВЕ (Life Technologies). Гели окрашивали красителем ДНК SYBR Gold (Life Technologies) в течение 30 минут и получали изображение с помощью системы обработки изображений Gel Doc gel imaging system (Bio-rad). Количественный анализ основывался на относительных интенсивностях полос.
Figure 00000045
Вычислительная идентификация уникальных целевых сайтов CRISPR
Для идентификации уникальных целевых сайтов для фермента Cas9 (SpCas9) S. pyogenes SF370 в геноме человека, мыши, крысы, данио, плодовой мухи и С. elegans был разработан пакет программ для сканирования обеих нитей последовательности ДНК и идентификации всех возможных целевых сайтов SpCas9. Для этого примера каждый целевой сайт SpCas9 был оперативно определен как последовательность из 20 п.о., за которой следует последовательность мотива, смежного с протоспейсером, (РАМ) NGG, при этом были определены все последовательности, удовлетворяющие определению 5'-N20-NGG-3' на всех хромосомах. Для предотвращения неспецифического редактирования генома после идентификации всех потенциальных сайтов все целевые сайты фильтровали, исходя из количества раз, когда они встречаются в соответствующем эталонном геноме. Для того чтобы извлечь пользу из специфичности к последовательности активности Cas9, обеспечиваемой "затравочной" последовательностью, которой может быть, например, последовательность из приблизительно 11-12 п.о. 5' от последовательности РАМ, при этом последовательности 5'-NNNNNNNNNN-NGG-3' выбирали как уникальные в соответствующем геноме. Все геномные последовательности загружали из геномного браузера UCSC (геном человека hg19, геном мыши mm9, геном крысы rn5, геном данио danRer7, геном D. melanogaster dm4 и геном С. elegans се10). Все результаты поиска доступны для просмотра с использованием информации из геномного браузера UCSC. Иллюстративная визуализация некоторых целевых сайтов в геноме человека представлена на фигуре 22.
Первоначально целенаправленному воздействию подвергали три сайта в пределах локуса ЕМХ1 в клетках HEK 293FT человека. Эффективность модификации генома каждой сhiРНК оценивали с использованием анализа с помощью нуклеазы SURVEYOR, который позволяет обнаруживать мутации, возникающие в результате двухцепочечных разрывов (DSB) ДНК и их последующей репарации с помощью пути репарации повреждения ДНК за счет негомологичного соединения концов (NHEJ). В конструкциях, обозначенных chiRNA(+n), указывается, что нуклеотиды в количестве до +n нуклеотида tracrRNA дикого типа включены в химерную РНК-конструкцию, при этом для n используются значения 48, 54, 67 и 85. Химерные РНК, содержащие более длинные фрагменты tracrRNA дикого типа (chiRNA(+67) и chiRNA(+85)), опосредовали расщепление ДНК во всех трех целевых сайтах ЕМХ1, причем chiRNA(+85), в частности, демонстрировал значительно более высокие уровни расщепления ДНК, чем соответствующие гибриды crRNA/tracrRNA, у которых направляющие и tracr-последовательности экспрессируются в отдельных транскриптах (фигуры 10b и 10а). Два сайта в локусе PVALB, которые не давали обнаруживаемого расщепления с использованием гибридной системы (направляющая последовательность и tracr-последовательность, экспрессируемые в виде отдельных транскриптов), также подвергались целенаправленному воздействию с использованием chiRNA. chiRNA(+67) и chiRNA(+85) были способны опосредовать значительное расщепление в двух протоспейсерах в PVALB (фигуры 10с и 10b).
Для всех пяти мишеней в локусах ЕМХ1 и PVALB наблюдали соответствующее повышение эффективности модификации генома с увеличением длины tracr-последовательности. Не вдаваясь в какую-либо теорию, вторичная структура, формируемая 3' концом tracrRNA, может играть роль в увеличении скорости образования комплекса CRISPR. Иллюстрация предсказанных вторичных структур для каждой химерной РНК, использованной в этом примере, представлена на фигуре 21. Вторичную структуру предсказывали с применением RNAfold (http://RNA.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) с использованием минимальной свободной энергии и алгоритма функции распределения. Псевдоцвет для каждого основания (воспроизведен в серой шкале) указывает на возможность спаривания. По причине того, что chiRNA с более длинными tracr-последовательностями были способны расщеплять мишени, которые не были расщеплены нативными гибридами crRNA/tracrRNA CRISPR, возможно, что химерная РНК может загружаться на Cas9 более эффективно, чем ее нативный гибридный аналог. Для обеспечения применения Cas9 для сайт-специфического редактирования генома в эукариотических клетках и организмах все предсказанные уникальные целевые сайты для Cas9 S. pyogenes определяли путем вычислений в геномах человека, мыши, крысы, данио, С. elegans и D. melanogaster. Химерные РНК можно разрабатывать для ферментов Cas9 из других микроорганизмов для расширения целевого пространства CRISPR РНК-программируемых нуклеаз.
На фигурах 11 и 21 показаны примерные бицистронные векторы экспрессии для экспрессии химерной РНК, включающие tracr-последовательность РНК дикого типа вплоть до нуклеотида +85 и SpCas9 с последовательностями ядерной локализации SpCas9 экспрессируется с промотора CBh и терминируется polyA-сигналом bGH (bGH рА). Расширенная последовательность, показанная непосредственно под схематическим изображением, соответствует участку, окружающему направляющую последовательность сайта встраивания, и включает от 5' до 3', 3'-часть промотора U6 (первый заштрихованный участок), сайты расщепления BbsI (стрелки), неполный прямой повтор (парная tracr-последовательность GTTTTAGAGCTA, подчеркнутая), последовательность петли GAAA и +85 tracr-последовательность (подчеркнутая последовательность, следующая за последовательностью петли). Иллюстративное встраивание направляющей последовательности изображено ниже сайта встраивания направляющей последовательности, при этом нуклеотиды направляющей последовательности для выбранной мишени представлены как "N".
Последовательности, описанные в приведенных выше примерах, представляют собой следующие (полинуклеотидные последовательности представлены от 5' к 3').
U6 с короткой tracrRNA (Streptococcuspyogenes SF370):
Figure 00000046
(жирный шрифт = последовательность tracrRNA; подчеркивание = терминаторная последовательность).
U6 с длинной tracrRNA (Streptococcus pyogenes SF370):
Figure 00000047
U6-DR-BbsI-остов-DR (Streptococcus pyogenes SF370):
Figure 00000048
U6-химерная PHK-BbsI-остов (Streptococcus pyogenes SF370)
Figure 00000049
Figure 00000050
NLS-SpCas9-EGFP:
Figure 00000051
SpCas9-EGFP-NLS:
Figure 00000052
Figure 00000053
NLS-SpCas9-EGFP-NLS:
Figure 00000054
Figure 00000055
NLS-SpCas9-NLS:
Figure 00000056
Figure 00000057
NLS-mCherry-SpRNase3:
Figure 00000058
SpRNase3-mCherry-NLS:
Figure 00000059
NLS-SpCas9n-NLS (D10A мутация никазы представлена в нижнем регистре):
Figure 00000060
Figure 00000061
hEMX1-HR-матрица-HindII-NheI:
Figure 00000062
Figure 00000063
NLS-StCsn1-NLS:
Figure 00000064
Figure 00000065
U6-St_tracrRNA(7-97):
Figure 00000066
U6-DR-спейсер-DR (S. pyogenes SF370)
Figure 00000067
(нижний регистр, подчеркивание - прямой повтор; N = направляющая последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Химерная РНК, содержащая +48 tracr RNA (S. pyogenes SF370)
Figure 00000068
Figure 00000069
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Химерная РНК, содержащая +54 tracr RNA (S. pyogenes SF370)
Figure 00000070
Figure 00000071
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Химерная РНК, содержащая +67 tracr RNA (S. pyogenes SF370)
Figure 00000072
Figure 00000073
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор) Химерная РНК, содержащая +85 tracr RNA (S. pyogenes SF370)
Figure 00000074
Figure 00000075
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
CBh-NLS-SpCas9-NLS
Figure 00000076
Figure 00000077
Figure 00000078
Figure 00000079
Figure 00000080
(подчеркивание = NLS-hSpCas9-NLS).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000081
Figure 00000082
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000083
Figure 00000084
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000085
Figure 00000086
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000087
Figure 00000088
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000089
Figure 00000090
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CPJSPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000091
Figure 00000092
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000093
Figure 00000094
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 £ thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000095
Figure 00000096
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NNAGAAW)
Figure 00000097
Figure 00000098
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Иллюстративная химерная РНК для Cas9 из CRISPR1 LMD-9 S. thermophilus (с РАМ NGGNG)
Figure 00000099
Figure 00000100
(N = направляющая последовательность; первое подчеркивание = парная tracr-последовательность; второе подчеркивание = tracr-последовательность; жирный шрифт = терминатор).
Кодон-ошимизированный вариант Cas9 из локуса CRISPR3 LMD-9 S. thermophilus (с NLS и на 5'-, и на 3'-концах)
Figure 00000101
Figure 00000102
Figure 00000103
Figure 00000104
Пример 5: оптимизация направляющей РНК для Cas9 Streptococcus pyogenes (называемого SpCas9)
Авторы данной заявки вносили мутации в tracrRNA и последовательности прямых повторов или вносили мутации в химерную направляющую РНК для повышения экспрессии РНК в клетках.
Оптимизация основана на наблюдении, что присутствовали фрагменты тимина (Ts) в tracrRNA и направляющей РНК, которые могли приводить к ранней терминации транскрипции посредством промотора pol 3. Таким образом заявители создавали следующие оптимизированные последовательности. Оптимизированная tracrRNA и соответствующий оптимизированный прямой повтор представлены в парах.
Оптимизированная tracrRNA 1 (мутация подчеркнута):
Figure 00000105
Оптимизированный прямой повтор 1 (мутация подчеркнута):
Figure 00000106
Оптимизированная tracrRNA 2 (мутация подчеркнута):
Figure 00000107
Оптимизированный прямой повтор 2 (мутация подчеркнута):
Figure 00000108
Авторы данной заявки также оптимизировали химерную направляющую РНК для оптимальной активности в эукариотических клетках. Исходная направляющая РНК:
Figure 00000109
Оптимизированная химерная направляющая последовательность РНК 1:
Figure 00000110
Оптимизированная химерная направляющая последовательность РНК 2:
Figure 00000111
Figure 00000112
Оптимизированная химерная направляющая последовательность РНК 3:
Figure 00000113
Авторы данной заявки показали, что оптимизированная химерная направляющая РНК работает лучше, как показано на фигуре 9. Эксперимент проводили путем котрансфекции клеток 293FT Cas9 и ДНК-кассетой с U6-направляющей РНК для экспрессии одной из четырех форм РНК, показанных выше. Мишень направляющей РНК является таким же целевым сайтом в локусе ЕМХ1 человека: "GTCACCTCCAATGACTAGGG".
Пример 6: оптимизация Cas9 из CRISPR1 LMD-9 Streptococcus thermophilus (называемого St1Cas9)
Авторы данной заявки разрабатывали направляющие химерные РНК, как показано на фигуре 12.
Направляющие РНК St1Cas9 можно подвергать такому же типу оптимизации, как и направляющие РНК SpCas9, путем разрушения политиминовых фрагментов (Ts).
Пример 7: улучшение системы Cas9 для применения in vivo
Авторы данной заявки проводили поиск с использованием метагеномного подхода в отношении Cas9 с малым молекулярным весом. Большинство гомологов Cas9 являются достаточно большими. Например, SpCas9 имеет длину около 1368 а.к., что слишком много для легкой упаковки в вирусные векторы для доставки. Некоторые из последовательностей могли быть неверно аннотированы, и, таким образом, точная частота каждой длины не обязательно может быть достоверной. Тем не менее она дает некоторое представление о распределении белков Cas9 и указывает на то, что существуют более короткие гомологи Cas9.
С помощью анализа на основе расчетов авторы данной заявки обнаружили, что у штамма бактерии Campylobacter присутствуют два белка Cas9 с менее чем 1000 аминокислот. Последовательность для одного Cas9 из Campylobacter jejuni представлена ниже. При такой длине CjCas9 может быть легко упакован в AAV, лентивирусы, аденовирусы и другие вирусные векторы для надежной доставки в первичные клетки и in vivo в животные модели.
>Cas9 Campylobacter jejuni (CjCas9)
Figure 00000114
Предполагаемый элемент tracrRNA для данного CjCas9 представляет собой:
Figure 00000115
Последовательность прямого повтора представляет собой:
Figure 00000116
Совместно свернутая структура tracrRNA и прямой повтор представлены на фигуре 6.
Пример химерной направляющей РНК для CjCas9 представляет собой:
Figure 00000117
Авторы данной заявки также оптимизировали направляющую РНК для Cas9 с применением способов in vitro. На фигуре 18 показаны данные, полученные в результате in vitro оптимизации химерной направляющей РНК St1Cas9.
Несмотря на то, что предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были показаны и описаны в данном документе, для специалиста в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления предоставлены только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены теперь будут очевидны для специалиста в данной области без отступления от сути настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты вариантов осуществления настоящего изобретения, раскрытые в данном документе, можно применять при практическом осуществлении настоящего изобретения. Предполагают, что следующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения, и что, таким образом, охвачены способы и структуры в пределах объема данной формулы изобретения и их эквиваленты.
Пример 8: оптимизация Sa sgRNA
Авторы данной заявки разрабатывали пять вариантов sgRNA для SaCas9 для оптимальной усеченной архитектуры с наивысшей эффективностью расщепления. Кроме того, дуплексную систему нагивный прямой повтор : tracr исследовали совместно с sgRNA. Гиды с указанными длинами совместно трансфицировали SaCas9 и исследовали в клетках HEK 293FT в отношении активности. Посредством в общей сложности 100 нг sgRNA U6-ПЦР-ампликона (или 50 нг прямого повтора и 50 нг tracrRNA) и 400 нг плазмид с SaCas9 совместно трансфицировали 200000 гепатоцитов мыши Hepa1-6 и ДНК собирали через 72 часа после трансфекции для анализа при помощи SURVEYOR. Результаты показаны на фиг. 23.
Библиографические ссылки:
1. Urnov, F.D., Rebar, E.J., Holmes, М.С., Zhang, H.S. & Gregory, P.D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
2. Bogdanove, A.J. & Voytas, D.F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 333, 1843-1846 (2011).
3. Stoddard, B.L. Homing endonuclease structure and function. Q. Rev. Biophys. 38, 49-95 (2005).
4. Bae, T. & Schneewind, O. Allelic replacement in Staphylococcus aureus with inducible counter-selection. Plasmid 55, 58-63 (2006).
5. Sung, C.K., Li, H., Claverys, J.P. & Morrison, D.A. An rpsL cassette, janus, for gene replacement through negative selection in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 67,5190-5196(2001).
6. Sharan, S.K., Thomason, L.C., Kuznetsov, S.G. & Court, D.L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat. Protoc. 4, 206-223 (2009).
7. Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).
8. Deveau, H., Garneau, J.E. & Moineau, S. CRISPR-Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annu. Rev. Microbiol. 64, 475-493 (2010).
9. Horvath, P. & Barrangou, R. CRISPR-Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science 327,167-170 (2010).
10. Terns, M.P. & Terns, R.M. CRISPR-based adaptive immune systems. Curr. Opin. Microbiol. 14, 321-327 (2011).
11. van der Oost, I., Jore, M.M., Westra, E.R., Lundgren, M. & Brouns, S.J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends. Biochem. Sci. 34, 401-407 (2009).
12. Brouns, S.J. et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science 321, 960-964 (2008).
13. Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R.M. & Terns, M.P. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).
14. Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011).
15. Hatoum-Asian, A., Maniv, I. & Marraffini, L.A. Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 21218-21222 (2011).
16. Haurwitz, R.E., Jinek, M., Wiedenheft, В., Zhou, K. & Doudna, J.A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science 329,1355-1358 (2010).
17. Deveau, H. et al. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 190,1390-1400 (2008).
18. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2012).
19. Makarova, K.S., Aravind, L., Wolf, Y.I. & Koonin, E.V. Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems. Biol. Direct. 6,38(2011).
20. Barrangou, R. RNA-mediated programmable DNA cleavage. Nat. Biotechnol. 30, 836-838 (2012).
21. Brouns, S.J. Molecular biology. A Swiss army knife of immunity. Science 337, 808-809 (2012).
22. Carroll, D. A CRISPR Approach to Gene Targeting. Mol. Ther. 20, 1658-1660 (2012).
23. Bikard, D., Hatoum-Aslan, A., Mucida, D. & Marraffrni, L.A. CRISPR interference can prevent natural transformation and virulence acquisition during in vivo bacterial infection. Cell Host Microbe 12,177-186 (2012).
24. Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. (2011).
25. Semenova, E. et al. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. (2011).
26. Wiedenheft, B. et al. RNA-guided complex from a bacterial immune system enhances target recognition through seed sequence interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011).
27. Zahner, D. & Hakenbeck, R. The Streptococcus pneumoniae beta-galactosidase is a surface protein. J. Bacteriol. 182, 5919-5921 (2000).
28. Marraffrni, L.A., Dedent, A.C. & Schneewind, O. Sortases and the art of anchoring proteins to the envelopes of gram-positive bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70, 192-221 (2006).
29. Motamedi, M.R., Szigety, S.K. & Rosenberg, S.M. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 13, 2889-2903 (1999).
30. Hosaka, T. et al. The novel mutation K87E in ribosomal protein S12 enhances protein synthesis activity during the late growth phase in Escherichia coli. Mol. Genet. Genomics 271, 317-324(2004).
31. Costantino, N. & Court, D.L. Enhanced levels of lambda Red-mediated recombinants in mismatch repair mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 15748-15753 (2003).
32. Edgar, R. & Qimron, U. The Escherichia coli CRISPR system protects from lambda lysogenization, lysogens, and prophage induction. J. Bacteriol. 192, 6291-6294 (2010).
33. Marraffini, L.A. & Sontheimer, E.J. Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity. Nature 463, 568-571 (2010).
34. Fischer, S. et al. An archaeal immune system can detect multiple Protospacer Adjacent Motifs (PAMs) to target invader DNA. J. Biol. Chem. 287, 33351-33363 (2012).
35. Gudbergsdottir, S. et al. Dynamic properties of the Sulfolobus CRISPR-Cas and CRISPR/Cmr systems when challenged with vector-borne viral and plasmid genes and protospacers. Mol. Microbiol. 79, 35-49 (2011).
36. Wang, H.H. et al. Genome-scale promoter engineering by coselection MAGE. Nat Methods 9, 591-593 (2012).
37. Cong, L. et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR-Cas Systems. Science в печати (2013).
38. Mali, P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science в печати (2013).
39. Hoskins, J. et al. Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6. J. Bacteriol. 183, 5709-5717 (2001).
40. Havarstein, L.S., Coomaraswamy, G. & Morrison, D.A. An unmodified heptadecapeptide pheromone induces competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11140-11144 (1995).
41. Horinouchi, S. & Weisblum, B. Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol. 150, 815-825 (1982).
42. Horton, R.M. In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA: SOEing Together Tailor-Made Genes. Methods Mol. Biol. 15, 251-261 (1993).
43. Podbielski, A., Spellerberg, В., Woischnik, M., Pohl, B. & Lutticken, R. Novel series of plasmid vectors for gene inactivation and expression analysis in group A streptococci (GAS). Gene 177, 137-147 (1996).
44. Husmann, L.K., Scott, J.R., Lindahl, G. & Stenberg, L. Expression of the Arp protein, a member of the M protein family, is not sufficient to inhibit phagocytosis of Streptococcus pyogenes. Infection and immunity 63, 345-348 (1995).
45. Gibson, D.G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods 6, 343-345 (2009).
46. Tangri S, et al. ("Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity" J Immunol. 2005 Mar 15; 174(6): 3187-96.
* * * *
Несмотря на то, что предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были показаны и описаны в данном документе, для специалиста в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления предоставлены только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены будут теперь будут очевидны для специалиста в данной области без отступления от сути настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты вариантов осуществления настоящего изобретения, раскрытые в данном документе, можно применять при практическом осуществлении настоящего изобретения.

Claims (64)

1. Сконструированная система CRISPR-Cas для редактирования генома в эукариотической клетке, содержащая:
белок Cas9, содержащий по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации, и
химерную РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, содержащую:
(a) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке,
(b) парную tracr-последовательность, способную гибридизоваться с tracr-последовательностью, и
(c) tracr-последовательность,
где (a), (b) и (c) расположены в 5’-3’ ориентации,
где одна или несколько из направляющей, tracr- и парной tracr-последовательностей модифицированы для повышения стабильности и где необязательно белок Cas9 образует комплекс с химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas.
2. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает сконструированную вторичную структуру.
3. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает уменьшение участка гибридизации между парной tracr-последовательностью и tracr-последовательностью.
4. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает слияние парной tracr- последовательности и tracr-последовательности посредством искусственной петли.
5. Система CRISPR-Cas п. 1, где модификация включает tracr-последовательность длиной от 40 до 120 п.о.
6. Система CRISPR-Cas п. 1, где tracr-последовательность составляет от 40 п.о. до полной длины tracr.
7. Система CRISPR-Cas по п. 1, где tracr-последовательность включает по меньшей мере нуклеотиды 1-67 соответствующей tracrRNA дикого типа.
8. Система CRISPR-Cas п. 1, где tracr-последовательность включает по меньшей мере нуклеотиды 1-85 соответствующей tracrRNA дикого типа.
9. Система CRISPR-Cas по п. 1, где tracr-последовательность содержит нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 1-67 tracrRNA Cas9 S. pyogenes дикого типа.
10. Система CRISPR-Cas по п. 1, где tracr-последовательность содержит нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 1-85 tracrRNA Cas9 S. pyogenes дикого типа.
11. Система CRISPR-Cas по п. 9, где tracr-последовательность состоит, по сути, из нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам 1-67 tracrRNA Cas9 S. pyogenes дикого типа.
12. Система CRISPR-Cas по п. 10, где tracr-последовательность состоит, по сути, из нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам 1-85 tracrRNA Cas9 S. pyogenes дикого типа.
13. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает оптимизацию последовательности.
14. Система CRISPR-Cas по п. 13, где модификация включает уменьшение полиТ-последовательностей в tracr- и/или парной tracr-последовательностях.
15. Система CRISPR-Cas по п. 14, где один или несколько T, присутствующие в полиТ-последовательности, соответствующей последовательности дикого типа, были заменены на отличный от Т нуклеотид.
16. Система CRISPR-Cas по пп. 13, 14 или 15, где модифицированная последовательность не содержит какую-либо полиТ-последовательность, имеющую более 4 смежных T.
17. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает добавление терминаторной полиТ-последовательности.
18. Система CRISPR-Cas по п. 17, где модификация включает добавление терминаторной полиТ-последовательности в tracr- и/или парную tracr-последовательности.
19. Система CRISPR-Cas по п. 17 или 18, где модификация включает добавление терминаторной полиТ-последовательности в направляющую последовательность.
20. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает изменение петель и/или "шпилек".
21. Система CRISPR-Cas по п. 20, где модификация включает обеспечение минимум двух "шпилек" в направляющей последовательности.
22. Система CRISPR-Cas по п. 20 или 21, где модификация включает обеспечение "шпильки", образованной при помощи комплементации между tracr- и парной tracr-последовательностями.
23. Система CRISPR-Cas по п. 20 или 21, где модификация включает обеспечение одной или нескольких дополнительных "шпилек" на 3'-конце последовательности tracrRNA.
24. Система CRISPR-Cas по п. 20 или 21, где модификация включает обеспечение одной или нескольких дополнительных "шпилек", добавленных на 3' направляющей последовательности.
25. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает удлинение 5'-конца направляющей последовательности.
26. Система CRISPR-Cas по п. 25, где модификация включает обеспечение одной или нескольких "шпилек" на 5'-конце направляющей последовательности.
27. Система CRISPR-Cas по п. 25 или 26, где модификация включает введение последовательности (5'-AGGACGAAGTCCTAA) на 5'-конце направляющей последовательности.
28. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает обеспечение образования перекрестных связей или обеспечение одного или нескольких модифицированных нуклеотидов в полинуклеотидной последовательности.
29. Система CRISPR-Cas по п. 28, где модифицированные нуклеотиды предусматриваются в любой или во всех из tracr-, парной tracr- и/или направляющей последовательностей.
30. Система CRISPR-Cas по п. 28 или 29, где обеспечение модифицированных нуклеотидов предусматривает включение по меньшей мере одного не встречающегося в природе нуклеотида, или модифицированного нуклеотида, или их аналогов.
31. Система CRISPR-Cas по п. 30, где модифицированные нуклеотиды модифицированы по компоненту, представляющему собой рибозу, фосфат и/или основание.
32. Система CRISPR-Cas по п. 30, где модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-O-метил-аналогов, 2'-дезокси-аналогов или 2'-фтор-аналогов.
33. Система CRISPR-Cas по п. 30, где модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2-аминопурина, 5-бромуридина, псевдоуридина, инозина, 7-метилгуанозина.
34. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает две "шпильки".
35. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает три "шпильки".
36. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает самое большее пять "шпилек".
37. Система CRISPR-Cas по п. 1, где белок Cas9 является SpCas9.
38. Система CRISPR-Cas по п. 1, где белок Cas9 является SaCas9.
39. Система CRISPR-Cas по п. 1, где белок Cas9 состоит менее чем из одной тысячи аминокислот.
40. Система CRISPR-Cas по п. 1, где белок Cas9 состоит менее чем из четырех тысяч аминокислот.
41. Система CRISPR-Cas по п. 1, где белок Cas9 представляет собой StCas9 или StlCas9.
42. Система CRISPR-Cas по п. 1, где белок Cas9 является ферментом Cas9 из организма, выбранного из группы, состоящей из рода Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium или Corynebacter.
43. Система CRISPR-Cas по п. 1, где белок Cas9 является нуклеазой, управляющей расщеплением обеих нитей в определенной точке целевой последовательности.
44. Система CRISPR-Cas по п. 1, где направляющая последовательность содержит по меньшей мере пятнадцать нуклеотидов.
45. Система CRISPR-Cas по п. 1, где модификация включает оптимизированную tracr-последовательность и/или оптимизированную направляющую последовательность РНК, и/или совместно свернутую структуру tracr-последовательности и/или парной(ых) tracr-последовательности(ей), и/или стабилизирующие вторичные структуры tracr-последовательности, и/или tracr-последовательности с уменьшенным участком спаривания оснований, и/или tracr-последовательность, слитую с элементами РНК.
46. Система CRISPR-Cas по любому из пп. 1-45, где белок Cas9 кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке.
47. Сконструированная векторная система CRISPR-Cas для модификации целевой последовательности в эукариотической клетке, содержащая один или несколько векторов, содержащих:
I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей химерную РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, содержащую:
(a) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью в эукариотической клетке,
(b) парную tracr-последовательность, способную гибридизоваться с tracr-последовательностью, и
(c) tracr-последовательность,
где (a), (b) и (c) расположены в 5’-3’ ориентации, и
II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок Cas9, содержащий по меньшей мере одну последовательность ядерной локализации,
где компоненты I и II находятся в одном и том же или в разных векторах системы,
где одна или несколько из направляющей, tracr- и парной tracr-последовательностей модифицированы для повышения стабильности.
48. Векторная система по п. 47, где компоненты I и II находятся в одном и том же векторе системы.
49. Векторная система по п. 47, где первый регуляторный элемент является промотором полимеразы II или промотором полимеразы III.
RU2015128098A 2012-12-12 2013-12-12 Конструирование систем, способы и оптимизированные направляющие композиции для манипуляции с последовательностями RU2701850C2 (ru)

Applications Claiming Priority (25)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261736527P 2012-12-12 2012-12-12
US61/736,527 2012-12-12
US201361748427P 2013-01-02 2013-01-02
US61/748,427 2013-01-02
US201361758468P 2013-01-30 2013-01-30
US61/758,468 2013-01-30
US201361769046P 2013-02-25 2013-02-25
US61/769,046 2013-02-25
US201361791409P 2013-03-15 2013-03-15
US201361802174P 2013-03-15 2013-03-15
US61/791,409 2013-03-15
US61/802,174 2013-03-15
US201361806375P 2013-03-28 2013-03-28
US61/806,375 2013-03-28
US201361814263P 2013-04-20 2013-04-20
US61/814,263 2013-04-20
US201361819803P 2013-05-06 2013-05-06
US61/819,803 2013-05-06
US201361828130P 2013-05-28 2013-05-28
US61/828,130 2013-05-28
US201361836127P 2013-06-17 2013-06-17
US201361835931P 2013-06-17 2013-06-17
US61/835,931 2013-06-17
US61/836,127 2013-06-17
PCT/US2013/074819 WO2014093712A1 (en) 2012-12-12 2013-12-12 Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019127300A Division RU2796017C2 (ru) 2012-12-12 2013-12-12 Конструирование систем, способы и оптимизированные направляющие композиции для манипуляции с последовательностями

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2015128098A RU2015128098A (ru) 2019-03-28
RU2015128098A3 RU2015128098A3 (ru) 2019-03-28
RU2701850C2 true RU2701850C2 (ru) 2019-10-01

Family

ID=49920627

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015128098A RU2701850C2 (ru) 2012-12-12 2013-12-12 Конструирование систем, способы и оптимизированные направляющие композиции для манипуляции с последовательностями

Country Status (16)

Country Link
US (5) US20140242664A1 (ru)
EP (2) EP4279588A3 (ru)
JP (10) JP2016504026A (ru)
KR (1) KR20150105633A (ru)
CN (2) CN113528577A (ru)
AU (4) AU2013359123B2 (ru)
CA (1) CA2894701A1 (ru)
DK (1) DK2771468T3 (ru)
ES (4) ES2598115T3 (ru)
HK (5) HK1202586A1 (ru)
IL (2) IL307735A (ru)
MX (1) MX2015007549A (ru)
PL (2) PL2771468T3 (ru)
PT (4) PT2896697E (ru)
RU (1) RU2701850C2 (ru)
WO (1) WO2014093712A1 (ru)

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US12006520B2 (en) 2011-07-22 2024-06-11 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity

Families Citing this family (571)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
EP2847335B1 (en) 2012-04-25 2018-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
LT3401400T (lt) 2012-05-25 2019-06-10 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui
CA2877290A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Daniel F. Voytas Gene targeting in plants using dna viruses
US9877988B2 (en) 2012-07-11 2018-01-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating lysosomal storage diseases using nucleases and a transgene
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
JP2015527889A (ja) * 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN114891871A (zh) 2012-08-14 2022-08-12 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
EP4397760A3 (en) * 2012-10-23 2024-10-09 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
EP2925864B1 (en) 2012-11-27 2018-10-31 The Children's Medical Center Corporation Targeting bcl11a distal regulatory elements for fetal hemoglobin reinduction
PT2928496T (pt) 2012-12-06 2019-11-11 Sigma Aldrich Co Llc Modificação e regulação de genoma baseadas em crispr
BR112015013784A2 (pt) 2012-12-12 2017-07-11 Massachusetts Inst Technology aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para manipulação de sequência e aplicações terapêuticas
EP2932421A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2931892B1 (en) 2012-12-12 2018-09-12 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
PL2931898T3 (pl) 2012-12-12 2016-09-30 Le Cong Projektowanie i optymalizacja systemów, sposoby i kompozycje do manipulacji sekwencją z domenami funkcjonalnymi
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
US20140242664A1 (en) * 2012-12-12 2014-08-28 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
US20140186919A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2931919B1 (en) 2012-12-14 2019-02-20 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
IL308158A (en) * 2012-12-17 2023-12-01 Harvard College RNA-guided human genome engineering
EP3919505B1 (en) 2013-01-16 2023-08-30 Emory University Uses of cas9-nucleic acid complexes
CN108753766A (zh) 2013-02-08 2018-11-06 10X基因组学有限公司 多核苷酸条形码生成
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
KR101780885B1 (ko) 2013-03-14 2017-10-11 카리부 바이오사이언시스 인코포레이티드 핵산-표적화 핵산의 조성물 및 방법
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US20140273235A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
EP2970208A4 (en) 2013-03-15 2016-11-30 Gen Hospital Corp SPECIFICITY INCREASES FOR RNA-MEDIATED CHANGES
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
WO2014165825A2 (en) 2013-04-04 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
RS58255B1 (sr) 2013-04-16 2019-03-29 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
RU2756865C2 (ru) 2013-06-04 2021-10-06 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Направляемая рнк регуляция транскрипции
US9267135B2 (en) * 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
MX2015017312A (es) 2013-06-17 2017-04-10 Broad Inst Inc Suministro y uso de composiciones, vectores y sistemas crispr-cas para la modificación dirigida y terapia hepáticas.
JP6702858B2 (ja) 2013-06-17 2020-06-03 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ウイルス成分を使用して障害および疾患をターゲティングするためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および組成物の送達、使用および治療上の適用
JP6625971B2 (ja) 2013-06-17 2019-12-25 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のためのタンデムガイド系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
EP3011030B1 (en) 2013-06-17 2023-11-08 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2014202250A1 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Kolibree Toothbrush system with sensors for a dental hygiene monitoring system
EP3019595A4 (en) * 2013-07-09 2016-11-30 THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS
SI3019619T1 (sl) * 2013-07-11 2021-12-31 Modernatx, Inc. Sestave, ki zajemajo sintetične polinukleotide, ki kodirajo proteine, pozvezane s crispr, in sintetične sgrna, ter metode uporabe
EP3611268A1 (en) 2013-08-22 2020-02-19 E. I. du Pont de Nemours and Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
ES2844174T3 (es) 2013-09-18 2021-07-21 Kymab Ltd Métodos, células y organismos
WO2015054507A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Pronutria, Inc. Nutritive polypeptide production systems, and methods of manufacture and use thereof
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
CN111218447B (zh) 2013-11-07 2024-10-11 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
AU2014360811B2 (en) 2013-12-11 2017-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
SG10201804977UA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for Targeting Disorders and Diseases Using Particle Delivery Components
EP4219699A1 (en) 2013-12-12 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
AU2014361781B2 (en) 2013-12-12 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing
AU2014361784A1 (en) 2013-12-12 2016-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR-Cas systems and compositions for HBV and viral diseases and disorders
SG10201804973TA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Compositions and Methods of Use of Crispr-Cas Systems in Nucleotide Repeat Disorders
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
CN105899657A (zh) 2013-12-12 2016-08-24 布罗德研究所有限公司 用于改变基因产物表达的crispr-cas系统和方法、结构信息以及诱导型模块化cas酶
ES2802984T3 (es) 2014-02-11 2021-01-22 Univ Colorado Regents Ingeniería del genoma multiplex mediante CRISPR
AU2015219167A1 (en) 2014-02-18 2016-09-08 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
CN106232803A (zh) 2014-02-27 2016-12-14 孟山都技术公司 用于定点基因组修饰的组合物和方法
JP2017508457A (ja) 2014-02-27 2017-03-30 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド Ｔ細胞バランス遺伝子発現、組成物およびその使用方法
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
EP3613854A1 (en) 2014-03-05 2020-02-26 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
EP3122877B1 (en) 2014-03-26 2023-03-22 University of Maryland, College Park Targeted genome editing in zygotes of domestic large animals
US11242525B2 (en) 2014-03-26 2022-02-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease
EP4123024A1 (en) * 2014-04-01 2023-01-25 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
EP3129143B1 (en) 2014-04-10 2022-11-23 10X Genomics, Inc. Method for partitioning microcapsules
RU2707540C2 (ru) 2014-04-25 2019-11-27 Чилдрен'С Медикал Сентр Корпорэйшн Композиции и способы для лечения гемоглобинопатий
WO2015184262A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections
AU2015274367B2 (en) 2014-06-13 2020-11-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Products and methods to isolate mitochondria
AU2015280069B2 (en) 2014-06-23 2021-08-12 The General Hospital Corporation Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq)
WO2015200555A2 (en) * 2014-06-25 2015-12-30 Caribou Biosciences, Inc. Rna modification to engineer cas9 activity
JP6838969B2 (ja) 2014-06-26 2021-03-03 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法
BR112017000482A2 (pt) 2014-07-11 2017-11-07 Du Pont métodos para produzir uma planta mutante e para gerar uma planta, planta, semente, rna, métodos para produzir uma célula, para duplicar um fragmento gênico, para substituir uma primeira sequência promotora, para inserir um elemento regulador em uma sequência de nucleotídeos e para inserir um íntron em uma sequência de nucleotídeos, planta de milho e célula vegetal
CN104195177B (zh) * 2014-08-05 2017-06-09 南京大学 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法
ES2780904T3 (es) 2014-08-17 2020-08-27 Broad Inst Inc Edición genómica usando nickasas Cas9
EP3633047B1 (en) 2014-08-19 2022-12-28 Pacific Biosciences of California, Inc. Method of sequencing nucleic acids based on an enrichment of nucleic acids
WO2016033246A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
US10570418B2 (en) 2014-09-02 2020-02-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016069591A2 (en) 2014-10-27 2016-05-06 The Broad Institute Inc. Compositions, methods and use of synthetic lethal screening
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
WO2016073990A2 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
WO2016077123A1 (en) * 2014-11-10 2016-05-19 Moderna Therapeutics, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
KR101833433B1 (ko) * 2014-11-25 2018-02-28 한국생명공학연구원 돼지 t 세포 및 b 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법
WO2016086197A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Method of identifying and treating a person having a predisposition to or afflicted with a cardiometabolic disease
CA2969145A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 The Regents Of The University Of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
US20170266320A1 (en) 2014-12-01 2017-09-21 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing
WO2016089433A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
KR102656470B1 (ko) 2014-12-10 2024-04-09 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
WO2016100951A2 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
WO2016100974A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
AU2016207023B2 (en) 2015-01-12 2019-12-05 10X Genomics, Inc. Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
EP3245232B1 (en) 2015-01-12 2021-04-21 The Regents of The University of California Heterodimeric cas9 and methods of use thereof
SG10201804715WA (en) * 2015-01-28 2018-07-30 Pioneer Hi Bred Int Crispr hybrid dna/rna polynucleotides and methods of use
US11180792B2 (en) 2015-01-28 2021-11-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
BR112017017810A2 (pt) 2015-02-23 2018-04-10 Crispr Therapeutics Ag materiais e métodos para tratamento de hemoglobinopatias
EP3262173A2 (en) 2015-02-23 2018-01-03 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
WO2016137973A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics Inc Partition processing methods and systems
EP3262193A2 (en) 2015-02-26 2018-01-03 The Broad Institute Inc. T cell balance gene expression, compositions of matters and methods of use thereof
EP3265560B1 (en) 2015-03-02 2021-12-08 Sinai Health System Homologous recombination factors
KR102598856B1 (ko) 2015-03-03 2023-11-07 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 변경된 PAM 특이성을 갖는 조작된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제
EP4019635A1 (en) * 2015-03-25 2022-06-29 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods, compositions and components
CA2976387A1 (en) 2015-03-27 2016-10-06 E I Du Pont De Nemours And Company Soybean u6 small nuclear rna gene promoters and their use in constitutive expression of small rna genes in plants
AU2016246450B2 (en) * 2015-04-06 2022-03-17 Agilent Technologies, Inc. Chemically modified guide RNAs for CRISPR/Cas-mediated gene regulation
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
EP3286571B1 (en) 2015-04-24 2021-08-18 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
WO2016182893A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Teh Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof
EP3763814A1 (en) 2015-05-08 2021-01-13 The Children's Medical Center Corporation Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
CA2988854A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
WO2016182959A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
EP3303585A4 (en) 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
US10392607B2 (en) 2015-06-03 2019-08-27 The Regents Of The University Of California Cas9 variants and methods of use thereof
WO2016193945A2 (en) 2015-06-05 2016-12-08 Novartis Ag Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
WO2016201047A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation
US20160362667A1 (en) * 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
WO2016205728A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr mediated recording of cellular events
JP2018518181A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション 血液細胞系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体
CA2989831A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for genomic editing
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
RU2752834C2 (ru) 2015-06-18 2021-08-09 Те Брод Инститьют, Инк. Мутации фермента crispr, уменьшающие нецелевые эффекты
AU2016279077A1 (en) 2015-06-18 2019-03-28 Omar O. Abudayyeh Novel CRISPR enzymes and systems
EP3436575A1 (en) 2015-06-18 2019-02-06 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2016205745A2 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
WO2017004279A2 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
EP4339287A3 (en) 2015-07-31 2024-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified cells and methods of therapy
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
EP3337908A4 (en) 2015-08-18 2019-01-23 The Broad Institute, Inc. METHOD AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF CHROMATIN GRINDING AND / OR DOMAINS
WO2017035416A2 (en) * 2015-08-25 2017-03-02 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
KR20240090567A (ko) 2015-08-28 2024-06-21 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 조작된 crispr-cas9 뉴클레아제
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
KR102691636B1 (ko) * 2015-08-31 2024-08-02 애질런트 테크놀로지스, 인크. 상동 재조합에 의한 crispr/cas-기반 게놈 편집을 위한 화합물 및 방법
BR112018004636A2 (pt) 2015-09-09 2018-10-30 National University Corporation Kobe University método para modificação de um sítio alvejado em um dna de fita dupla de uma bactéria gram-positiva, complexo de enzima modificadora de ácido nucleico, e, ácido nucleico
JP2018530536A (ja) 2015-09-11 2018-10-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ヌクレアーゼＤＳＢの完全照合およびシーケンシング（ＦＩＮＤ−ｓｅｑ）
EP3350203A4 (en) * 2015-09-17 2019-06-26 The Regents of The University of California CAS9 VARIANTS POLYPEPTIDES COMPRISING INTERNAL INSERTIONS
WO2017049275A2 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
US10369232B2 (en) * 2015-09-21 2019-08-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Allele selective gene editing and uses thereof
EP3786294A1 (en) 2015-09-24 2021-03-03 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
EP3356526B1 (en) 2015-09-30 2021-08-25 The General Hospital Corporation Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (circle-seq)
WO2017069958A2 (en) 2015-10-09 2017-04-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
EP3362571A4 (en) 2015-10-13 2019-07-10 Duke University GENOMIC ENGINEERING WITH TYPE I CRISPRISMS IN EUKARYOTIC CELLS
AU2016342038B2 (en) 2015-10-22 2022-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Type VI-B CRISPR enzymes and systems
DK3350327T3 (en) 2015-10-23 2019-01-21 Caribou Biosciences Inc CONSTRUCTED CRISPR CLASS-2-NUCLEIC ACID TARGETING-NUCLEIC ACID
US11492670B2 (en) 2015-10-27 2022-11-08 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for targeting cancer-specific sequence variations
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
US11092607B2 (en) 2015-10-28 2021-08-17 The Board Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017075451A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1
WO2017075465A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3
WO2017075478A2 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by use of immune cell gene signatures
EP3371329A4 (en) 2015-11-03 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College METHOD AND DEVICE FOR VOLUMETRIC IMAGING OF A THREE-DIMENSIONAL NUCLEIC ACID-CONTAINING MATRIX
EP3371306B8 (en) 2015-11-04 2023-02-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CN108699542A (zh) 2015-11-13 2018-10-23 阿维利诺美国实验室股份有限公司 用于治疗角膜营养不良的方法
WO2017087395A1 (en) * 2015-11-16 2017-05-26 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Materials and methods for treatment of titin-based myopathies and other titinopaties
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
WO2017087910A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 10X Genomics, Inc. Transformable tagging compositions, methods, and processes incorporating same
EP3377086B1 (en) 2015-11-19 2024-05-01 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
WO2017090761A1 (ja) * 2015-11-27 2017-06-01 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換する、単子葉植物のゲノム配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体
US11903974B2 (en) 2015-11-30 2024-02-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes from cultured cells
SG10202108763UA (en) 2015-12-04 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
AU2016363024B2 (en) * 2015-12-04 2020-01-30 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic-acid targeting nucleic acids
US11293029B2 (en) 2015-12-07 2022-04-05 Zymergen Inc. Promoters from Corynebacterium glutamicum
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
WO2017106657A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11761007B2 (en) * 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
US11118194B2 (en) 2015-12-18 2021-09-14 The Regents Of The University Of California Modified site-directed modifying polypeptides and methods of use thereof
RU2018127657A (ru) 2015-12-30 2020-01-31 Новартис Аг Виды терапии на основе иммуноэффекторных клеток с улучшенной эффективностью
KR20180096800A (ko) 2016-01-11 2018-08-29 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 유전자 발현을 조절하는 방법
MY194127A (en) 2016-01-11 2022-11-14 Univ Leland Stanford Junior Chimeric proteins and methods of immunotherapy
WO2017136794A1 (en) * 2016-02-03 2017-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
US10876129B2 (en) 2016-02-12 2020-12-29 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of mutagenized allele combinations
WO2017143071A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
US20190144942A1 (en) 2016-02-22 2019-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating immune phenotypes
DK3420089T3 (da) * 2016-02-26 2022-03-14 Lanzatech Nz Inc CRISPR/Cas-systemer til C-1-fikserende bakterier
JP2019507610A (ja) 2016-03-04 2019-03-22 インドア バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法
JP2019515654A (ja) 2016-03-16 2019-06-13 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 肥満及び／又は糖尿病を処置するための方法及び組成物、並びに候補処置薬剤を識別するための方法及び組成物
US11427861B2 (en) 2016-03-17 2022-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
WO2017165167A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 The Regents Of The University Of California Methods of treating mitochondrial disorders
US12011488B2 (en) 2016-03-23 2024-06-18 The Regents Of The University Of California Methods of treating mitochondrial disorders
WO2017165859A1 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Modified viral capsid proteins
EP3433364A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
SG11201808920RA (en) * 2016-04-14 2018-11-29 Boco Silicon Valley Inc Genome editing of human neural stem cells using nucleases
KR20240091006A (ko) * 2016-04-19 2024-06-21 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규한 crispr 효소 및 시스템
WO2017184786A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 The Broad Institute Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
CA3022290A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US10767175B2 (en) * 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017219027A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 The Broad Institute Inc. Type vi crispr orthologs and systems
DK3474669T3 (da) 2016-06-24 2022-06-27 Univ Colorado Regents Fremgangsmåde til generering af stregkodede kombinatoriske biblioteker
WO2018005445A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
US20190359992A1 (en) 2016-06-28 2019-11-28 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
KR102345899B1 (ko) 2016-06-30 2021-12-31 지머젠 인코포레이티드 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
WO2018005793A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
MA45670A (fr) 2016-07-13 2019-05-22 Vertex Pharma Procédés, compositions et kits pour augmenter l'efficacité d'édition du génome
WO2018026976A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating cep290 associated disease
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
CA3033736C (en) 2016-08-12 2023-10-24 Toolgen Incorporated Manipulated immunoregulatory element and immunity altered thereby
WO2018035250A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying class 2 crispr-cas systems
US11630103B2 (en) 2016-08-17 2023-04-18 The Broad Institute, Inc. Product and methods useful for modulating and evaluating immune responses
EP3500671B1 (en) 2016-08-17 2024-07-10 The Broad Institute, Inc. Method of selecting target sequences for the design of guide rnas
US11810649B2 (en) 2016-08-17 2023-11-07 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying novel gene editing elements
WO2020225754A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Mcmullen Tara Crispr gene editing for autosomal dominant diseases
JP2019524149A (ja) 2016-08-20 2019-09-05 アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
WO2018049025A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
WO2018057946A2 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Board Of Trustees Of Southern Illinois University Tuning crispr/cas9 activity with chemically modified nucleotide substitutions
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
MX2019003674A (es) 2016-09-30 2021-01-08 Univ California Enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por arn y métodos de uso de estas.
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
US20200016202A1 (en) 2016-10-07 2020-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
US11242542B2 (en) 2016-10-07 2022-02-08 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
CN110462034A (zh) 2016-10-07 2019-11-15 综合Dna技术公司 化脓链球菌cas9突变基因和由其编码的多肽
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
CA3041068A1 (en) 2016-10-18 2018-04-26 Regents Of The University Of Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
EP3535396A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Novartis AG Methods and compositions for enhancing gene editing
EP4256951A3 (en) 2016-11-04 2023-12-06 Flagship Pioneering Innovations V. Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
EP4321617A3 (en) 2016-11-22 2024-04-24 Integrated DNA Technologies Inc. Crispr/cpf1 systems and methods
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
US11293022B2 (en) 2016-12-12 2022-04-05 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
KR20210035022A (ko) 2016-12-14 2021-03-31 리간달 인코포레이티드 핵산 및/또는 단백질 적재물 전달을 위한 조성물 및 방법
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018129368A2 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
AU2018212986B2 (en) 2017-01-28 2024-07-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
EP4029939B1 (en) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3580337A4 (en) 2017-02-10 2020-12-02 Zymergen, Inc. MODULAR UNIVERSAL PLASMID DESIGN STRATEGY FOR COMPILING AND PROCESSING SEVERAL DNA CONSTRUCTS FOR SEVERAL HOST
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
KR102185464B1 (ko) 2017-03-15 2020-12-03 매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 신규 cas13b 오르소로그 crispr 효소 및 시스템
US20200115753A1 (en) 2017-03-17 2020-04-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
WO2018183908A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
EP3606518A4 (en) 2017-04-01 2021-04-07 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION AND MODULATION OF IMMUNOTHERAPY RESISTANCE GENE SIGNATURE IN CANCER
WO2018191553A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Tumor signature for metastasis, compositions of matter methods of use thereof
WO2018191520A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 The Broad Institute, Inc. Respiratory and sweat gland ionocytes
KR20240155360A (ko) 2017-04-12 2024-10-28 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규 타입 vi crispr 오르소로그 및 시스템
US20200405639A1 (en) 2017-04-14 2020-12-31 The Broad Institute, Inc. Novel delivery of large payloads
EP3612629A1 (en) 2017-04-18 2020-02-26 The Broad Institute, Inc. Compositions for detecting secretion and methods of use
KR20200006980A (ko) 2017-04-20 2020-01-21 이제네시스, 인크. 유전자 변형 동물의 생성 방법
EP3612551B1 (en) 2017-04-21 2024-09-04 The General Hospital Corporation Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
EP3612232A1 (en) 2017-04-21 2020-02-26 The Broad Institute, Inc. Targeted delivery to beta cells
WO2018201086A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
CN110914431B (zh) * 2017-05-08 2024-04-19 株式会社图尔金 经人工操纵的免疫细胞
WO2019103857A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
EP3625343A1 (en) 2017-05-18 2020-03-25 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
AU2018273986A1 (en) 2017-05-25 2019-12-12 The General Hospital Corporation Bipartite base editor (BBE) architectures and type-II-C-Cas9 zinc finger editing
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP4230746A3 (en) 2017-05-26 2023-11-01 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP3409104A1 (en) 2017-05-31 2018-12-05 Vilmorin et Cie Tomato plant resistant to tomato yellow leaf curl virus, powdery mildew, and nematodes
WO2020249996A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Vilmorin & Cie Resistance in plants of solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus
EP3409106A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 Vilmorin et Cie Tolerance in plants of solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus (tbrfv)
WO2018226762A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Genomic safe harbors for genetic therapies in human stem cells and engineered nanoparticles to provide targeted genetic therapies
WO2018226900A2 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving fungal strains
EP3878961A1 (en) 2017-06-06 2021-09-15 Zymergen, Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
US10428319B2 (en) 2017-06-09 2019-10-01 Editas Medicine, Inc. Engineered Cas9 nucleases
CN111108208A (zh) 2017-06-13 2020-05-05 旗舰先锋创新V股份有限公司 包含愈合子的组合物及其用途
WO2018232195A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
EP3645054A4 (en) 2017-06-26 2021-03-31 The Broad Institute, Inc. COMPOSITIONS BASED ON CRISPR / CAS-ADENIN-DEAMINASE, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITING
CN111511375A (zh) 2017-06-30 2020-08-07 因提玛生物科学公司 用于基因治疗的腺相关病毒载体
EP3645721A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Novartis AG Methods for the treatment of disease with gene editing systems
US12049643B2 (en) 2017-07-14 2024-07-30 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for modulating cytotoxic lymphocyte activity
US20210130817A1 (en) * 2017-07-14 2021-05-06 Cure Genetics Co., Ltd. Gene Editing System and Gene Editing Method
WO2019014564A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Editas Medicine, Inc. SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES
WO2019018440A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 The Broad Institute, Inc. HUMAN COLON CELL ATLAS IN GOOD HEALTH AND WITH HEMORRHAGIC RECTO-COLITIS
BR112020003596A2 (pt) 2017-08-23 2020-09-01 The General Hospital Corporation nucleases de crispr-cas9 engenheiradas com especificidade de pam alterada
WO2019060759A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. ISOLATION, PRESERVATION, COMPOSITIONS AND USES OF PLANT EXTRACTS JUSTICIA
US11618896B2 (en) 2017-09-21 2023-04-04 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
BR112020006428A2 (pt) * 2017-09-28 2020-09-24 Toolgen Incorporated manipulação de genoma artificial para regulação de expressão de genes
US11572574B2 (en) 2017-09-28 2023-02-07 Toolgen Incorporated Artificial genome manipulation for gene expression regulation
US12043870B2 (en) 2017-10-02 2024-07-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
US20200255828A1 (en) 2017-10-04 2020-08-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains
EP3694993A4 (en) 2017-10-11 2021-10-13 The General Hospital Corporation METHOD OF DETECTING A SITE-SPECIFIC AND UNDESIRED GENOMIC DESAMINATION INDUCED BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
WO2019079362A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Massachusetts Institute Of Technology HOST-PATHOGENIC INTERACTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
KR102723182B1 (ko) 2017-10-20 2024-10-31 프레드 허친슨 캔서 센터 선택된 항체를 발현하도록 유전자 변형된 b 세포를 생산하기 위한 시스템 및 방법
WO2019089803A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for studying cell evolution
US20210180053A1 (en) 2017-11-01 2021-06-17 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
US20210277392A1 (en) * 2017-11-02 2021-09-09 The Governors Of The University Of Alberta Chemically-modified guide rnas to improve crispr-cas protein specificity
US12018080B2 (en) 2017-11-13 2024-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for treating cancer by targeting the CLEC2D-KLRB1 pathway
CN111051523B (zh) 2017-11-15 2024-03-19 10X基因组学有限公司 功能化凝胶珠
US20210180059A1 (en) * 2017-11-16 2021-06-17 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
MX2020004967A (es) 2017-11-17 2020-08-27 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de linfocitos infiltrantes del tumor (til) de aspirados con aguja fina y biopsias por puncion.
US11332736B2 (en) 2017-12-07 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
WO2019126037A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 City Of Hope Modified tracrrnas grnas, and uses thereof
RU2652899C1 (ru) * 2017-12-28 2018-05-03 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина
US11994512B2 (en) 2018-01-04 2024-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
AU2019207409B2 (en) 2018-01-12 2023-02-23 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
KR20200110685A (ko) 2018-01-17 2020-09-24 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 Dna-pk 억제제
BR112020014140A2 (pt) 2018-01-17 2020-12-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated inibidores de dna-pk
KR20200110687A (ko) 2018-01-17 2020-09-24 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 유전체 편집 효율을 증가시키기 위한 퀴녹살리논 화합물, 조성물, 방법 및 키트
WO2019147743A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
EP3749768A1 (en) 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US11566236B2 (en) 2018-02-05 2023-01-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019157326A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Zymergen Inc. Genome editing using crispr in corynebacterium
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
KR20200124702A (ko) 2018-02-23 2020-11-03 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 신규한 cas9 오르소로그
JP2021518102A (ja) 2018-03-14 2021-08-02 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド 異常ヘモグロビン症の治療のためのシステム及び方法
PL235163B1 (pl) * 2018-04-05 2020-06-01 Inst Hodowli I Aklimatyzacji Roslin Panstwowy Inst Badawczy Sekwencja nukleotydowa syntetycznego genu Cas9, kaseta kierująca sgRNA do edytowania genomu roślinnego i wydajny system do ukierunkowanej mutagenezy wybranego regionu genomu roślinnego
SG11202009889VA (en) 2018-04-06 2020-11-27 10X Genomics Inc Systems and methods for quality control in single cell processing
CA3096274A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
AU2019256287A1 (en) 2018-04-17 2020-11-12 The General Hospital Corporation Sensitive in vitro assays for substrate preferences and sites of nucleic acid binding, modifying, and cleaving agents
CA3096713A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for gene editing
US20210071240A1 (en) 2018-04-19 2021-03-11 Massachusetts Institute Of Technology Single-stranded break detection in double-stranded dna
ES2922902T3 (es) 2018-04-24 2022-09-21 Kws Saat Se & Co Kgaa Plantas con digestibilidad mejorada y haplotipos marcadores
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
AU2019257749A1 (en) 2018-04-27 2020-10-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
CN112334510A (zh) 2018-04-27 2021-02-05 基因编辑有限公司 阳离子聚合物和用于生物分子递送的用途
US20210147831A1 (en) 2018-04-27 2021-05-20 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
EP3788144A4 (en) * 2018-05-01 2022-05-11 The Children's Medical Center Corporation DELIVERY AND EDITING OF EXTENDED BCL11A-RNP/CRISPR USING A 3XNLS-CAS9
WO2019213660A2 (en) 2018-05-04 2019-11-07 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
JP2021522828A (ja) 2018-05-06 2021-09-02 エメンドバイオ インコーポレーテッド ヘテロ接合性ｅｌａｎｅ遺伝子の対立遺伝子の差次的ノックアウト
WO2019217758A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
EP3794130A4 (en) 2018-05-16 2022-07-27 Synthego Corporation METHODS AND SYSTEMS FOR DESIGN AND USE OF GUIDE RNA
CN108707628B (zh) * 2018-05-28 2021-11-23 上海海洋大学 斑马鱼notch2基因突变体的制备方法
WO2019232542A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
CN112585261A (zh) 2018-06-07 2021-03-30 布里格姆妇女医院 产生造血干细胞的方法
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
US12036240B2 (en) 2018-06-14 2024-07-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
CN112566924B (zh) 2018-06-15 2024-10-29 科沃施种子欧洲股份两合公司 改善植物中基因组工程化和再生的方法
CN112543812A (zh) 2018-06-26 2021-03-23 麻省理工学院 基于crispr效应系统的扩增方法、系统和诊断
CA3101066A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 The Broad Institute, Inc. Crispr/cas and transposase based amplification compositions, systems and methods
EP3814369A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Tweak-receptor agonists for use in combination with immunotherapy of a cancer
JP2021530212A (ja) 2018-07-13 2021-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California レトロトランスポゾンベースの送達媒体及びその使用方法
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
CN113348245A (zh) 2018-07-31 2021-09-03 博德研究所 新型crispr酶和系统
EP4442836A2 (en) 2018-08-01 2024-10-09 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
AU2019318079A1 (en) 2018-08-07 2021-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Novel Cas12b enzymes and systems
EP3607819A1 (en) 2018-08-10 2020-02-12 Vilmorin et Cie Resistance to xanthomonas campestris pv. campestris (xcc) in cauliflower
EP3821020A4 (en) 2018-08-15 2022-05-04 Zymergen Inc. APPLICATIONS OF CRISPRI IN HIGH-THROUGHPUT METABOLIC ENGINEERING
US20210324357A1 (en) 2018-08-20 2021-10-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Degradation domain modifications for spatio-temporal control of rna-guided nucleases
WO2020041380A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
US20230021641A1 (en) * 2018-08-23 2023-01-26 The Broad Institute, Inc. Cas9 variants having non-canonical pam specificities and uses thereof
JP7541508B2 (ja) 2018-08-23 2024-08-28 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 操作された標的特異的な塩基エディター
US11459551B1 (en) 2018-08-31 2022-10-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2020051507A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery
EP3849565A4 (en) 2018-09-12 2022-12-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center REDUCING CD33 EXPRESSION FOR SELECTIVE PROTECTION OF THERAPEUTIC CELLS
CN113164623A (zh) 2018-09-18 2021-07-23 维恩维纽克公司 基于arc的衣壳及其用途
WO2020069029A1 (en) 2018-09-26 2020-04-02 Emendobio Inc. Novel crispr nucleases
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
US20220411783A1 (en) 2018-10-12 2022-12-29 The Broad Institute, Inc. Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
EP3870600A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
EP3870628B1 (en) 2018-10-24 2024-04-03 Genedit Inc. Cationic polymer with alkyl side chains and use for biomolecule delivery
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
MX2021005028A (es) 2018-10-31 2021-08-24 Zymergen Inc Ensamble determinista multiplexado de genotecas de adn.
EP3874048A1 (en) * 2018-11-01 2021-09-08 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
JOP20210094A1 (ar) 2018-11-05 2023-01-30 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات لإنتاج الخلايا الليمفاوية للورم الارتشاحي واستخداماتها في العلاج المناعي
EP3877511A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
BR112021008266A2 (pt) 2018-11-05 2022-01-04 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor em uma população terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um sujeito com câncer, e, população terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor
AU2019377422A1 (en) 2018-11-05 2021-05-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of NSCLC patients refractory for anti-PD-1 antibody
EP3876745A2 (en) 2018-11-08 2021-09-15 Triton Algae Innovations, Inc. Compositions and methods for incorporating heme from algae in edible products
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
CN113166744A (zh) 2018-12-14 2021-07-23 先锋国际良种公司 用于基因组编辑的新颖crispr-cas系统
WO2020131862A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
CA3123392A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
WO2020142754A2 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US20220119871A1 (en) 2019-01-28 2022-04-21 The Broad Institute, Inc. In-situ spatial transcriptomics
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing
WO2020163379A1 (en) 2019-02-05 2020-08-13 Emendobio Inc. Crispr compositions and methods for promoting gene editing of ribosomal protein s19 (rps19) gene
US20220145330A1 (en) 2019-02-10 2022-05-12 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads Modified mitochondrion and methods of use thereof
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
WO2020180733A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2020181101A1 (en) 2019-03-07 2020-09-10 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
WO2020185590A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Zymergen Inc. Iterative genome editing in microbes
BR112021017744A2 (pt) 2019-03-08 2021-11-16 Obsidian Therapeutics Inc Composições e métodos de cd40l para regulação ajustável
US11053515B2 (en) 2019-03-08 2021-07-06 Zymergen Inc. Pooled genome editing in microbes
US20220162649A1 (en) 2019-04-01 2022-05-26 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
US20220186263A1 (en) 2019-04-05 2022-06-16 Osaka University Method for producing knock-in cell
JP2022530224A (ja) 2019-04-23 2022-06-28 ジーンエディット インコーポレイテッド アルキル側鎖を有するカチオン性ポリマー
BR112021022411A2 (pt) 2019-05-13 2022-03-15 Kws Saat Se & Co Kgaa Tolerância à seca em milho
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
AR118995A1 (es) 2019-05-25 2021-11-17 Kws Saat Se & Co Kgaa Mejorador de la inducción de haploides
WO2020243370A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Genedit Inc. Polymer comprising multiple functionalized sidechains for biomolecule delivery
WO2020243661A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 The Broad Institute, Inc. Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5
WO2020254850A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Vilmorin & Cie Improvement of quality and permanence of green color of peppers at maturity and over-maturity
KR20220052905A (ko) 2019-06-25 2022-04-28 이나리 아그리컬쳐 테크놀로지, 인크. 개선된 상동성 의존적 수선 게놈 편집
CA3138188A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements
WO2021019272A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Vilmorin & Cie Tolerance to tolcndv in cucumber
EP3772542A1 (en) 2019-08-07 2021-02-10 KWS SAAT SE & Co. KGaA Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
US20220298501A1 (en) 2019-08-30 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
WO2021044377A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
BR112022004026A2 (pt) 2019-09-05 2022-08-16 Crispr Therapeutics Ag Células doadoras universais
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
US20230025039A1 (en) 2019-09-20 2023-01-26 The Broad Institute, Inc. Novel type vi crispr enzymes and systems
CA3147641A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression
EP4041894A1 (en) 2019-09-23 2022-08-17 Omega Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING HEPATOCYTE NUCLEAR FACTOR 4-ALPHA (HNF4a) GENE EXPRESSION
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
CN114846022A (zh) 2019-10-17 2022-08-02 科沃施种子欧洲股份两合公司 通过阻抑基因的下调增强作物的疾病抗性
WO2021081378A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
GB201916020D0 (en) 2019-11-04 2019-12-18 Univ Of Essex Enterprise Limited Crispr-mediated identification of biotinylated proteins and chromatin regions
EP4057802A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Vilmorin & Cie Resistance to acidovorax valerianellae in corn salad
WO2021118990A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same
CN116234906A (zh) 2020-01-13 2023-06-06 萨那生物技术股份有限公司 血型抗原的修饰
CN115397974A (zh) 2020-01-23 2022-11-25 儿童医疗中心有限公司 由人类多能干细胞进行无基质t细胞分化
EP3872190A1 (en) 2020-02-26 2021-09-01 Antibodies-Online GmbH A method of using cut&run or cut&tag to validate crispr-cas targeting
US20230081632A1 (en) 2020-02-28 2023-03-16 KWS SAAT SE & Co. KGaA Immature inflorescence meristem editing
CA3169105A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Ling MENG Method for rapid genome modification in recalcitrant plants
EP4118207A1 (en) 2020-03-11 2023-01-18 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
WO2021202938A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
US20230165909A1 (en) 2020-04-21 2023-06-01 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
WO2021216622A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
EP4138805A1 (en) 2020-04-23 2023-03-01 Genedit Inc. Polymer with cationic and hydrophobic side chains
CA3176826A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
EP4146797A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
WO2021239986A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plant haploid induction
WO2021245435A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Vilmorin & Cie Melon plants resistant to scab disease, aphids and powdery mildew
EP4161552A1 (en) 2020-06-05 2023-04-12 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating neoplasia
US20230276763A1 (en) 2020-06-05 2023-09-07 Vilmorin & Cie Resistance in plants of solanum lycopersicum to the tobrfv
US20230348920A1 (en) 2020-06-29 2023-11-02 KWS SAAT SE & Co. KGaA Boosting homology directed repair in plants
CN116096378A (zh) 2020-08-10 2023-05-09 诺华股份有限公司 视网膜变性疾病的治疗
MA60153A1 (fr) 2020-10-02 2023-08-31 Vilmorin & Cie Melon à durée de conservation prolongée
EP4225330A1 (en) 2020-10-06 2023-08-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US20240026369A1 (en) 2020-10-27 2024-01-25 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of enhanced pol theta activity for eukaryotic genome engineering
CN116406383A (zh) 2020-11-06 2023-07-07 日商基因编辑力股份有限公司 FokI核酸酶结构域的突变体
WO2022101286A1 (en) 2020-11-11 2022-05-19 Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie Fusion protein for editing endogenous dna of a eukaryotic cell
EP4001429A1 (en) 2020-11-16 2022-05-25 Antibodies-Online GmbH Analysis of crispr-cas binding and cleavage sites followed by high-throughput sequencing (abc-seq)
EP4255172A1 (en) 2020-12-03 2023-10-11 Vilmorin & Cie Tomato plants resistant to tobrfv, tmv, tomv and tommv and corresponding resistance genes
CA3202473A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Friedrich Graf Finckenstein Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
AU2021401302A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
MX2023007507A (es) * 2020-12-22 2023-09-08 Ensoma Inc Vectores auxiliares adenovirales del serotipo 35.
KR20230124682A (ko) 2020-12-23 2023-08-25 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. Rna를 봉입하는 아넬로바이러스 캡시드의 시험관 내어셈블리
KR20230146007A (ko) 2020-12-31 2023-10-18 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 범용 공여자 세포
EP4284919A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
US20240191191A1 (en) 2021-03-19 2024-06-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
IL307298A (en) 2021-03-31 2023-11-01 Entrada Therapeutics Inc Cell-penetrating circular peptides
WO2022208489A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Vilmorin & Cie Semi-determinate or determinate growth habit trait in cucurbita
AU2022263418A1 (en) 2021-04-19 2023-10-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
CA3217862A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Radius Pharmaceuticals, Inc. Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor
JP2024518476A (ja) 2021-05-10 2024-05-01 エントラーダ セラピューティクス，インコーポレイティド ｍＲＮＡスプライシングを調節するための組成物及び方法
MX2023013352A (es) 2021-05-10 2024-01-31 Entrada Therapeutics Inc Composiciones y métodos para terapéuticos intracelulares.
WO2022240721A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating interferon regulatory factor-5 (irf-5) activity
JP2024519029A (ja) 2021-05-17 2024-05-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
AU2022276078A1 (en) 2021-05-17 2024-01-04 Nogra Pharma Limited Il-34 antisense agents and methods of using same
GB202107057D0 (en) 2021-05-18 2021-06-30 Univ York Glycosylation method
WO2022243437A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 KWS SAAT SE & Co. KGaA Sample preparation with oppositely oriented guide polynucleotides
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
JP2024520528A (ja) 2021-06-01 2024-05-24 アーバー バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼを含む遺伝子編集システム及びそれらの使用
CA3222341A1 (en) 2021-06-11 2022-12-15 Kunwoo Lee Biodegradable polymer comprising side chains with polyamine and polyalkylene oxide groups
WO2022266538A2 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
EP4359006A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Entrada Therapeutics, Inc. Antisense compounds and methods for targeting cug repeats
WO2023283359A2 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
WO2023004074A2 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
EP4377446A1 (en) 2021-07-28 2024-06-05 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
WO2023006933A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plants with improved digestibility and marker haplotypes
WO2023012325A1 (en) 2021-08-06 2023-02-09 Vilmorin & Cie Resistance to leveillula taurica in pepper
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
EP4166670A1 (en) 2021-10-18 2023-04-19 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plant-tag-based weeding control
CA3235824A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Frederick G. Vogt Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
EP4426828A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
CN118401658A (zh) 2021-11-26 2024-07-26 益杰立科(上海)生物科技有限公司 调节pcsk9的方法及其用途
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
TW202342498A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 美商薩那生物科技公司 經修飾副黏液病毒科融合醣蛋白
TW202342757A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 美商薩那生物科技公司 經修飾副黏液病毒科附著醣蛋白
EP4453196A1 (en) 2021-12-21 2024-10-30 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
CN118679257A (zh) 2021-12-23 2024-09-20 马萨诸塞大学 用于脆性x相关病症的治疗性治疗
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023167882A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Artisan Development Labs, Inc. Composition and methods for transgene insertion
WO2023194359A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 Alia Therapeutics Srl Compositions and methods for treatment of usher syndrome type 2a
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
EP4256950A1 (en) 2022-04-06 2023-10-11 Vilmorin et Cie Tolerance to cgmmv in cucumber
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023219933A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acid therapeutics
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023225410A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Artisan Development Labs, Inc. Systems and methods for assessing risk of genome editing events
WO2023230578A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating circulating factors
WO2023230573A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of immune responses
WO2023230549A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
AU2023277636A1 (en) 2022-05-25 2024-11-21 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
AU2023275550A1 (en) 2022-05-25 2024-11-21 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating cytokines
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
JP7152094B1 (ja) * 2022-06-30 2022-10-12 リージョナルフィッシュ株式会社 ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024042199A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of paired genes in hybrid breeding
KR20240034661A (ko) * 2022-09-06 2024-03-14 주식회사 툴젠 캄필로박터 제주니 유래 Cas9의 가이드 RNA 구조변화를 통한 유전자교정 향상 시스템
WO2024056880A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Alia Therapeutics Srl Enqp type ii cas proteins and applications thereof
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2024098027A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
WO2024105162A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
WO2024137533A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Graphite Bio, Inc. Improved peptide inhibitors of p53 binding protein 53bp1
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
WO2024141599A1 (en) 2022-12-29 2024-07-04 Vilmorin & Cie Tomato plants resistant to resistance-breaking tswv strains and corresponding resistance genes
CN115982034B (zh) * 2022-12-30 2023-11-28 云舟生物科技(广州)股份有限公司 载体构建系统虚拟终端的测试方法、存储介质及电子设备
WO2024149810A2 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
WO2024168253A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Possible Medicines Llc Delivery of an rna guided recombination system
WO2024168265A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Possible Medicines Llc Aav delivery of rna guided recombination system
WO2024173645A1 (en) 2023-02-15 2024-08-22 Arbor Biotechnologies, Inc. Gene editing method for inhibiting aberrant splicing in stathmin 2 (stmn2) transcript
WO2024175308A1 (en) 2023-02-22 2024-08-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plants with improved performance
WO2024206911A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Children's Hospital Medical Center Clinical-grade organoids
WO2024211287A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Seagen Inc. Production cell lines with targeted integration sites
WO2024220574A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
WO2024220560A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
WO2024220741A1 (en) 2023-04-19 2024-10-24 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for the production of libraries
WO2024218295A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Vib Vzw Allelic combinations in crops for yield increase
WO2024226499A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modifying fertility
WO2024223900A1 (en) 2023-04-28 2024-10-31 Vilmorin & Cie Genetic determinants conferring improved tobrfv resistance

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2009136452A (ru) * 2007-03-02 2011-04-10 Даниско А/С (Dk) Культуры с повышенной устойчивостью к фагам

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
ATE141646T1 (de) 1986-04-09 1996-09-15 Genzyme Corp Genetisch transformierte tiere, die ein gewünschtes protein in milch absondern
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US7150982B2 (en) * 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7868149B2 (en) 1999-07-20 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Plant genome sequence and uses thereof
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US7033744B2 (en) * 2001-03-16 2006-04-25 Naoya Kobayashi Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof
US20090100536A1 (en) 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
KR101419729B1 (ko) * 2005-07-26 2014-07-17 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현
US9677123B2 (en) * 2006-03-15 2017-06-13 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
WO2010065123A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
US8889394B2 (en) 2009-09-07 2014-11-18 Empire Technology Development Llc Multiple domain proteins
CA2782014C (en) * 2009-11-27 2021-08-31 Basf Plant Science Company Gmbh Optimized endonucleases and uses thereof
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
WO2011143124A2 (en) 2010-05-10 2011-11-17 The Regents Of The University Of California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
CN103025344B (zh) * 2010-05-17 2016-06-29 桑格摩生物科学股份有限公司 新型dna-结合蛋白及其用途
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
KR102068107B1 (ko) * 2011-04-27 2020-01-20 아미리스 인코퍼레이티드 게놈 변형 방법
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
LT3401400T (lt) * 2012-05-25 2019-06-10 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui
EP4397760A3 (en) * 2012-10-23 2024-10-09 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
PT2928496T (pt) * 2012-12-06 2019-11-11 Sigma Aldrich Co Llc Modificação e regulação de genoma baseadas em crispr
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US20140242664A1 (en) * 2012-12-12 2014-08-28 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
IL308158A (en) 2012-12-17 2023-12-01 Harvard College RNA-guided human genome engineering

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2009136452A (ru) * 2007-03-02 2011-04-10 Даниско А/С (Dk) Культуры с повышенной устойчивостью к фагам

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dana Carrall et al. A CRISPR Approach to Gene Targeting, Mol. Ther., 2012 sep. 4; 20(9): 1658-1660. *

Cited By (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12006520B2 (en) 2011-07-22 2024-06-11 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US12043852B2 (en) 2015-10-23 2024-07-23 President And Fellows Of Harvard College Evolved Cas9 proteins for gene editing
US11999947B2 (en) 2016-08-03 2024-06-04 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US12084663B2 (en) 2016-08-24 2024-09-10 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US12031126B2 (en) 2020-05-08 2024-07-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Also Published As

Publication number Publication date
ES2542015T3 (es) 2015-07-29
CN105121648A (zh) 2015-12-02
US20160340662A1 (en) 2016-11-24
PT2921557T (pt) 2016-10-19
AU2013359123B2 (en) 2016-07-14
ES2553782T3 (es) 2015-12-11
AU2019229420A1 (en) 2019-10-03
PT2896697E (pt) 2015-12-31
RU2019127300A (ru) 2019-09-19
US20150247150A1 (en) 2015-09-03
EP2771468A1 (en) 2014-09-03
HK1216759A1 (zh) 2016-12-02
JP2016093196A (ja) 2016-05-26
CA2894701A1 (en) 2014-06-19
ES2536353T3 (es) 2015-05-22
US20140273232A1 (en) 2014-09-18
JP2019103511A (ja) 2019-06-27
JP6726225B2 (ja) 2020-07-22
JP7198328B2 (ja) 2022-12-28
KR20150105633A (ko) 2015-09-17
JP2019103510A (ja) 2019-06-27
PL2921557T3 (pl) 2017-03-31
EP2771468B1 (en) 2015-02-11
EP4279588A3 (en) 2024-01-17
JP6960950B2 (ja) 2021-11-05
AU2013359123A1 (en) 2015-07-30
JP2017205127A (ja) 2017-11-24
IL239344A0 (en) 2015-07-30
PT2771468E (pt) 2015-06-02
JP2023040015A (ja) 2023-03-22
AU2016244241B2 (en) 2019-06-20
JP2016504026A (ja) 2016-02-12
JP6495395B2 (ja) 2019-04-03
DK2771468T3 (en) 2015-05-26
IL239344B2 (en) 2024-06-01
IL307735A (en) 2023-12-01
JP6203879B2 (ja) 2017-09-27
RU2015128098A (ru) 2019-03-28
CN105121648B (zh) 2021-05-07
CN113528577A (zh) 2021-10-22
JP7542595B2 (ja) 2024-08-30
MX2015007549A (es) 2017-01-20
EP4279588A2 (en) 2023-11-22
ES2598115T3 (es) 2017-01-25
US20150232882A1 (en) 2015-08-20
PL2771468T3 (pl) 2015-07-31
JP2016165307A (ja) 2016-09-15
JP6960951B2 (ja) 2021-11-05
AU2019229420B2 (en) 2022-06-02
HK1209153A1 (zh) 2016-03-24
WO2014093712A1 (en) 2014-06-19
WO2014093712A9 (en) 2014-08-21
US8906616B2 (en) 2014-12-09
JP2022023118A (ja) 2022-02-07
AU2022203762A1 (en) 2022-06-23
JP2018099131A (ja) 2018-06-28
HK1209154A1 (en) 2016-03-24
RU2015128098A3 (ru) 2019-03-28
AU2016244241C1 (en) 2020-12-17
PT2784162E (pt) 2015-08-27
JP2016129516A (ja) 2016-07-21
HK1202586A1 (en) 2015-10-02
US20140242664A1 (en) 2014-08-28
AU2016244241A1 (en) 2016-11-03
HK1210221A1 (en) 2016-04-15
IL239344B1 (en) 2024-02-01
JP6420273B2 (ja) 2018-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7463436B2 (ja) 遺伝子産物の発現を変更するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系および方法
JP7542595B2 (ja) 配列操作のための系、方法および最適化ガイド組成物のエンジニアリング
JP7542681B2 (ja) 配列操作のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分系、方法および組成物
RU2701662C2 (ru) Компоненты системы crispr-cas, способы и композиции для манипуляции с последовательностями
DK2921557T3 (en) Design of systems, methods and optimized sequence manipulation guide compositions
JP2020511931A (ja) 改良された遺伝子編集