KR20230124682A - Rna를 봉입하는 아넬로바이러스 캡시드의 시험관 내어셈블리 - Google Patents

Rna를 봉입하는 아넬로바이러스 캡시드의 시험관 내어셈블리 Download PDF

Info

Publication number
KR20230124682A
KR20230124682A KR1020237025029A KR20237025029A KR20230124682A KR 20230124682 A KR20230124682 A KR 20230124682A KR 1020237025029 A KR1020237025029 A KR 1020237025029A KR 20237025029 A KR20237025029 A KR 20237025029A KR 20230124682 A KR20230124682 A KR 20230124682A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
orf1
sequence
nucleic acid
genetic element
molecule
Prior art date
Application number
KR1020237025029A
Other languages
English (en)
Inventor
로저 조셉 하자르
사이먼 델라그레이브
커트 아담 스완슨
Original Assignee
플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. filed Critical 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크.
Publication of KR20230124682A publication Critical patent/KR20230124682A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/00043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10023—Virus like particles [VLP]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 일반적으로 아넬로벡터를 제조하기 위한 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

RNA를 봉입하는 아넬로바이러스 캡시드의 시험관 내 어셈블리
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 23일자 출원된 미국 가출원 제63/130,360호 및 2021년 2월 8일자 출원된 미국 가출원 제63/147,064호의 이익을 주장한다. 전술된 출원의 내용은 그들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 12월 21일자 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 V2057-7017WO_SL.txt이며, 286,720 바이트 크기이다.
환자에게 치료적 이펙터를 운반하기 위한 적합한 벡터를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 개발하는 것이 계속 필요하다.
본 개시내용은 예를 들어, 유전 물질을 운반하기 위해, 이펙터, 예를 들어, 페이로드를 운반하기 위해, 또는 진핵 세포(예를 들어, 인간 세포 또는 인간 조직)에 대한 치료제 또는 치료적 이펙터를 운반하기 위해 운반 비히클로서 사용될 수 있는 아넬로벡터(예를 들어, 합성 아넬로벡터)를 생성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 자연적으로 발생하는 아넬로바이러스(Anellovirus)는 DNA 게놈을 가지고 있지만, 본 개시내용은 RNA를 포함하는 유전 요소를 가진 아넬로벡터를 제공한다.
아넬로벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 방법을 사용하여 생성됨)는 일반적으로 유전 요소를 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포) 내로 도입할 수 있는 단백질성 외부(예를 들어, 아넬로바이러스 캡시드 단백질, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부)에 캡슐화된 유전 요소(예를 들어, 이펙터, 예를 들어, 외인성 또는 내인성 이펙터, 예를 들어, 치료적 이펙터를 포함하거나 이를 인코딩하는 유전 요소)를 포함한다. 유전 요소는 RNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로바이러스 ORF1 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 알파토르크바이러스(alphatorquevirus), 베타토르크바이러스(Betatorquevirus) 또는 감마토르크바이러스(Gammatorquevirus)의 ORF1 핵산, 예를 들어, 알파토르크바이러스 클레이드 1, 알파토르크바이러스 클레이드 2, 알파토르크바이러스 클레이드 3, 알파토르크바이러스 클레이드 4, 알파토르크바이러스 클레이드 5, 알파토르크바이러스 클레이드 6 또는 알파토르크바이러스 클레이드 7의 ORF1)에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는 단백질성 외부를 포함하는 감염성 비히클 또는 입자이다. 본 개시내용의 아넬로벡터의 유전 요소는 전형적으로 이를 봉입하는 단백질성 외부 또는 이에 부착된 폴리펩티드에 결합하는 단백질 결합 서열을 갖는 환형 및/또는 단일-가닥 RNA 분자(예를 들어, 환형 및 단일 가닥)이며, 이는 단백질성 외부 내의 유전 요소의 봉입 및/또는 단백질성 외부 내에서 다른 핵산에 비한 유전 요소의 농축을 용이하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터의 유전 요소는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 배큘로바이러스, 핵산 작제물(예를 들어, 박미드 및/또는 공여자 벡터), 곤충 세포 및/또는 동물 세포주를 사용하여 생성된다.
일부 예에서, 유전 요소는 예를 들어, 표적 세포에서 발현될 수 있는 이펙터를 포함하거나 이를 인코딩한다(예를 들어, 비-코딩 RNA와 같은 핵산 이펙터를 포함하거나, 폴리펩티드 이펙터, 예를 들어, 단백질을 인코딩함). 일부 실시형태에서, 이펙터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 치료제 또는 치료적 이펙터이다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 내인성 이펙터 또는 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 또는 표적 세포에 대하여 외인성인 외인성 이펙터이다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 야생형 아넬로바이러스 또는 표적 세포에 대하여 외인성이다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 세포와 접촉시키고, 이펙터를 인코딩하는 유전 요소를 세포 내로 도입하여, 이펙터가 세포에 의해 제조되거나 발현되게 함으로써 이펙터를 세포 내로 운반할 수 있다. 특정 예에서, 이펙터는 내인성 이펙터이다(예를 들어, 표적 세포에 대하여 내인성이지만, 예를 들어, 아넬로벡터에 의해 증가된 양으로 제공된다). 다른 예에서, 이펙터는 외인성 이펙터이다. 이펙터는 일부 예에서, 세포의 기능을 조절하거나, 세포 내의 표적 분자의 활성 또는 수준을 조절할 수 있다. 예를 들어, 이펙터는 (예를 들어, PCT/US19/65995의 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이) 세포 내의 표적 단백질의 수준을 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 아넬로벡터는 (예를 들어, PCT/US19/65995의 실시예 19 및 28에 기재된 바와 같이) 생체 내에서 이펙터, 예를 들어, 외인성 단백질을 운반하고 발현할 수 있다. 아넬로벡터는 예를 들어, 유전 물질을 표적 세포, 조직 또는 대상체에 운반하거나; 이펙터를 표적 세포, 조직 또는 대상체에 운반하거나; 또는 예를 들어, 원하는 세포, 조직 또는 대상체에 대하여 치료제로서 작동할 수 있는 이펙터를 운반함으로써 질병 및 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 예를 들어, 숙주 세포에서 합성 아넬로벡터의 유전 요소를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 합성 아넬로벡터는 야생형 바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스)에 비한 적어도 하나의 구조적 차이, 예를 들어, 야생형 바이러스에 비한 결실, 삽입, 치환, 변형(예를 들어, 효소적 변형)을 갖는다. 일반적으로, 합성 아넬로벡터는 단백질성 외부 내에 봉입된 외인성 유전 요소를 포함하며, 이는 유전 요소 또는 그 내에 인코딩된 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)(예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 이펙터)를 진핵(예를 들어, 인간) 세포 내로 운반하기 위해 사용될 수 있다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 검출 가능하고/하거나 원하지 않는 면역 또는 염증 반응을 야기하지 않으며, 예를 들어, 염증의 분자 마커(들), 예를 들어, TNF-알파, IL-6, IL-12, IFN, 및 B-세포 반응, 예를 들어, 반응성 또는 중화 항체의 1%, 5%, 10%, 15% 초과의 증가를 야기하지 않으며, 예를 들어, 아넬로벡터는 표적 세포, 조직 또는 대상체에 대하여 실질적으로 비-면역원성일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 (i) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부; 및 (ii) RNA를 포함하는 유전 요소를 포함하는 아넬로벡터의 유전 요소를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되어 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% RNA로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 ssDNA를 포함하지 않는다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 DNA 또는 RNA 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 염기 변형, 당 변형 또는 골격 변형)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서 유전 요소는 선형 폴리펩티드이다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 유전 요소는 환형 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 예를 들어, 곤충 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열 내의 코돈의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 예를 들어, 곤충 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열 내의 코돈의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 125, 125 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2500, 2500 내지 3000, 3000 내지 3500, 3500 내지 4000 또는 4000 내지 4500개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 또는 4500개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 캡시드에 결합하는 단백질 결합 서열 및 치료적 이펙터를 인코딩하는 (아넬로바이러스에 대하여)이종 서열을 포함하는 유전 요소를 캡슐화하는 캡시드(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF, 예를 들어, ORF1, 폴리펩티드를 포함하는 캡시드)를 포함하는 (예를 들어, 인간 세포에 대한)감염성 아넬로벡터, 비히클, 또는 입자의 유전 요소를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 실시형태에서, 아넬로벡터는 유전 요소를 포유동물, 예를 들어, 인간 세포 내로 운반할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 시험관 내 어셈블리에 의해 아넬로벡터를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터를 제조하는 방법은 (a) (i) RNA를 포함하는 유전 요소, 및 (ii) ORF1 분자를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 및 (b) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 내에 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건 하에서 혼합물을 항온처리하여, 아넬로벡터를 제조하는 단계를 포함하며; 선택적으로 여기서 혼합물은 세포 내에 포함되지 않는다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a)를 제공하기 전에, 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포 또는 포유동물 세포)에서 ORF1 분자를 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현은 ORF1 분자를 생성하기에 적합한 조건 하에서 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 배큘로바이러스 발현 벡터)를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포 또는 포유동물 세포)를 항온처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a)를 제공하기 전에, 숙주 세포에 의해 발현된 ORF1 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터는 본원에 기재된 이펙터와 같은 제제를 표적 세포, 예를 들어, 치료적 또는 예방적으로 치료될 대상체 내의 표적 세포에 도입하기 위한 효과적인 운반 비히클로서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터(예를 들어, 합성 아넬로벡터)을 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 실시형태들에서, 약제학적 조성물은 표적 대상체 킬로그램당 약 105 내지 1014개(예를 들어, 약 106 내지 1013, 107 내지 1012, 108 내지 1011 또는 109 내지 1010개)의 게놈 당량의 아넬로벡터를 포함하는 단위 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 허용 가능한 기간 및 온도에 걸쳐 안정할 것이고/것이거나 요망되는 투여 경로 및/또는 투여 경로가 필요로 할 임의의 디바이스, 예를 들어, 니들(needle) 또는 주사기와 양립 가능할 것이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 단회 용량 또는 다회 용량으로서의 투여를 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 투여 장소에서, 예를 들어, 의료 전문가(healthcare professional)에 의해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 (예를 들어, 부피당 게놈의 수에 의해 정의된 바와 같은) 요망되는 농도의 아넬로벡터 게놈 또는 게놈 당량을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서의 질병 또는 장애의 치료 방법을 특징으로 하며, 당해 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로벡터, 예를 들어, 합성 아넬로벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 이펙터 또는 페이로드(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 세포, 조직 또는 대상체에 운반하는 방법을 특징으로 하며, 당해 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 아넬로벡터, 예를 들어, 합성 아넬로벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 아넬로벡터는 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 핵산이다. 일부 실시형태에서, 페이로드는 폴리펩티드이다.
일 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터, 예를 들어, 합성 아넬로벡터를 예를 들어, 생체 내에서 또는 생체 외에서, 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포로의 아넬로벡터의 운반 방법을 특징으로 한다.
전술한 아넬로벡터, 조성물 또는 방법 중 임의의 추가의 특징은 다음의 열거된 실시형태 중 하나 이상을 포함한다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시형태의 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 다음의 열거된 실시형태에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
열거된 실시형태
1. 아넬로벡터로서,
a) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
b) RNA를 포함하는 유전 요소를 포함하며,
유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되는, 아넬로벡터.
2. 실시형태 1에 있어서, 유전 요소는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% RNA로 이루어지는, 아넬로벡터.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, RNA는 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는, 아넬로벡터.
4. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 RNA로 이루어지거나 본질적으로 RNA로 이루어지는, 아넬로벡터.
5. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 아넬로벡터는 DNA를 포함하지 않는, 아넬로벡터.
6. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 아넬로벡터는 ssDNA를 포함하지 않는, 아넬로벡터.
7. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 DNA 영역을 포함하는, 아넬로벡터.
8. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, DNA 영역의 모든 뉴클레오티드는 화학적으로 변형되는, 아넬로벡터.
9. 실시형태 7 또는 8에 있어서, DNA 영역은 유전 요소의 RNA에 공유적으로 연결되는, 아넬로벡터.
10. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, DNA 영역의 적어도 일부는 유전 요소의 RNA의 적어도 일부에 혼성화되는, 아넬로벡터.
11. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, DNA 영역은 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 또는 900 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이인, 아넬로벡터.
12. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 단일 가닥인, 아넬로벡터.
13. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 이중 가닥 영역(예를 들어, RNA와 쌍을 형성하는 RNA의 영역 또는 RNA와 쌍을 형성하는 DNA의 영역)을 포함하는, 아넬로벡터.
14. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 선형인, 아넬로벡터.
15. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 환형인, 아넬로벡터.
16. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 제1 영역, 및 제1 영역과 혼성화될 수 있는 제2 영역을 포함하는, 아넬로벡터.
17. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 5' 말단 또는 3' 말단을 포함하지 않는, 아넬로벡터.
18. 실시형태 15 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 유리 인산염 및 유리 당 중 하나 또는 둘 모두를 포함하지 않는, 아넬로벡터.
19. 실시형태 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소 내의 모든 인산염은 인산염에 포함된 제1 산소 원자에 의해 제1 당, 및 인산염에 포함된 제2 산소 원자에 의해 제2 당에 공유적으로 연결되는, 아넬로벡터.
20. 실시형태 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소 내의 모든 당은 당에 포함된 제1 탄소 원자에 의해 제1 인산염, 및 당에 포함된 제2 탄소 원자에 의해 제2 인산염에 공유적으로 연결되는, 아넬로벡터.
21. 실시형태 15 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 선형 RNA를 환화시킴으로써 생성되는, 아넬로벡터.
22. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 약 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 125, 125 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2500, 2500 내지 3000, 3000 내지 3500, 3500 내지 4000 또는 4000 내지 4500개의 뉴클레오티드 길이인, 아넬로벡터.
23. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 또는 4500개의 뉴클레오티드 길이인, 아넬로벡터.
24. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 ORF1 분자에 결합하는, 아넬로벡터.
25. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 ORF1 분자에 포함된 젤리 롤(jelly roll) 도메인에 결합하는, 아넬로벡터.
26. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 ORF1 분자에 포함된 아르기닌-풍부 도메인에 결합하는, 아넬로벡터.
27. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 아넬로벡터는 복수의 유전 요소, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60개의 유전 요소를 포함하는, 아넬로벡터.
28. 실시형태 27에 있어서, 복수의 유전 요소 각각은 동일한 서열을 포함하는, 아넬로벡터.
29. 실시형태 27에 있어서, 복수의 유전 요소는 상이한 서열을 포함하는, 아넬로벡터.
30. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 외인성 이펙터를 인코딩하는, 아넬로벡터.
31. 실시형태 30에 있어서, 외인성 이펙터를 인코딩하는 서열은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 또는 3000개의 뉴클레오티드 길이인, 아넬로벡터.
32. 실시형태 30 또는 31에 있어서, 외인성 이펙터는 치료적 이펙터(예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 분자)를 포함하는, 아넬로벡터.
33. 실시형태 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 인간 단백질, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 아넬로벡터.
34. 실시형태 30 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 핵산 분자를 포함하는, 아넬로벡터.
35. 실시형태 30 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 비코딩 핵산 분자, 예를 들어, 기능적 RNA, 예를 들어, mRNA, miRNA 또는 siRNA를 포함하는, 아넬로벡터.
36. 실시형태 30 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 외인성 이펙터(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드)를 인코딩하는 mRNA 분자인, 아넬로벡터.
37. 실시형태 36에 있어서, 비코딩 핵산 분자는 인간 비코딩 핵산 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 분자인, 아넬로벡터.
38. 실시형태 30 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 사이토졸 폴리펩티드 또는 사이토졸 펩티드(예를 들어, DPP-4 억제제, GLP-1 신호전달의 활성화제, 또는 호중구 엘라스타제의 억제제, 또는 그의 기능적 단편)을 포함하는, 아넬로벡터.
39. 실시형태 38에 있어서, 외인성 이펙터는 조절 세포내 폴리펩티드를 포함하는, 아넬로벡터.
40. 실시형태 30 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 분비 폴리펩티드 또는 펩티드(예를 들어, 사이토카인, 항체 분자, 호르몬, 성장 인자 또는 응고-연관된 인자, 또는 그의 기능적 단편)를 포함하는, 아넬로벡터.
41. 실시형태 30 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 단백질 대체 치료제를 포함하는, 아넬로벡터.
42. 실시형태 30 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 효소를 포함하는, 아넬로벡터.
43. 실시형태 30 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 에리트로포이에틴(EPO) 또는 인간 성장 호르몬(hGH), 또는 그의 기능적 단편을 포함하는, 아넬로벡터.
44. 실시형태 30 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 외인성 이펙터는 유전자 편집 시스템의 구성성분(예를 들어, CRISPR 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9, Cpf1 또는 그의 기능적 단편)을 포함하는, 아넬로벡터.
45. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, RNA는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로 변형된 RNA를 포함하는, 아넬로벡터.
46. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, RNA는 캡을 포함하는, 아넬로벡터.
47. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, RNA는 폴리-A 꼬리, 예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아데노신 길이를 포함하는, 아넬로벡터.
48. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, RNA에는 폴리-A 꼬리가 결여되어 있으며, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이하의 순차적인 아데노신을 포함하는, 아넬로벡터.
49. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 단백질성 외부는 ORF1 분자의 약 60개(예를 들어, 약 40, 50, 60, 70 또는 80개)의 카피를 포함하는, 아넬로벡터.
50. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, ORF1 분자의 젤리 롤 도메인은 단백질성 외부의 내부를 향하는, 아넬로벡터.
51. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, ORF1 분자는 표 N 내지 S 및 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 아넬로벡터.
52. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, ORF1 분자는 예를 들어, 표 N 내지 S 및 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 아르기닌-풍부 영역의 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 아르기닌-풍부 영역을 포함하는, 아넬로벡터.
53. 실시형태 52에 있어서, 아르기닌-풍부 영역은 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌 또는 라이신)를 포함하는, 아넬로벡터.
54. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, ORF1 분자는 예를 들어, 표 N 내지 S 및 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 젤리 롤 도메인의 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 젤리 롤 도메인을 포함하는, 아넬로벡터.
55. 실시형태 54에 있어서, 젤리 롤 도메인은 다음의 특징 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)을 포함하는, 아넬로벡터:
(i) 젤리-롤 도메인의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% 이상)의 아미노산은 하나 이상의 β-시트의 일부이고/이거나;
(ii) 젤리-롤 도메인의 2차 구조는 적어도 4개(예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함하고/하거나;
(iii) 젤리-롤 도메인의 3차 구조는 적어도 2개(예를 들어, 적어도 2, 3 또는 4개)의 β-시트를 포함하고/하거나;
(iv) 젤리-롤 도메인은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1의 β-시트 대 α-나선의 비를 포함함.
56. 실시형태 54에 있어서, 젤리 롤 도메인은 예를 들어, 서로에 대해 역평행 배향으로 배열된 2개의 β-시트를 포함하는, 아넬로벡터.
57. 실시형태 54에 있어서, 젤리 롤 도메인은 8개의 β-가닥을 포함하는, 아넬로벡터.
58. 실시형태 52 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 젤리 롤 도메인은 예를 들어, 도 3에 나타낸 바와 같은 D β-가닥의 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 영역을 포함하는, 아넬로벡터.
59. 실시형태 52에 있어서, D β-가닥은 1, 2 또는 3개 이상의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌 또는 라이신)를 포함하는, 아넬로벡터.
60. 실시형태 52 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 젤리 롤 도메인은 예를 들어, 도 3에 나타낸 바와 같은 G β-가닥의 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 영역을 포함하는, 아넬로벡터.
61. 실시형태 52에 있어서, G β-가닥은 적어도 약 1, 2 또는 3개 이상의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌 또는 라이신)를 포함하는, 아넬로벡터.
62. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, ORF1 분자는, 예를 들어, 표 N 내지 S 및 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 N22 도메인의 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 N22 도메인을 포함하는, 아넬로벡터.
63. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, N22 도메인은 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N을 포함하며, 여기서 X n 은 각각 독립적으로 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열인, 아넬로벡터.
64. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, N22 도메인은 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N에 측접하는 제1 베타 가닥 및 제2 베타 가닥을 포함하며, 예를 들어, 제1 베타 가닥은 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N의 티로신(Y) 잔기를 포함하고/하거나, 제2 베타 가닥은 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N의 제2 아스파라긴(N) 잔기(N에서 C로)를 포함하는, 아넬로벡터.
65. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, ORF1 분자는 C-말단 도메인, 예를 들어, 표 N 내지 S 및 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 C-말단 도메인의 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하는, 아넬로벡터.
66. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소에는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 인코딩하는 서열이 결여되어 있는, 아넬로벡터.
67. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소에는 아넬로바이러스 ORF2 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 인코딩하는 서열이 결여되어 있는, 아넬로벡터.
68. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소에는 아넬로바이러스 ORF3 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 인코딩하는 서열이 결여되어 있는, 아넬로벡터.
69. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 아넬로벡터는 유전 요소를 세포(예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포)로 운반하도록 구성되는, 아넬로벡터.
70. 실시형태 69에 있어서, 적어도 1000개의 아넬로벡터의 집단은 적어도 약 100개의 카피(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000 또는 1,000,000개의 카피)의 유전 요소를 하나 이상의 세포 내로 운반할 수 있는, 아넬로벡터.
71. 실시형태 69 또는 70에 있어서, 아넬로벡터의 집단(예를 들어, 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 게놈 당량의 유전 요소)은 유전 요소를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상의 세포의 집단 내로 운반할 수 있는, 아넬로벡터.
72. 실시형태 69 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 아넬로벡터의 집단(예를 들어, 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 게놈 당량의 유전 요소)은 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 8,000, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107개 또는 이상의 카피의 유전 요소를 세포의 집단에 운반할 수 있는, 아넬로벡터.
73. 실시형태 69 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 아넬로벡터의 집단(예를 들어, 세포당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 게놈 당량의 유전 요소)은 세포당 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 1000, 1000 내지 104, 1 x 104 내지 1 x 105, 1 x 104 내지 1 x 106, 1 x 104 내지 1 x 107, 1 x 105 내지 1 x 106, 1 x 105 내지 1 x 107 또는 1 x 106 내지 1 x 107개의 카피의 유전 요소를 세포의 집단에 운반할 수 있는, 아넬로벡터.
74. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 아넬로벡터는 요망되는 세포 유형, 조직 또는 기관(예를 들어, 골수, 혈액, 심장, GI, 피부, 망막 내의 광수용기, 상피 내벽 또는 췌장)에 이펙터를 선택적으로 운반하는 또는 그 내에서 더 높은 수준으로 존재하는(예를 들어, 그 내에 우선적으로 축적되는), 아넬로벡터.
75. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 RNase에 의한(예를 들어, 단백질성 외부에 의한) 소화로부터 보호되거나 이에 저항성인, 아넬로벡터.
76. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 단백질성 외부 내에 봉입된 유전 요소는 엔도뉴클레아제 소화, 예를 들어, RNase 소화에 대해 저항성인, 아넬로벡터.
77. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 프로모터 요소를 포함하는, 아넬로벡터.
78. 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 유전 요소는 단백질 결합 서열을 포함하는, 아넬로벡터.
79. 실시형태 78에 있어서, 단백질 결합 서열은 ORF1 분자에 결합할 수 있는, 아넬로벡터.
80. 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 복수의 아넬로벡터를 포함하는 조성물.
81. 실시형태 80에 있어서, 조성물에 ORF1 분자를 포함하는 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 단백질성 외부는 유전 요소의 적어도 하나의 카피를 포함하는, 조성물.
82. 실시형태 80에 있어서, 조성물에 ORF1 분자를 포함하는 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 단백질성 외부는 아넬로벡터 유전 요소의 적어도 하나의 카피를 포함하는, 조성물.
83. 실시형태 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 적어도 102, 103, 104, 104, 105, 106 또는 107개의 동일한 아넬로벡터를 포함하는, 조성물.
84. 실시형태 80 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 복수는 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개의 아넬로벡터(예를 들어, 아넬로벡터의 카피)를 포함하거나; 조성물은 mL당 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개의 아넬로벡터 게놈을 포함하는, 조성물.
85. 실시형태 80 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 다음의 특징 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 갖는, 조성물:
a) 조성물은 약제학적 또는 우수 제조관리 기준(GMP: good manufacturing practice) 표준을 충족함;
b) 조성물은 우수 제조관리 기준(GMP)에 따라 제조됨;
c) 조성물은 사전결정된 기준 값 미만의 병원체 수준을 가짐, 예를 들어, 실질적으로 병원체가 없음;
d) 조성물은 사전결정된 기준 값 미만의 오염물질 수준을 가짐, 예를 들어, 실질적으로 오염물질(예를 들어, 변성제, 예를 들어, 요소)이 없음;
e) 조성물은 사전결정된 비-감염성 입자의 수준 또는 사전결정된 입자:감염성 유닛의 비(예를 들어, 300:1 미만, 200:1 미만, 100:1 미만 또는 50:1 미만)를 갖거나,
f) 조성물은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 낮은 면역원성을 갖거나, 실질적으로 비-면역원성임;
선택적으로 여기서 조성물은 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.5 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M 또는 2 M 미만의 농도의 요소를 포함함.
86. 실시형태 80 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물은 사전결정된 기준 값 미만의 오염물질 수준을 갖는, 예를 들어, 오염물질이 실질적으로 없는, 조성물.
87. 실시형태 80 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.5 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M 또는 2 M 미만의 농도의 요소를 포함하는, 조성물.
88. 실시형태 86 또는 87에 있어서, 오염물질은 마이코플라스마, 내독소, 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 DNA 및/또는 숙주 세포 RNA), 동물-유래 프로세스 불순물(예를 들어, 혈청 알부민 또는 트립신), 복제-적격 제제(RCA), 예를 들어, 복제-적격 바이러스 또는 원치 않는 아넬로벡터(예를 들어, 요망되는 아넬로벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 합성 아넬로벡터 이외의 아넬로벡터), 유리 바이러스 캡시드 단백질, 외래성 물질(adventitious agent) 및/또는 응집물 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
89. 실시형태 80 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 중량 기준 10% 미만(예를 들어, 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만)의 오염물질을 포함하는, 조성물.
90. 실시형태 80 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 적어도 90%의 단백질성 외부는 동일한 유전 요소(예를 들어, 아넬로벡터의 유전 요소)를 포함하는, 조성물.
91. 실시형태 80 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 적어도 90%의 단백질성 외부는 동일한 ORF1 분자를 포함하는, 조성물.
92. 아넬로벡터 또는 전술한 실시형태 중 임의의 것의 조성물, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
93. 아넬로벡터의 제조 방법으로서, 방법이
(a) 다음을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계:
(i) RNA를 포함하는 유전 요소, 및
(ii) ORF1 분자; 그리고
(b) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부 내에 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건 하에서 혼합물을 항온처리하며, 이에 따라 아넬로벡터를 제조하는 단계를 포함하며;
선택적으로 혼합물은 세포에 포함되지 않는, 방법.
94. 실시형태 93에 있어서, (a)를 제공하기 전에, 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포 또는 포유동물 세포)에서 ORF1 분자를 발현하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
95. 실시형태 94에 있어서, 발현은 ORF1 분자를 생성하기에 적합한 조건 하에서 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 배큘로바이러스 발현 벡터)를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포 또는 포유동물 세포)를 항온처리하는 단계를 포함하는, 방법.
96. 실시형태 94 또는 95에 있어서, (a)를 제공하기 전에 숙주 세포에 의해 발현된 ORF1 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
97. 아넬로벡터를 정제하는 방법으로서, 방법이
(a) 다음을 포함하는 아넬로벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)를 제공하는 단계:
(i) 유전 요소, 예를 들어, RNA를 포함하는 유전 요소, 및
(ii) 단백질성 외부로서, ORF1 분자를 포함하며, 유전 요소를 봉입하는, 단백질성 외부; 그리고
(b) 아넬로벡터를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
98. 실시형태 96 또는 97에 있어서, 정제(예를 들어, ORF1 분자의 정제 또는 아넬로벡터의 정제)는 친화도 정제, 예를 들어, 헤파린 친화도 정제를 포함하는, 방법.
99. 실시형태 96 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 정제(예를 들어, ORF1 분자의 정제 또는 아넬로벡터의 정제)는 크기 배제 크로마토그래피(예를 들어, 트리스 완충액 이동상을 사용함)를 포함하는, 방법.
100. 실시형태 96 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 정제(예를 들어, ORF1 분자의 정제 또는 아넬로벡터의 정제)는 친화도 정제(예를 들어, 헤파린 친화도 정제)에 이어서 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
101. 실시형태 96 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 정제(예를 들어, ORF1 분자의 정제 또는 아넬로벡터의 정제)는 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, Mustang Q 막 크로마토그래피)를 포함하는, 방법.
102. 실시형태 96 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 정제(예를 들어, ORF1 분자의 정제 또는 아넬로벡터의 정제)는 혼합 모드 크로마토그래피(예를 들어, 혼합 모드 수지, 예를 들어, Cato700 수지를 사용함)를 포함하는, 방법.
103. 실시형태 96 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 정제(예를 들어, ORF1 분자의 정제 또는 아넬로벡터의 정제)는 ORF1 분자의, 적어도 약 20, 30, 40, 50 또는 60개의 카피, 또는 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50 또는 50 내지 60개의 카피를 포함하는 하나 이상의 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 조성물을 생성하는, 방법.
104. 실시형태 103에 있어서, 적어도 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 바이러스-유사 입자는 60 mer이거나 적어도 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 nm의 직경의 입자인 단백질성 외부를 포함하는, 방법.
105. 실시형태 103에 있어서, 조성물은 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010개의 입자/mL를 포함하거나, 105 내지 106, 106 내지 107, 107 내지 109, 108 내지 109, 109 내지 1010, 또는 1010 내지 1011개의 입자/mL(예를 들어, 전자 현미경에 의해 측정되는 바와 같음)을 포함하는, 방법.
106. 실시형태 93 내지 105 중 어느 하나에 있어서, (a)를 제공하기 전에, ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부(예를 들어, 바이러스-유사 입자(VLP))의 분해(disassembly)에 적합한 조건 하에서 ORF1 분자를 항온처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
107. 실시형태 106에 있어서, ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부의 분해에 적합한 조건은 변성제의 존재 하에서의 항온처리를 포함하는, 방법.
108. 실시형태 106 또는 107항에 있어서, 변성제는 카오트로픽제(chaotropic agent)(예를 들어, 요소), 또는 세제(예를 들어, SDS(예를 들어, 0.1% SDS), Tween 또는 Triton)를 포함하는, 방법.
109. 실시형태 106 내지 108 중 어느 하나에 있어서, ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부의 분해에 적합한 조건은 사전결정된 전도도, 고염 용액(예를 들어, NaCl을 포함하는 용액, 예를 들어, 적어도 약 1 M, 예를 들어, 적어도 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4 또는 5 M의 농도), 열(예를 들어, 약 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95℃ 초과의 온도) 또는 pH(예를 들어, 산성 pH 또는 염기성 pH)를 포함하는, 방법.
110. 실시형태 106 내지 109 중 어느 하나에 있어서, ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부의 분해에 적합한 조건은 적어도 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.5 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M 또는 2 M의 농도의 요소를 포함하는 용액 중에서의 항온처리를 포함하는, 방법.
111. 실시형태 106 내지 110 중 어느 하나에 있어서, (b)의 항온처리는 분해될 ORF1 분자 또는 그의 카피를 포함하는, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 96% 또는 100%의 입자의 집단을 초래하는, 방법.
112. 실시형태 106 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 단백질성 외부의 분해에 적합한 조건은 ORF1 분자의, 적어도 약 20, 30, 40, 50 또는 60개의 카피, 또는 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50 또는 50 내지 60개의 카피를 포함하는 복합체(예를 들어, 단백질성 외부)를 분해하기에 충분한, 방법.
113. 실시형태 106 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 단백질성 외부의 분해에 적합한 조건은 108개 미만의 남아 있는 온전한 입자/mL를 초래하는, 방법.
114. 실시형태 106 내지 113 중 어느 하나에 있어서, (a)를 제공하기 전에, 단백질성 외부의 분해에 적합한 조건으로부터 ORF1 분자를 제거하는 단계(예를 들어, ORF1 분자가 비-변성 조건을 거치게 하는 단계)를 추가로 포함하는, 방법.
115. 실시형태 114에 있어서, 단백질성 외부의 분해에 적합한 조건으로부터 ORF1 분자를 제거하는 단계는 변성제의 농도를 감소시키는 단계, 예를 들어, 변성제(예를 들어, 요소)의 농도를 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.5 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M 또는 2 M 미만으로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
116. 실시형태 114 또는 115에 있어서, 제거는 적어도 하나의 카피(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 카피)의 유전 요소(예를 들어, mRNA)를 각각 봉입하는 하나 이상의 아넬로벡터의 형성을 초래하는, 방법.
117. 실시형태 116에 있어서, 생성된 용액 내의 유전 요소의 적어도 하나의 카피를 봉입하는 아넬로벡터의 수는 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010 또는 1011개이거나; 105 내지 106, 106 내지 107, 107 내지 109, 108 내지 109, 109 내지 1010, 또는 1010 내지 1011개(예를 들어, 전자 현미경에 의해 측정되는 바와 같음)인, 방법.
118. 실시형태 116에 있어서, 생성된 용액 내의 유전 요소의 적어도 하나의 카피를 봉입하는 아넬로벡터의 수는 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010 또는 1011개의 아넬로벡터/mL이거나; 105 내지 106, 106 내지 107, 107 내지 109, 108 내지 109, 109 내지 1010, 또는 1010 내지 1011개의 아넬로벡터/mL(예를 들어, 전자 현미경에 의해 측정되는 바와 같음)인, 방법.
119. 실시형태 114 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 제거는 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010 또는 1011개의 아넬로벡터/mL; 또는 105 내지 106, 106 내지 107, 107 내지 109, 108 내지 109, 109 내지 1010, 또는 1010 내지 1011개의 아넬로벡터/mL(예를 들어, 전자 현미경에 의해 측정되는 바와 같음)을 포함하는 용액을 초래하며, 여기서 아넬로벡터 각각은 적어도 하나의 카피(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 카피)의 유전 요소(예를 들어, mRNA)를 봉입하는, 방법.
120. 실시형태 114 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 적어도 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아넬로벡터는, 60 mer 또는 입자이거나 적어도 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 nm의 직경의 입자인 단백질성 외부를 포함하는, 방법.
121. 실시형태 93 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 아넬로벡터의 유전 요소는 엔도뉴클레아제(예를 들어, RNase)에 대해 저항성인, 방법.
122. 실시형태 93 내지 121 중 어느 하나에 있어서, (a)는 (i) 및 (ii)를 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
123. 실시형태 93 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 무세포 시스템에서 수행되는, 방법.
124. 아넬로벡터 조성물의 제조 방법으로서,
(a) 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따른 복수의 아넬로벡터 또는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로, 다음 중 하나 이상에 대하여 복수를 평가하는 단계: 본원에 기재된 오염물질, 광학 밀도 측정치(예를 들어, OD 260), (예를 들어, HPLC에 의한) 입자 개수, 감염성(예를 들어, 형광 및/또는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같은, 예를 들어, 입자:감염성 유닛 비); 및
c) 예를 들어, (b)의 파라미터 중 하나 이상이 명시된 임계값을 만족한다면, 복수의 아넬로벡터를 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
125. 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 방법은 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 아넬로벡터 또는 조성물을 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 질병 또는 장애(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
126. 대상체에서 생물학적 기능(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 조절, 예를 들어, 향상 또는 억제하는 방법으로서, 방법은 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 아넬로벡터 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
127. 유전 요소를 세포에 운반하는 방법으로서, 방법은 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 아넬로벡터 또는 조성물을 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
128. 대상체에서 질병 또는 장애(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)를 치료하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 아넬로벡터 또는 조성물의 용도.
129. 대상체에서 질병 또는 장애(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 아넬로벡터 또는 조성물.
130. 대상체에서의 질병 또는 장애(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 아넬로벡터 또는 조성물.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점이 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그들 전문이 참조로 포함된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐이며, 제한하려는 것이 아니다.
도 1은 아넬로바이러스 균주로부터의 재조합 캡시드 단백질이 시험관 내에서 바이러스-유사 입자(VLP)를 형성함을 보여주는 일련의 전자 현미경 사진이다. 상이한 세포주에서 생성된 캡시드 단백질은 음성 염색 전자 현미경에 의해 관찰되는 바와 같이 시험관 내에서 VLP를 형성한다. (A) 대략 35 nm의 관찰된 직경을 갖는 곤충 세포로부터 정제된 고리 2 ORF1 VLP. (B) 대략 35 nm의 관찰된 직경을 갖는 곤충 세포로부터 정제된 고리 10 ORF1 VLP. (C) 대략 20 nm의 관찰된 직경을 갖는 포유동물 세포로부터 정제된 CAV VP1 VLP.
도 2는 부리 및 깃털 질병 바이러스(BFDV)의 구조에서 관찰된 8개의 베타-가닥 젤리 롤 도메인(또는 젤리 롤 폴드)을 나타낸 다이어그램이다. 관례에 따라, 베타 가닥은 B에서 I로 표지된다. 가닥은 B-I-D-G 및 C-H-E-F의 배향을 갖는 4개의 역평행 베타 시트를 형성한다. B-I-D-G 시트는 바이러스 캡시드의 내부를 형성한다.
도 3은 부리 및 깃털 질병 바이러스(BFDV)/E형 간염 캡시드 단백질(HepE)의 젤리 롤 도메인과 비교하여 아넬로바이러스 ORF1 단백질에 대한 젤리 롤 서열을 도시하는 아미노산 서열 정렬이다.
도 4a 내지 도 4e는 eGFP를 인코딩하는 mRNA 분자를 봉입하는 아넬로바이러스 ORF1 단백질-기반 바이러스-유사 입자(VLP)를 생성하는 예시적인 방법을 보여주는 일련의 다이어그램이다. 도 4a: ORF1 단백질을 세포에서 생성하고 본원에 기재된 바와 같이 단리하였다. 도 4b: 그런 다음, ORF1 단백질로부터 형성된 VLP를 2 M 요소 용액에서 분해시켰다. 도 4c: 요소가 mRNA의 부재 하에 제거되었을 때, VLP가 거의 재형성되지 않았다(전자 현미경에 의해 검출된 108개 입자/mL 미만의 역가). 도 4d, 도 4e: 요소가 eGFP를 인코딩하는 mRNA의 존재 하에 제거되었을 때, 상당한 양의 VLP(1x109 내지 1x1010개 입자/mL의 역가)가 전자 현미경(EM)에 의해 검출되었다.
본 발명의 실시형태의 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독하는 경우 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 예시의 목적을 위하여, 본원에 예시된 실시형태가 도면에 나타나 있다. 그러나, 본 발명이 도면에 나타낸 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음을 이해해야 한다.
정의
본 발명은 특정 실시형태에 대해 그리고 특정 도면을 참조하여 설명될 것이지만 본 발명은 이것에 한정되지 않고, 청구범위에 의해서만 한정된다. 이하에 기재된 용어는 일반적으로 다르게 지시되지 않는 한 그들의 일반적인 의미로 이해될 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 청구범위에서 "포함하다"라는 용어가 사용되는 경우, 이는 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, "로 이루어지다"라는 용어는 "구성된다"라는 용어의 바람직한 실시형태인 것으로 간주된다. 이하에서 그룹이 적어도 특정 개수의 실시형태를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이것은 또한 바람직하게는 이들 실시형태만으로 이루어지는 그룹을 개시하는 것으로 이해될 것이다.
단수 명사를 언급할 때, 부정 관사 또는 정관사, 예를 들어, 하나의("a", "an") 또는 상기("the")가 사용되는 경우, 이것은 그 밖의 어떤 것이 특별히 언급되지 않는 한, 그 명사의 복수형을 포함한다.
용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 표기된 치료, 조절 등의 목적에 적합한 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭함을 이해할 것이다. 용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 추가로 일 실시형태로서, 이러한 화합물, 조성물, 생성물 등이 치료, 조절 등에 사용하기 위한 것임을 개시한다.
용어 "...에 사용하기 위한 화합물, 조성물, 생성물 등", "...를 위한 의약, 약제학적 조성물, 수의학적 조성물, 진단적 조성물 등의 제조에서의 화합물, 조성물, 생성물 등의 용도", 또는 "의약으로서 사용하기 위한 화합물, 조성물, 생성물 등..."은 이러한 화합물, 조성물, 생성물 등이 인간 또는 동물 신체에서 실시될 수 있는 치료적 방법에 사용될 것임을 나타낸다. 그들은 치료 방법 등에 관한 실시형태 및 청구범위의 동등한 개시로서 간주된다. 따라서, 실시형태 또는 청구범위가 "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물을 치료하는 데 사용하기 위한 화합물"을 지칭한다면, 이것은 또한 "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 화합물의 용도" 또는 "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물로의 화합물의 투여에 의한 치료 방법"의 개시인 것으로 간주된다. 용어 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 표기된 치료, 조절 등의 목적에 적합한 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭함을 이해할 것이다.
기간, 값, 수 등의 하기의 예가 괄호 안에 제공된다면, 이것은 괄호 안에 언급된 예가 실시형태를 구성할 수 있다는 표시로서 이해해야 한다. 예를 들어, "실시형태들에서, 핵산 분자가 표 1의 아넬로바이러스 ORF1-인코딩 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 571 내지 2613)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다"고 언급된다면, 일부 실시형태는 표 1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 571 내지 2613에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭"은 하나 이상의 추가의 카피의 핵산 분자 또는 그의 일부(예를 들어, 유전 요소 또는 유전 요소 영역)를 생성하기 위한, 핵산 분자 또는 그의 일부의 복제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 증폭은 핵산 서열의 부분 복제를 초래한다. 일부 실시형태에서, 증폭은 회전원 복제(rolling circle replication)를 통해 발생한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아넬로벡터"는 단백질성 외부에 봉입된 유전 요소, 예를 들어, RNA, 예를 들어, 환형 RNA를 포함하는 비히클을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단백질성 외부에 의해 RNase를 사용하는 소화로부터 실질적으로 보호된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "합성 아넬로벡터"는 일반적으로, 자연 발생이 아닌, 예를 들어, 야생형 바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스)에 비하여 상이한 서열을 갖는 아넬로벡터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 합성 아넬로벡터는 엔지니어링되거나 또는 재조합이며, 예를 들어, 야생형 바이러스 게놈(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 게놈)에 비하여 차이 또는 변형을 포함하는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부 내의 봉입은 단백질성 외부에 의한 100% 커버리지, 및 100% 미만, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 그 미만의 커버리지를 포괄한다. 유전 요소가 예를 들어, 숙주 세포로의 유입 이전에 단백질성 외부에 보유되거나 RNase를 사용하는 소화로부터 보호되는 한, 예를 들어, (예를 들어, 단백질성 외부를 물, 이온, 펩티드 또는 소분자에 대해 투과 가능하게 만드는) 갭 또는 불연속부가 단백질성 외부에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 정제되며, 예를 들어, 아넬로벡터는 그의 원래의 공급원으로부터 분리되고/분리되거나 다른 구성성분이 실질적으로 없다(50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과). 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 (예를 들어, 감염을 통해) 표적 세포 내로 유전 요소를 도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로바이러스 ORF1 분자와 같은 특정 아넬로바이러스 요소를 함유하는 감염성 합성 바이러스 입자이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 단백질, 예를 들어, 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편을 지칭한다. 용어 "항체 분자"는 전장 항체 및 항체 단편(예를 들어, scFv)을 포괄한다. 일부 실시형태에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이며, 예를 들어, 항체 분자는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 복수의 것들 중 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지며, 복수의 것들 중 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체 분자는 일반적으로 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열에 의해 특성화된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "백본" 또는 "백본 영역"은 숙주 세포에서 핵산 분자의 복제 및/또는 유지에 관여된(예를 들어, 이에 필요하고/하거나 충분한) 하나 이상의 요소를 포함하는, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 박미드 또는 공여자 벡터 내의) 핵산 분자 내의 영역을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "배큘로바이러스 백본 영역"과 같은 백본 영역은 예를 들어, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)에서 핵산 작제물의 복제에 적합한 하나 이상의 배큘로바이러스 요소(예를 들어, 배큘로바이러스 게놈 또는 그의 기능적 단편)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 백본은 선택 가능한 마커를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 유전 요소 영역 및 백본 영역(예를 들어, 배큘로바이러스 백본 영역 및/또는 박테리아 세포에서의 복제에 적합한 백본 영역)을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "박미드"는 곤충 세포에서의 복제에 적합하고 또한 박테리아 세포에서의 복제에 적합하도록 충분한 배큘로바이러스 백본 요소를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 세포, 예를 들어, DH 10Bac 세포)에서의 복제에 적합하다.
본원에 사용되는 바와 같이, "환형" 핵산은 자유 5' 또는 3' 말단이 없는 구조를 형성하는 핵산을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 환형 핵산은 공유 또는 비-공유 결합을 통해 폐쇄된다. 예를 들어, 환형 핵산은 선형 핵산의 말단을 예를 들어, 인산염-당 결합 또는 합성 링커 모이어티와 공유적으로 연결함으로써 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 환형 핵산은 근접하고 자유롭지 않은(실질적으로 엑소뉴클레아제에 접근할 수 없는) 2개의 말단을 포함한다. 예를 들어, 환형 핵산은 선형 핵산의 말단을 직접 또는 핵산 부목을 통해 혼성화시킴으로써 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "DNA 영역"은 복수의 DNA 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 가닥의 일부를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, DNA 영역은 RNA 가닥 내로 통합된 복수의 DNA 뉴클레오티드이다. 예를 들어, DNA 영역은 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 약 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90 또는 90 내지 100개의 DNA 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "인코딩"하는 핵산은 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, mRNA 또는 기능적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 비-코딩 RNA, 예를 들어, siRNA 또는 miRNA)를 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "외인성" 작용제(예를 들어, 이펙터, 핵산(예를 들어, RNA), 유전자, 페이로드, 단백질)는 상응하는 야생형 바이러스, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스에 의해 포함되지 않거나, 그에 의해 인코딩되지 않는 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 외인성 작용제, 예컨대, 자연 발생 단백질 또는 핵산에 비하여 (예를 들어, 삽입, 결실 또는 치환에 의해) 변경된 서열을 갖는 단백질 또는 핵산은 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지만, 바이러스에 대하여 외인성이다. 일부 실시형태에서, 외인성 작용제는 숙주 세포에서 자연적으로 존재하지만, 요망되는 수준으로 또는 요망되는 시간에 존재하지 않는다.
또 다른 작용제 또는 요소(예를 들어, 이펙터, 핵산 서열, 아미노산 서열)에 관하여 본원에 사용되는 바와 같은, "이종" 작용제 또는 요소(예를 들어, 이펙터, 핵산 서열, 아미노산 서열)는 천연적으로, 예를 들어, 야생형 바이러스, 예를 들어, 아넬로바이러스에서 함께 관찰되지 않는 작용제 또는 요소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이종 핵산 서열은 천연 발생 핵산 서열(예를 들어, 아넬로바이러스에서 천연적으로 발생하는 서열)과 동일한 핵산에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 작용제 또는 요소는 아넬로벡터의 다른(예를 들어, 나머지) 요소가 기반으로 하는 아넬로바이러스에 비하여 외인성이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전 요소"는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터를 형성하기 위해 단백질성 외부 내에 봉입되거나 봉입될 수 있는(예를 들어, 이에 의해 RNase 소화로부터 보호됨) 핵산 분자를 지칭한다. 유전 요소는 네이키드 RNA로서 생성될 수 있고, 선택적으로 추가로 단백질성 외부 내로 어셈블될 수 있음이 이해된다. 또한, 아넬로벡터는 그의 유전 요소를 세포 내로 삽입하여, 유전 요소가 세포 내에 존재하게 하고, 단백질성 외부가 반드시 세포에 유입되는 것은 아니라는 점이 이해된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "유전 요소 작제물"은 유전 요소 서열 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드, 박미드, 공여자 벡터, 코스미드 또는 미니서클)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 박미드 또는 공여자 벡터는 유전 요소 서열 또는 그의 단편을 포함하는 유전 요소 작제물이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전 요소 영역"은 유전 요소의 서열을 포함하는 작제물의 영역을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 영역은 단백질성 외부에 의해 봉입되며 이에 따라 아넬로벡터를 형성할, 야생형 아넬로바이러스 서열 또는 그의 단편에 대하여 충분한 동일성을 갖는 서열(예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 서열 또는 그의 단편에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소 영역은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 결합 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 5' UTR, 3' UTR 및/또는 GC-풍부 영역, 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 영역을 포함하는 작제물은 단백질성 외부에서 봉입되지 않지만, 작제물로부터 생성된 유전 요소는 단백질성 외부에서 봉입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 영역을 포함하는 작제물은 벡터 백본(예를 들어, 박미드 백본 또는 공여자 벡터 백본)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 작제물(예를 들어, 박미드)은 하나 이상의 배큘로바이러스 요소(예를 들어, 유전 요소 영역을 포함하는 예를 들어, 배큘로바이러스 게놈)를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이체"는 게놈(예를 들어, 아넬로바이러스 게놈) 또는 그의 단편과 관련하여 사용될 때 상응하는 야생형 아넬로바이러스 서열에 비하여 적어도 하나의 변화를 갖는 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 게놈 또는 그의 단편은 상응하는 야생형 아넬로바이러스 서열에 비하여 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 다형성, 부가, 결실 또는 프레임이동을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 게놈 또는 그의 단편은 상응하는 야생형 아넬로바이러스 서열에 비하여 적어도 하나의 아넬로바이러스 ORF(예를 들어, ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 및/또는 ORF1/2 중 하나 이상)의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 게놈 또는 그의 단편은 상응하는 야생형 아넬로바이러스 서열에 비하여 모든 아넬로바이러스 ORF(예를 들어, ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 및 ORF1/2 모두)의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 게놈 또는 그의 단편은 상응하는 야생형 아넬로바이러스 서열에 비하여 적어도 하나의 아넬로바이러스 비코딩 영역(예를 들어, 5' UTR, 3' UTR 및/또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 게놈 또는 그의 단편은 외인성 이펙터를 포함하거나, 이를 인코딩한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "ORF 분자"는 아넬로바이러스 ORF 단백질(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 및/또는 ORF1/2 단백질을 포함하는 폴리펩티드) 또는 그의 기능적 단편의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로 (즉, "ORF 분자"로) 사용되는 경우, 폴리펩티드는 본원에 기재된 아넬로바이러스 ORF 중 임의의 것(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 및/또는 ORF1/2 중 임의의 것) 또는 그의 기능적 단편의 활성 및/또는 구조적 특징을 포함할 수 있다. 특정 오픈 리딩 프레임(예를 들어, "ORF1 분자", "ORF2 분자", "ORF2/2 분자", "ORF2/3 분자", "ORF1/1 분자" 또는 "ORF1/2 분자")을 나타내기 위해 수식어와 함께 사용될 때, 이는 일반적으로 폴리펩티드가 상응하는 아넬로바이러스 ORF 단백질 또는 그의 기능적 단편(예를 들어, "ORF1 분자"에 대해 아래에 정의된 바와 같음)의 활성 및/또는 구조적 특징을 포함함을 의미한다. 예를 들어, "ORF2 분자"는 아넬로바이러스 ORF2 단백질 또는 그의 기능적 단편의 활성 및/또는 구조적 특징을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "ORF1 분자"는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질) 또는 그의 기능적 단편의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. ORF1 분자는 일부 예에서, 다음 중 하나 이상(예를 들어, 이 중 1, 2, 3 또는 4개)을 포함할 수 있다: 적어도 60%의 염기성 잔기(예를 들어, 적어도 60%의 아르기닌 잔기)를 포함하는 제1 영역, 적어도 약 6개의 베타 가닥(예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 베타 가닥)을 포함하는 제2 영역, 아넬로바이러스 N22 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 N22 도메인)의 구조 또는 활성을 포함하는 제3 영역 및/또는 아넬로바이러스 C-말단 도메인(CTD)(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 CTD)의 구조 또는 활성을 포함하는 제4 영역. 일부 예에서, ORF1 분자는 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1, 제2, 제3 및 제4 영역을 포함한다. 일부 예에서, 아넬로벡터는 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1, 제2, 제3 및 제4 영역을 포함하는 ORF1 분자를 포함한다. ORF1 분자는 일부 예에서, 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. ORF1 분자는 일부 예에서, 이종 서열, 예를 들어, 초가변 영역(HVR), 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 HVR을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은, "아넬로바이러스 ORF1 단백질"은 아넬로바이러스 게놈(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 게놈)에 의해 인코딩된 ORF1 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "ORF2 분자"는 아넬로바이러스 ORF2 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF2 단백질)의 활성 및/또는 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "아넬로바이러스 ORF2 단백질"은 아넬로바이러스 게놈(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 게놈)에 의해 인코딩된 ORF2 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질성 외부"는 주로(예를 들어, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과) 단백질인 외부 구성성분을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 핵산"은 발현 생성물을 인코딩하는 DNA 서열의 발현, 예를 들어, 전사 및/또는 번역을 변경시키는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 발현 생성물은 RNA 또는 단백질을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 서열"은 표적 유전자 생성물의 전사를 변경시키는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조절 서열은 프로모터 또는 인핸서이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 비-병원성인" 유기체, 입자 또는 구성성분은 예를 들어, 숙주 유기체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에서 받아들일 수 없는 질병 또는 병원성 질환을 야기하거나 유도하지 않는 유기체, 입자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 바이러스 또는 아넬로벡터) 또는 그의 구성성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체로의 아넬로벡터의 투여는 치료 기준의 일부로서 허용되는 부차 반응 또는 부작용을 초래할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "비-병원성"은 숙주 유기체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에서 바람직하지 않은 질환(예를 들어, 질병 또는 병원성 질환을 야기하거나 유도하지 않는 유기체 또는 그의 구성성분을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 비-통합성인" 유전 요소는 숙주 세포(예를 들어, 진핵 세포) 또는 유기체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간) 내로 유입되는 유전 요소 중 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% 또는 1% 미만이 게놈 내로 통합되는 유전 요소, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 바이러스 또는 아넬로벡터 내의 유전 요소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 예를 들어, 숙주 세포의 게놈 내로 검출 가능하게 통합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 게놈 내로의 유전 요소의 통합은 본원에 기재된 바와 같은 기법, 예를 들어, 핵산 서열결정, PCR 검출 및/또는 핵산 혼성화를 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 통합 빈도는 예를 들어, 문헌 [Wang et al. (2004, Gene Therapy 11: 711-721, 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)]에 기재된 바와 같이 유리 벡터로부터 분리된 게놈 DNA의 정량적 겔 정제 검정에 의해 측정된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 비-면역원성인" 유기체, 입자 또는 구성성분은 예를 들어, 숙주 조직 또는 유기체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서 요망되지 않는 또는 비표적화된 면역 반응을 야기하거나 유도하지 않는 유기체, 입자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 바이러스 또는 아넬로벡터) 또는 그의 구성성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 비-면역원성인 유기체, 입자 또는 구성성분은 임상적으로 유의한 면역 반응을 생성하지 않는다. 일부 실시형태들에서, 실질적으로 비-면역원성인 아넬로벡터는 아넬로바이러스 또는 아넬로벡서 유전 요소의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그의 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질에 대하여 임상적으로 유의한 면역 반응을 생성하지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역 반응(예를 들어, 요망되지 않는 또는 비표적화된 면역 반응)은 예를 들어, 문헌[Tsuda et al., 1999; J. Virol. Methods 77: 199-206](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV 항체 검출 방법 및/또는 문헌[Kakkola et al., 2008; Virology 382: 182-189](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV IgG 수준의 결정 방법에 따라 대상체에서 항체(예를 들어, 중화 항체) 존재 또는 수준(예를 들어, 항-아넬로벡터 항체의 존재 또는 수준, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터에 대한 항체의 존재 또는 수준)을 검정함으로써 검출된다. 아넬로바이러스 또는 그에 기반한 아넬로벡터에 대한 항체(예를 들어, 중화 항체)는 또한 항-바이러스 항체를 검출하기 위한 해당 분야의 방법, 예를 들어, 문헌[Calcedo et al., 2013; Front. Immunol. 4(341): 1-7](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 예를 들어, 항-AAV 항체의 검출 방법에 의해 검출될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "하위서열"은 각각 더 큰 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 포함되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 하위서열은 더 큰 서열의 도메인 또는 기능적 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하위서열은 더 큰 서열로부터 단리되는 경우, 더 큰 서열의 나머지와 함께 존재할 때 하위서열에 의해 형성되는 2차 및/또는 3차 구조와 유사한 2차 및/또는 3차 구조를 형성할 수 있는 더 큰 서열의 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하위서열은 또 다른 서열(예를 들어, 외인성 서열 또는 더 큰 서열의 나머지에 대하여 이종인 서열을 포함하는 하위서열, 예를 들어, 상이한 아넬로바이러스 유래의 상응하는 하위서열)에 의해 대체될 수 있다.
본 발명은 일반적으로 아넬로벡터, 예를 들어, 합성 아넬로벡터 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 아넬로벡터, 아넬로벡터를 포함하는 조성물, 및 아넬로벡터의 제조 또는 이용 방법을 제공한다. 아넬로벡터는 일반적으로 예를 들어, 치료제를 진핵 세포로 운반하기 위한 운반 비히클로서 유용하다. 일반적으로, 본원에 기재된 아넬로벡터는 단백질성 외부 내에 봉입된 RNA 서열(예를 들어, 이펙터, 예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터를 인코딩하는 RNA 서열)을 포함하는 유전 요소를 포함할 것이다. 아넬로벡터는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 아넬로바이러스 서열에 비한 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 영역 또는 도메인)의 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 아넬로벡터는 예를 들어, 세포를 포함하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위하여, 유전 요소 또는 그 내에 인코딩된 이펙터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산 이펙터)를 진핵 세포 내로 운반하기 위한 실질적으로 비-면역원성인 비히클로서 사용될 수 있다.
목차
I. 시험관 내 어셈블리에 의한 아넬로벡터 제조용 조성물 및 방법
A. 아넬로벡터의 구성성분 및 어셈블리
i. 아넬로벡터의 어셈블리를 위한 ORF1 분자
ii. 아넬로벡터의 어셈블리를 위한 ORF2 분자
B. 유전 요소
i. RNA를 포함하는 유전 요소
a. RNA-전용 유전 요소
b. 혼성화된 RNA-ssDNA 유전 요소
c. RNA/DNA 컨쥬게이트
C. 유전 요소 작제물
D. RNA-기반 유전 요소의 생성
E. 단백질 구성성분의 생성
i. 배큘로바이러스 발현 시스템
ii. 곤충 세포 시스템
iii. 포유동물 세포 시스템
F. 이펙터
G. 시험관 내 어셈블리 방법
H. 농축 및 정제
II. 아넬로벡터
A. 아넬로바이러스
B. ORF1 분자
C. ORF2 분자
D. 유전 요소
E. 단백질 결합 서열
F. 5' UTR 영역
G. GC-풍부 영역
H. 이펙터
I. 조절 서열
J. 기타 서열
K. 단백질성 외부
III. 이용 방법
IV. 투여/운반
I. 시험관 내 어셈블리에 의한 아넬로벡터 제조용 조성물 및 방법
본 개시내용은, 일부 양태에서, 아넬로벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, RNA를 포함하는 유전 요소를 갖는 아넬로벡터를 생성하기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 유전 요소 또는 유전 요소 작제물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 시험관 내 어셈블리에 의해 유전 요소 또는 유전 요소 작제물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF 분자(예를 들어, ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2 분자, 또는 그의 기능적 단편 또는 스플라이스 변이체)를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포, 예를 들어, Sf9 세포)에서 단백질성 외부 또는 그의 구성성분(예를 들어, ORF1 분자)을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
아넬로벡터의 구성성분 및 어셈블리
본원의 조성물 및 방법은 아넬로벡터를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 아넬로벡터는 일반적으로 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는) 단백질성 외부 내에 봉입된 유전 요소(예를 들어, RNA 분자)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 아넬로바이러스 ORF(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2 중 하나 이상)를 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 아넬로바이러스 ORF 또는 ORF 분자(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1, 또는 ORF1/2)는 예를 들어, PCT/US2018/037379호 또는 PCT/US19/65995호(이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 상응하는 아넬로바이러스 ORF 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소는 아넬로바이러스 ORF1, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어, 젤리-롤 영역)을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 아넬로바이러스 ORF1 핵산(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 분자 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편)에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 단백질성 외부(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 내에 유전 요소(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)를 봉입함으로써 어셈블된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포, 예를 들어, Sf9 세포)에서 단백질성 외부 내에 봉입되어 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 단백질성 외부에 포함된 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 예를 들어, ORF1 분자)를 발현한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 아넬로바이러스 ORF1 분자, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 폴리펩티드의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 야생형 아넬로바이러스 ORF1 단백질 또는 야생형 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로바이러스 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에 포함된 핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스, 미니서클, 박미드 또는 인공 염색체)에 포함된다. 실시형태들에서, 아넬로바이러스 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 유전 요소 및/또는 유전 요소의 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 작제물은 플라스미드, 바이러스 핵산, 미니서클, 박미드 또는 인공 염색체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 핵산 작제물(예를 들어, 박미드)로부터 절제되고, 선택적으로, (예를 들어, 변성에 의해) 이중-가닥 형태로부터 단일-가닥 형태로 전환된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 핵산 작제물(예를 들어, 박미드)의 주형 서열에 기반한 중합효소에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 유전 요소 서열의 단일-가닥 카피를 생성하며, 이는 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소를 형성하기 위해 선택적으로 환화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 유전 요소 작제물(예를 들어, 박미드, 플라스미드 또는 미니서클) 및 아넬로바이러스 ORF 분자(예를 들어, ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 및/또는 ORF1/2 ORF 분자) 또는 그의 기능적 단편을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함하는 박미드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부 단백질은 박미드로부터 발현된다. 실시형태들에서, 박미드로부터 발현된 단백질성 외부 단백질은 유전 요소를 봉입하며, 이에 따라 아넬로벡터를 형성한다. 일부 실시형태에서, 박미드는 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)에서의 핵산 작제물의 복제에 적합한 백본, 예를 들어, 배큘로바이러스 백본 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 박미드는 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이 세포, 예를 들어, DH 10Bac 세포)에서의 유전 요소 작제물의 복제에 적합한 백본 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)에서의 핵산 작제물의 복제에 적합한 백본, 예를 들어, 배큘로바이러스 백본 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이 세포, 예를 들어, DH 10Bac 세포)에서의 유전 요소 작제물의 복제에 적합한 백본 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 박미드는 배큘로바이러스 입자를 통해 숙주 세포 내로 도입된다. 실시형태들에서, 박미드는 생성자 세포, 예를 들어, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 또는 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이 세포, 예를 들어, DH 10Bac 세포)에 의해 생성된다. 실시형태들에서, 생성자 세포는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 박미드 및/또는 공여자 벡터를 포함한다. 실시형태들에서, 생성자 세포는 박미드 및/또는 공여자 벡터의 복제를 위한 충분한 세포 기구를 추가로 포함한다.
예를 들어, 아넬로벡터의 어셈블리를 위한 ORF1 분자
아넬로벡터는 예를 들어, 단백질성 외부 내에 유전 요소를 봉입함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 봉입은 무세포 시스템 또는 세포에서 발생한다. 아넬로벡터의 단백질성 외부는 일반적으로 아넬로바이러스 ORF1 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 분자 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편)에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함한다. ORF1 분자는, 일부 실시형태에서, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 아르기닌 풍부 영역, 예를 들어, 적어도 60% 염기성 잔기(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 염기성 잔기; 예를 들어, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 70% 내지 90% 또는 70 내지 80% 염기성 잔기)를 갖는 영역을 포함하는 제1 영역, 및 젤리-롤 도메인, 예를 들어, 적어도 6개의 베타 가닥(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 베타 가닥)을 포함하는 제2 영역. 실시형태들에서, 단백질성 외부는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 모두)의 아넬로바이러스 ORF1 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 영역, N22 도메인, 초가변 영역 및/또는 C-말단 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 아넬로바이러스 ORF1 젤리-롤 영역(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 아넬로바이러스 ORF1 아르기닌-풍부 영역(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 아넬로바이러스 ORF1 N22 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 아넬로바이러스 초가변 영역(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 아넬로바이러스 ORF1 C-말단 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 ORF1 분자 및/또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일반적으로, ORF1 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질) 또는 그의 기능적 단편의 구조적 특징 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질)에 비하여 절단(truncation)을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 또는 700개의 아미노산에 의해 절단된다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 알파토르크바이러스, 베타토르크바이러스 또는 감마토르크바이러스 ORF1 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. ORF1 분자는 일반적으로, 핵산 분자, 예컨대, DNA(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 유전 요소)에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 세포의 핵에 국소화된다. 특정 실시형태에서, ORF1 분자는 세포의 핵소체에 국소화된다.
이론에 결부시키고자 하지 않고, ORF1 분자는 다른 ORF1 분자에 결합하여, 예를 들어, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 단백질성 외부를 형성하는 능력이 있을 수 있다. 이러한 ORF1 분자는 캡시드를 형성하는 능력을 갖는 것으로서 설명될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 봉입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 ORF1 분자는 다합체를 형성하여, 예를 들어, 단백질성 외부를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다합체는 동종다합체일 수 있다. 다른 실시형태에서, 다합체는 이종다합체일 수 있다.
예를 들어, 아넬로벡터의 어셈블리를 위한 ORF2 분자
본원에 기재된 조성물 또는 방법을 사용하여 아넬로벡터를 생성하는 것은 아넬로바이러스 ORF2 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편의 발현을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 ORF2 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편, 및/또는 ORF2 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 ORF2 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편, 및/또는 ORF2 분자를 인코딩하는 핵산, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터를 생성하는 것은 ORF2 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편의 발현을 포함하지만, ORF2 분자는 아넬로벡터 내로 통합되지 않는다.
유전 요소
RNA를 포함하는 유전 요소
일부 실시형태에서, 유전 요소는 핵산이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 하나 이상의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 RNA 헤어핀 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 mRNA, 예를 들어, 화학적으로 변형된 mRNA이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% RNA로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA 가닥 및 RNA 가닥을 포함하며, 예를 들어, DNA 가닥의 적어도 일부는 RNA 가닥의 적어도 일부에 혼성화된다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3 중 임의의 것을 인코딩하지 않는다.
일부 실시형태에서, RNA 유전 요소는 이펙터, 예를 들어, 이펙터 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, RNA 유전 요소는 이펙터, 예를 들어, 기능적 RNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA는 mRNA, rRNA, tRNA(예를 들어, TREM), 조절 RNA, 비-코딩 RNA, 긴 비-코딩 RNA(lncRNA), 환형 RNA(circRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 가이드 RNA(gRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 피위-상호작용 RNA(piRNA), 작은 핵소체 RNA(snoRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 세포외 RNA(exRNA), 작은 카잘체-특이적 RNA(scaRNA), 마이크로RNA(miRNA) 및 기타 RNAi 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 RNA, 예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소의 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, RNA는 하나 이상의 염기에 대하여 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA는 하나 이상의 당에 대하여 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소의 RNA의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, RNA는 하나 이상의 백본 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은 비-자연 발생 변형, 예를 들어, 표 5 내지 9 중 어느 하나에 기재된 변형을 포함한다. 비-자연 발생 변형은 당업계에 알려진 방법에 따라 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 표 5에 제공된 비-자연 발생 변형 또는 이들의 조합을 포함한다.
표 5: 예시적인 비-자연 발생 변형
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 표 6에 제공된 변형 또는 이들의 조합을 포함한다. 표 6에 제공된 변형은 RNA에서 자연적으로 발생하며, 자연에서 발생하지 않는 위치에서의 유전 요소의 변형이 본원에서 사용될 수 있다.
표 6: 추가의 예시적인 변형
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
일 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 표 7에 제공된 비-자연 발생 변형 또는 이들의 조합을 포함한다.
표 7: 추가의 예시적인 비-자연 발생 변형
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
일 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 표 8에 제공된 비-자연 발생 변형 또는 이들의 조합을 포함한다.
표 8: 예시적인 백본 변형
Figure pct00029
일 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 표 9에 제공된 비-자연 발생 변형 또는 이들의 조합을 포함한다.
표 9: 예시적인 비-자연 발생 백본 변형
Figure pct00030
일부 실시형태에서, 유전 요소는 캡을 포함한다. 캡은 전형적으로 mRNA의 5' 말단에 위치하지만, 캡은 RNA의 3' 말단에도 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡은 엑소뉴클레아제 분해로부터 유전 요소를 보호하고, 세포 내 운반 및/또는 국소화를 도울 수 있다. 캡은 5'-말단(5'-캡) 또는 3'-말단(3'-캡)에 존재할 수 있거나, 두 말단 모두에 존재할 수 있다. 5'-캡의 비-제한적인 예는 글리세릴, 역전 데옥시 탈염기성 잔기(모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드; 카보사이클릭 뉴클레오티드; 1,5-안하이드로헥시톨(anhydrohexitol) 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트 연결; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비환식 3',4'-세코 뉴클레오티드; 비환식 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 비환식 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'-역전 뉴클레오티드 모이어티; 3'-3'-역전 탈염기성 모이어티; 3'-2'-역전 뉴클레오티드 모이어티; 3'-2'-역전 탈염기성 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 3'-포스포르아미데이트; 헥실포스페이트; 아미노헥실 포스페이트; 3'-포스페이트; 3'-포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 또는 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 모이어티를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
3'-캡의 비-제한적인 예는 글리세릴, 역전 데옥시 탈염기성 잔기(모이어티), 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드, 카보사이클릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트; 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 1,2-아미노도데실 포스페이트; 하이드록시프로필 포스페이트; 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비환식 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-역전 뉴클레오티드 모이어티; 5'-5'-역전 탈염기성 모이어티; 5'-포스포르아미데이트; 5'-포스포로티오에이트; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 가교 및/또는 비-가교 5'-포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트, 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 및 5'-머캅토 모이어티(상세한 내용은 본원에 참조로 포함된 문헌[Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925] 참고)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아데노신 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA에는 폴리-A 꼬리가 결여되어 있다. RNA에 폴리-A 꼬리가 결여된 일부 실시형태에서, RNA는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이하의 순차적인 아데노신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 선형이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 환형이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 제1 영역, 및 제1 영역과 혼성화될 수 있는 제2 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 제1 영역, 및 원을 형성하기 위해 제1 영역과 혼성화될 수 있는 제2 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 5' 또는 3' 말단을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 유리 인산염 및 유리 당 중 하나 또는 둘 모두를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소의 모든 인산염은 인산염에 포함된 제1 산소 원자에 의해 제1 당에 공유적으로 연결되고, 인산염에 포함된 제2 산소 원자에 의해 제2 당에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 내의 모든 당은 당에 포함된 제1 탄소 원자에 의해 제1 인산염에 공유적으로 연결되고, 당에 포함된 제2 탄소 원자에 의해 제2 인산염에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 선형 RNA를 환화함으로써 생성된다. 환형 RNA는 예를 들어, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 20200306286호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 125, 125 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2500, 2500 내지 3000, 3000 내지 3500, 3500 내지 4000 또는 4000 내지 4500개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 또는 4500개의 뉴클레오티드 길이이다.
RNA-전용 유전 요소
일부 실시형태에서, 유전 요소는 RNA로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA가 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소의 이중 가닥 영역은 RNA와 쌍을 형성하는 RNA의 영역을 포함한다.
혼성화된 RNA-ssDNA 유전 요소
일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA를 포함하는 유전 요소는 DNA 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 유전 요소는 단일 가닥일 수 있으며, 여기서 단일 가닥의 제1 부분은 리보뉴클레오티드를 포함하고, 단일 가닥의 제2 부분은 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 영역을 포함하는 유전 요소는 화학적 변형을 갖는 하나 이상의 DNA 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA 영역을 포함하며, 여기서 DNA 영역의 모든 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다.
일부 실시형태에서, 유전 요소의 적어도 일부는 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 ssDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소의 이중 가닥 영역은 RNA와 쌍을 형성하는 RNA의 영역을 포함한다. 이러한 일부 실시형태에서, 유전 요소의 이중 가닥 영역은 RNA와 쌍을 형성하는 DNA의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 영역의 적어도 일부는 유전 요소의 RNA의 적어도 일부에 혼성화된다.
일부 실시형태에서, DNA 영역은 약 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 또는 900 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이이다.
RNA/DNA 컨쥬게이트
일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA를 포함하는 유전 요소는 DNA 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 영역을 포함하는 유전 요소는 화학적 변형을 갖는 하나 이상의 DNA 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA 영역을 포함하며, 여기서 DNA 영역의 모든 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다.
일부 실시형태에서, 유전 요소의 적어도 일부는 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 ssDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소의 이중 가닥 영역은 RNA와 쌍을 형성하는 RNA의 영역을 포함한다. 이러한 일부 실시형태에서, 유전 요소의 이중 가닥 영역은 RNA와 쌍을 형성하는 DNA의 영역을 포함한다. 유전 요소가 RNA를 포함하는 일부 실시형태에서, DNA 영역은 유전 요소의 RNA에 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서, DNA 영역은 약 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900 또는 900 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이이다.
유전 요소 작제물
일부 실시형태에서, 유전 요소는 유전 요소 작제물로부터 생성된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 DNA, 예를 들어, 이중 가닥 DNA이고, 유전 요소는 RNA 유전 요소를 생성하는 전사에 의해 생성될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터의 유전 요소는 유전 요소 영역 및 선택적으로 (예를 들어, 배큘로바이러스 게놈 또는 그의 단편, 예를 들어, 하나 이상의 배큘로바이러스 요소를 포함하는) 박미드 또는 공여자 벡터 백본과 같은 다른 서열을 포함하는 유전 요소 작제물로부터 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 아넬로바이러스 5' UTR(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 유전 요소 작제물은 유전 요소가 단백질성 외부 내에 봉입될 수 있는 숙주 세포 또는 무세포 시스템 내로의 유전 요소의 서열의 운반에 적합한 임의의 핵산 작제물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물로부터의 전사는 RNA 유전 요소를 생성한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 선형 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 환형 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 플라스미드, 박미드, 공여자 벡터 또는 미니서클)이다. 유전 요소 작제물은, 일부 실시형태에서, 이중-가닥일 수 있다. 다른 실시형태에서, 유전 요소는 단일-가닥이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
플라스미드
일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 플라스미드이다. 플라스미드는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소의 서열뿐만 아니라 숙주 세포에서의 복제에 적합한 복제 원점(예를 들어, 박테리아 세포에서의 복제를 위한 박테리아 복제 원점) 및 선택 가능한 마커(예를 들어, 항생제 저항성 유전자)를 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소의 서열은 플라스미드로부터 절제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 박테리아 세포에서 복제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포)에서 복제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 적어도 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 5000 bp의 길이이다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10,000 bp 미만의 길이이다. 일부 실시형태에서, 플라스미드는 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 1500, 1500 내지 2000, 2000 내지 2500, 2500 내지 3000, 3000 내지 4000 또는 4000 내지 5000 bp의 길이를 갖는다.
작은 환형 핵산 작제물
일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 예를 들어, 벡터 백본이 결여된(예를 들어, 박테리아 복제 원점 및/또는 선택가능한 마커가 결여된) 환형 핵산 작제물이다. 실시형태들에서, 유전 요소는 단일-가닥 또는 이중-가닥 환형 핵산 작제물이다. 실시형태들에서, 환형 핵산 작제물은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 시험관 내 환화(IVC)에 의해 생성된다. 실시형태들에서, 이중-가닥 환형 핵산 작제물은 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 여기에서 이는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 단일-가닥 환형 유전 요소를 생성하기 위한 주형으로 전환되거나 주형으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환형 핵산 작제물은 플라스미드 백본 또는 그의 기능적 단편을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 환형 핵산 작제물은 적어도 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400 또는 4500 bp의 길이이다. 일부 실시형태에서, 환형 핵산 작제물은 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5500 또는 6000 bp 미만의 길이이다. 일부 실시형태에서, 환형 핵산 작제물은 2000 내지 2100, 2100 내지 2200, 2200 내지 2300, 2300 내지 2400, 2400 내지 2500, 2500 내지 2600, 2600 내지 2700, 2700 내지 2800, 2800 내지 2900, 2900 내지 3000, 3000 내지 3100, 3100 내지 3200, 3200 내지 3300, 3300 내지 3400, 3400 내지 3500, 3500 내지 3600, 3600 내지 3700, 3700 내지 3800, 3800 내지 3900, 3900 내지 4000, 4000 내지 4100, 4100 내지 4200, 4200 내지 4300, 4300 내지 4400 또는 4400 내지 4500 bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 환형 핵산 작제물은 미니서클이다.
시스/트랜스 작제물
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소 작제물(예를 들어, 박미드 또는 공여자 벡터)은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF, 예를 들어, 단백질성 외부 구성성분(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드)을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 예를 들어, 유전 요소 작제물은 아넬로바이러스 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 유전 요소 작제물은 유전 요소 및 아넬로바이러스 ORF(들)를 시스로 숙주 세포 내로 도입하는데 적합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소 작제물은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF, 예를 들어, 단백질성 외부 구성성분(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드)을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 유전 요소 작제물은 아넬로바이러스 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않을 수 있다. 이러한 유전 요소 작제물은 (예를 들어, 아넬로바이러스 ORF 중 하나 이상을 인코딩하는 제2 핵산 작제물의 도입을 통해, 또는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 아넬로바이러스 ORF 카세트를 통해) 트랜스로 제공될 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF와 함께 유전 요소를 숙주 세포 내로 도입하기에 적합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)에서의 핵산 작제물의 복제에 적합한 백본, 예를 들어, 배큘로바이러스 백본 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이 세포, 예를 들어, DH 10Bac 세포)에서의 유전 요소 작제물의 복제에 적합한 백본 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물(예를 들어, 박미드 또는 공여자 벡터)은 아넬로바이러스 ORF1 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 젤리-롤 영역)을 인코딩하는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소의 서열을 포함하지 않는 유전 요소의 일부는 (예를 들어, 프로모터, 및 아넬로바이러스 ORF1 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 카세트에서) 아넬로바이러스 ORF1 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편을 인코딩하는 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 유전 요소의 서열을 포함하는 작제물의 일부는 아넬로바이러스 ORF1 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 젤리-롤 영역)을 인코딩하는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 단백질성 외부에서의 이러한 유전 요소의 봉입은 복제-구성성분인 아넬로벡터(예를 들어, 세포를 감염시킬 때, 세포가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF를 인코딩하는 추가의 핵산 작제물을 세포 내로 도입하지 않고 아넬로벡터의 추가 카피를 생성할 수 있게 하는 아넬로벡터)를 생성한다.
다른 실시형태에서, 유전 요소는 아넬로바이러스 ORF1 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 젤리-롤 영역)을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는다. 실시형태들에서, 단백질성 외부(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)에서 이러한 유전 요소의 봉입은 복제-불능 아넬로벡터(예를 들어, 세포를 감염시킬 때, 감염된 세포가 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF를 인코딩하는 예를 들어, 하나 이상의 추가 작제물의 부재 하에 추가 아넬로벡터를 생성할 수 없게 하는 아넬로벡터)를 생성한다.
발현 카세트
일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물(예를 들어, 박미드 또는 공여자 벡터)은 폴리펩티드 또는 비코딩 RNA(예를 들어, miRNA 또는 siRNA)의 발현을 위한 하나 이상의 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 이펙터(예를 들어, 외인성 또는 내인성 이펙터), 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 비코딩 RNA의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 아넬로바이러스 단백질(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2 또는 그의 기능적 단편)의 발현을 위한 카세트를 포함한다. 발현 카세트는, 일부 실시형태에서, 유전 요소 서열 내에 위치할 수 있다. 실시형태들에서, 이펙터용 발현 카세트는 유전 요소 서열 내에 위치한다. 실시형태들에서, 아넬로바이러스 단백질용 발현 카세트는 유전 요소 서열 내에 위치한다. 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 유전 요소의 서열 외부에 있는 유전 요소 작제물 내의 위치(예를 들어, 백본)에 위치한다. 실시형태들에서, 아넬로바이러스 단백질용 발현 카세트는 유전 요소의 서열 외부에 있는 유전 요소 작제물 내의 위치(예를 들어, 백본)에 위치한다.
폴리펩티드 발현 카세트는 일반적으로 프로모터, 및 폴리펩티드, 예를 들어, 이펙터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 외인성 또는 내인성 이펙터) 또는 아넬로바이러스 단백질을 인코딩하는 코딩 서열(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1, ORF1/2 또는 그의 기능적 단편을 인코딩하는 서열)을 포함한다. (예를 들어, 폴리펩티드의 발현을 구동하기 위해) 폴리펩티드 발현 카세트에 포함될 수 있는 예시적인 프로모터는 제한 없이, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 구성적 프로모터(예를 들어, CMV, RSV, PGK, EF1a 또는 SV40), 세포 또는 조직-특이적 프로모터(예를 들어, 골격 α-액틴 프로모터, 미오신 경쇄 2A 프로모터, 디스트로핀 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 간 알부민 프로모터, B형 간염 바이러스 코어 프로모터, 오스테오칼신 프로모터, 골 시알로단백질 프로모터, CD2 프로모터, 면역글로불린 중쇄 프로모터, T 세포 수용체 a 쇄 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터 또는 신경필라멘트 경쇄 프로모터) 및 유도성 프로모터(예를 들어, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 중합효소 프로모터 시스템, 테트라사이클린-억제성 시스템, 테트라사이클린-유도성 시스템, RU486-유도성 시스템, 라파마이신-유도성 시스템)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 인핸서를 추가로 포함한다.
RNA-기반 유전 요소의 생성
RNA-기반 유전 요소는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, DNA를 포함하는 유전 요소 작제물은 예를 들어, 위에 기재된 바와 같이 RNA를 포함하는 유전 요소를 생성하기 위해 전사될 수 있다. 전사는 예를 들어, 세포 또는 무세포 시스템에서 일어날 수 있다. RNA는 예를 들어, 고체 상 합성에 의해 시험관 내에서 합성될 수 있다.
단백질 구성성분의 생성
아넬로벡터의 단백질 구성성분, 예를 들어, ORF1은 본원에 기재된 다양한 방식으로 생성될 수 있다.
배큘로바이러스 발현 시스템
바이러스 발현 시스템, 예를 들어, 배큘로바이러스 발현 시스템은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 아넬로벡터의 생성을 위한) 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 배큘로바이러스는 환형의 슈퍼코일링된 이중-가닥 DNA 게놈을 갖는 막대 모양의 바이러스이다. 배큘로바이러스의 속은 다음을 포함한다: 알파배큘로바이러스(레피도프테라(Lepidoptera)로부터 단리된 뉴클레오폴리헤드로바이러스(NPV)), 베타배큘로바이러스(레피도프테라로부터 단리된 과립바이러스(GV)), 감마배큘로바이러스(하이메노프테라(Hymenoptera)로부터 단리된 NPV) 및 델타배큘로바이러스(디프테라(Diptera)로부터 단리된 NPV). GV는 전형적으로 외피당 하나의 뉴클레오캡시드만을 함유하지만, NPV는 전형적으로 외피당 단일(SNPV) 또는 다중(MNPV) 뉴클레오캡시드를 함유한다. 외피 비리온은 GV의 과립 매트릭스와 NPV의 폴리헤드린에서 더 폐색된다. 배큘로바이러스는 전형적으로 용해 및 폐색 수명 주기 둘 모두를 가지고 있다. 일부 실시형태에서, 용해 및 폐색 수명 주기는 바이러스 복제의 3개의 단계: 초기, 후기 및 극후기(very late) 단계 전반에 걸쳐 독립적으로 나타난다. 일부 실시형태에서, 초기 단계 동안에, 바이러스 DNA 복제는 숙주 세포 내로의 바이러스 진입, 초기 바이러스 유전자 발현 및 숙주 유전자 발현 기구의 차단 후에 발생한다. 일부 실시형태에서, 후기 단계에서 바이러스 DNA 복제를 인코딩하는 후기 유전자가 발현되고, 바이러스 입자가 어셈블되고, 세포외 바이러스(EV)가 숙주 세포에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 극후기 단계에서 폴리헤드린 및 p10 유전자가 발현되고, 폐색된 바이러스(OV)가 숙주 세포에 의해 생성되고, 숙주 세포가 용해된다. 배큘로바이러스는 곤충 종을 감염시키기 때문에, 이들은 배큘로바이러스-허용 곤충 세포 또는 유충에서 외인성 단백질을 생성하는 생물학적 제제로서 사용될 수 있다. 아우토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 다중 핵다각체병 바이러스(AcMNPV) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV)와 같은 배큘로바이러스의 상이한 단리물은 외인성 단백질 발현에 사용될 수 있다. 다양한 배큘로바이러스 발현 시스템은 예를 들어, ThermoFisher로부터 상업적으로 이용 가능하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF 분자, 예를 들어, ORF1, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF1/1 또는 ORF1/2, 또는 그의 기능적 단편 또는 스플라이스 변이체)은 본원에 기재된 하나 이상의 구성성분을 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터(예를 들어, 박미드)를 사용하여 발현될 수 있다. 예를 들어, 배큘로바이러스 발현 벡터는 선택 가능한 마커(예를 들어, kanR), 복제 원점(예를 들어, 박테리아 복제 원점 및 곤충 세포 복제 원점 중 하나 또는 둘 모두), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, att 부위) 및 프로모터 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 발현 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 박미드)는 배큘로바이러스 폐색체를 인코딩하는 자연 발생 야생형 폴리헤드린 유전자를 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 유전자로 교체함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 유전자는 배큘로바이러스 프로모터를 함유하는 배큘로바이러스 발현 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 박미드) 내로 클로닝된다. 일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 벡터는 하나 이상의 비-배큘로바이러스 프로모터, 예를 들어, 포유동물 프로모터 또는 아넬로바이러스 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 유전자는 공여자 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 내로 클로닝된 다음, 빈 배큘로바이러스 발현 벡터(예를 들어, 빈 박미드)와 접촉되며, 그에 따라 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 유전자는 공여자 벡터로부터 배큘로바이러스 발현 벡터(예를 들어, 박미드) 내로 (예를 들어, 상동 재조합 또는 트랜스포사제 활성에 의해) 전달된다. 일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 프로모터는 비필수 폴리헤드린 유전자의 유전자좌로부터의 배큘로바이러스 DNA에 측접된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질은 바이러스 복제의 극후기 단계에서 AcNPV 폴리헤드린 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 실시형태에서, 곤충 세포에서의 배큘로바이러스 발현에 사용하기에 적합한 강한 프로모터는 배큘로바이러스 p10 프로모터, 폴리헤드린(polh) 프로모터, p6.9 프로모터 및 캡시드 단백질 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 곤충 세포에서의 배큘로바이러스 발현에 사용하기에 적합한 약한 프로모터는 배큘로바이러스의 ie1, ie2, ie0, et1, 39K(일명 pp31) 및 gp64 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 배큘로바이러스는 배큘로바이러스 게놈(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 배큘로바이러스 게놈)과 전달 벡터 간의 상동 재조합에 의해 생성된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 전달 벡터 내로 클로닝된다. 일부 실시형태에서, 전달 벡터는 비필수 유전자의 유전자좌, 예를 들어, 폴리헤드린 유전자로부터의 DNA에 측접되는 배큘로바이러스 프로모터를 추가로 함유한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 배큘로바이러스 게놈과 전달 벡터 간의 상동성 재조합에 의해 배큘로바이러스 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 게놈은 하나 이상의 독특한 부위에서 선형화된다. 일부 실시형태에서, 선형화된 부위는 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 유전자를 배큘로바이러스 게놈 내로 삽입하기 위한 표적 부위 근처에 위치한다. 일부 실시형태에서, 유전자, 예를 들어, 폴리헤드린 유전자로부터 하류의 배큘로바이러스 게놈의 단편이 누락된 선형화된 배큘로바이러스 게놈은 상동 재조합에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 게놈 및 전달 벡터는 곤충 세포 내로 공동-형질주입된다. 일부 실시형태에서, 재조합 배큘로바이러스를 생성하는 방법은 본원에 기재된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유하는 전달 벡터와 상동 재조합을 수행하기 위한 배큘로바이러스 게놈을 제조하는 단계, 및 전달 벡터 및 배큘로바이러스 게놈 DNA를 곤충 세포 내로 공동-형질주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 게놈은 전달 벡터의 영역과 상동인 영역을 포함한다. 이들 상동 영역은 배큘로바이러스 게놈과 전달 벡터 간의 재조합의 가능성을 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 전달 벡터의 상동성 영역은 프로모터의 상류 또는 하류에 위치한다. 일부 실시형태에서, 상동 재조합을 유도하기 위해, 배큘로바이러스 게놈 및 전달 벡터는 약 1:1 내지 10:1의 중량비로 혼합된다.
일부 실시형태에서, 재조합 배큘로바이러스는 Tn7을 이용한 부위-특이적 전위를 포함하는 방법에 의해 생성되며, 예를 들어, 이에 의해 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 유전자는 박미드 DNA에 삽입되고, 예를 들어, 박테리아, 예를 들어, 이. 콜라이(예를 들어, DH 10Bac 세포)에서 증식된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질을 인코딩하는 유전자는 pFASTBAC® 벡터 내로 클로닝되고, 미니-attTn7 표적 부위를 갖는 박미드 DNA를 함유하는 적격 세포, 예를 들어, DH10BAC® 적격 세포 내로 형질전환된다. 일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 발현 벡터, 예를 들어, pFASTBAC® 벡터는 프로모터, 예를 들어, 이중 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터, p10 프로모터)를 가질 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 pFASTBAC® 공여자 플라스미드는 다음을 포함한다: pFASTBAC 1, pFASTBAC HT 및 pFASTBAC DUAL. 일부 실시형태에서, 재조합 박미드 DNA 함유-콜로니가 식별되고, 박미드 DNA는 곤충 세포를 형질주입시키기 위해 단리된다.
일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 벡터는 헬퍼 핵산과 함께 곤충 세포 내로 도입된다. 도입은 동시적이거나 순차적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 핵산은 예를 들어, 배큘로바이러스 벡터의 패키징을 촉진하기 위해 하나 이상의 배큘로바이러스 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 상동 재조합에 의해) 곤충 세포에서 생성된 재조합 배큘로바이러스는 확장되고, 재조합 단백질 발현을 위해 곤충 세포를 감염시키기 위해(예를 들어, 중간-대수 성장 단계에서) 사용된다. 일부 실시형태에서, 박테리아, 예를 들어, 이. 콜라이에서 부위-특이적 전위에 의해 생성된 재조합 박미드 DNA는 곤충 세포를 형질주입제, 예를 들어, Cellfectin® II로 형질주입시키는 데 사용된다. 배큘로바이러스 발현 시스템에 대한 추가 정보는 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 출원 제14/447,341호, 제14/277,892호 및 제12/278,916호에서 논의된다.
곤충 세포 시스템
본원에 기재된 단백질은 예를 들어, 위에 기재된 바와 같은 재조합 배큘로바이러스 또는 박미드 DNA로 감염되거나 형질주입된 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 곤충 세포는 다음을 포함한다: 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유래된 Sf9 및 Sf21 세포 및 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터 유래된 Tn-368 및 High Five™ BTI-TN-5B1-4 세포(Hi5 세포로도 지칭됨). 일부 실시형태에서, 번데기 가을 거염벌레(army worm)인 스포도프테라 프루기페르다의 난소로부터 유래된 곤충 세포주 Sf21 및 Sf9는 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하는 재조합 단백질의 발현에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, Sf21 및 Sf9 곤충 세포는 상업적으로 이용 가능한 혈청-보충 배지 또는 무혈청 배지에서 배양될 수 있다. 곤충 세포 배양에 적합한 배지는 다음을 포함한다: 그레이스 보충물(Grace's Supplemented)(TNM-FH), IPL-41, TC-100, 슈나이더 드로소필라(Schneider's Drosophila), SF-900 II SFM 및 EXPRESS-FIVE™ SFM. 일부 실시형태에서, 일부 무혈청 배지 제형은 배양 및 재조합 단백질 생성 둘 모두를 위해 6.0 내지 6.4 범위의 배양 pH를 유지하기 위한 인산염 완충 시스템을 활용한다(문헌[Licari et al. Insect cell hosts for baculovirus expression vectors contain endogenous exoglycosidase activity. Biotechnology Progress 9: 146-152 (1993) 및 Drugmand et al. Insect cells as factories for biomanufacturing. Biotechnology Advances 30:1140-1157 (2012)]). 일부 실시형태에서, 다양한 곤충 세포주를 배양하기 위해 6.0 내지 6.8의 pH가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 곤충 세포는 통기를 사용하여 25℃ 내지 30℃의 온도에서 현탁액 내에서 또는 단층으로서 배양된다. 곤충 세포에 대한 추가 정보는 예를 들어, 이들 각각이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 출원 제14/564,512호 및 제14/775,154호에 논의된다.
포유동물 세포 시스템
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단백질을 인코딩하는 벡터로 감염되거나 형질주입된 동물 세포주에서 시험관 내 발현될 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 예상되는 동물 세포주는 돼지 세포주, 예를 들어, 불멸화된 돼지 세포주, 예컨대, 비제한적으로 돼지 신장 상피 세포주 PK-15 및 SK, 단일골수성(monomyeloid) 세포주 3D4/31 및 정소 세포주 ST를 포함한다. 또한, 다른 포유동물 세포주, 예컨대, CHO 세포(중국 햄스터 난소), MARC-145, MDBK, RK-13, EEL이 포함된다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 방법의 특정 실시형태는 상피 세포주, 즉, 상피 계통의 세포의 세포주인 동물 세포주를 사용한다. 본원에 기재된 단백질을 발현하기에 적합한 세포주는 인간 또는 영장류 기원의 세포주, 예컨대, 인간 또는 영장류 신장 암종 세포주를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이펙터
본원에 기재된 조성물 및 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 이펙터(예를 들어, 외인성 이펙터 또는 내인성 이펙터)를 인코딩하는 서열을 포함하는 아넬로벡터의 유전 요소를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 이펙터이며, 예를 들어, 유전 요소는 기능적 RNA이다. 이펙터는, 일부 예에서, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 치료적 이펙터이다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 치료적 폴리펩티드 또는 펩티드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 비-코딩 RNA(예를 들어, miRNA, siRNA, shRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA 또는 gRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조절 핵산을 포함한다.
시험관 내 어셈블리 방법
아넬로벡터는 예를 들어, 시험관 내 어셈블리에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 어셈블리를 허용하는 조건 하에서 시험관 내에서 ORF1과 접촉된다.
일부 실시형태에서, 배큘로바이러스 작제물은 아넬로바이러스 단백질을 생성하기 위해 사용된다. 그런 다음, 이들 단백질은 예를 들어, 유전 요소, 예를 들어, RNA를 포함하는 유전 요소를 캡시드화하기 위한 시험관 내 어셈블리에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포, 예를 들어, 곤충 또는 동물 세포에서의 발현을 위해 프로모터에 융합된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 배큘로바이러스 발현 시스템 내로 클로닝된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포, 예를 들어, 곤충 세포는 배큘로바이러스 발현 시스템으로 감염되고 일정 기간 동안 항온처리된다. 일부 실시형태에서, 감염된 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20일 동안 항온처리된다. 일부 실시형태에서, 감염된 세포는 아넬로바이러스 단백질을 회수하기 위해 용해된다.
일부 실시형태에서, 단리된 아넬로바이러스 단백질은 정제된다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스 단백질은 비제한적으로 킬레이팅 정제, 헤파린 정제, 구배 침강 정제 및/또는 SEC 정제를 포함하는 정제 기술을 사용하여 정제된다. 일부 실시형태에서, 정제된 아넬로바이러스 단백질은 유전 요소, 예를 들어, RNA를 포함하는 유전 요소를 캡시드화하기 위해 유전 요소와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 ORF1 단백질, ORF2 단백질 또는 그의 변형된 버전을 사용하여 캡시드화된다. 일부 실시형태에서 2개의 핵산이 캡시드화된다. 예를 들어, 제1 핵산은 mRNA, 예를 들어, 화학적으로 변형된 mRNA일 수 있고, 제2 핵산은 DNA일 수 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로바이러스(AV) ORF1(예를 들어, 야생형 ORF1 단백질, 예를 들어, 어셈블리 효율, 수율 또는 안정성을 개선하기 위한 돌연변이를 보유하는 ORF1 단백질, 키메라 ORF1 단백질 또는 그의 단편)을 인코딩하는 DNA는 곤충 세포주(예를 들어, Sf9 및/또는 HighFive), 동물 세포주(예를 들어, 닭 세포주(MDCC)), 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이) 및/또는 포유동물 세포주(예를 들어, 293expi 및/또는 MOLT4)에서 발현된다. 일부 실시형태에서, AV ORF1을 인코딩하는 DNA는 태깅되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, AV ORF1을 인코딩하는 DNA는 N-말단 및/또는 C-말단에 융합된 태그를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, AV ORF1을 인코딩하는 DNA는, 예를 들어, 면역염색 검정(ELISA 또는 웨스턴 블롯을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 통한 예를 들어, 정제 및/또는 동일성 결정을 돕기 위한 태그를 도입하기 위해 ORF1 단백질 내에 돌연변이, 삽입 또는 결실을 보유할 수 있다. 일부 실시형태에서, AV ORF1을 인코딩하는 DNA는 단독으로 또는 임의의 수의 헬퍼 단백질과 조합하여 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, AV ORF1을 인코딩하는 DNA는 AV ORF2 및/또는 ORF3 단백질과 조합하여 발현된다.
일부 실시형태에서, 어셈블리 효율을 개선시키기 위한 돌연변이를 보유하는 ORF1 단백질은 입자 어셈블리를 촉발하도록 pH 민감성 핵산 결합을 허용하는 ARG 아암의 pI를 변경하기 위해 N-말단 아르기닌 아암(ARG 아암) 내로 도입된 돌연변이를 보유하는 ORF1 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(SEQ ID 3 내지 5). 일부 실시형태에서, 안정성을 개선시키는 돌연변이를 보유하는 ORF1 단백질은 프로토머 표면의 소수성 상태를 변경하고 캡시드 형성의 열역학적 우호성을 개선시키기 위해 표준 젤리롤 베타-배럴의 베타 가닥 F 및 G와 접촉하는 인터프로토머에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 ORF1 단백질은 다른 캡시드 단백질, 예를 들어, 부리 및 깃털 질병 바이러스(BFDV) 캡시드 단백질, 또는 E형 간염 캡시드 단백질로부터의 비슷한 부분으로 교체된 ORF1 단백질의 서열의 일부 또는 일부들을 갖는 ORF1 단백질, 예를 들어, BFDV 캡시드 단백질로부터의 비슷한 구성성분으로 교체된 고리 9 ORF1의 ARG 아암 또는 F 및 G 베타 가닥을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 키메라 ORF1 단백질은 다른 AV ORF1 단백질의 비슷한 부분으로 교체된 ORF1 단백질의 서열의 일부 또는 일부들(예를 들어, 고리 9 ORF1의 비슷한 부분으로 교체된 고리 2 ORF1의 젤리롤 단편 또는 C-말단 부분)을 갖는 ORF1 단백질을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 아넬로벡터를 제조하는 방법을 설명하며, 방법은 (a) (i) RNA를 포함하는 유전 요소, 및 (ii) ORF1 분자를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 및 (b) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부 내에 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건 하에서 혼합물을 항온처리하며, 이에 따라 아넬로벡터를 제조하는 단계를 포함하며; 선택적으로, 혼합물은 세포에 포함되지 않는다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a)를 제공하기 전에, 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포 또는 포유동물 세포)에서 ORF1 분자를 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현은 ORF1 분자를 생성하기에 적합한 조건 하에서 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 배큘로바이러스 발현 벡터)를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포 또는 포유동물 세포)를 항온처리하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a)를 제공하기 전에, 숙주 세포에 의해 발현된 ORF1 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 무세포 시스템에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는, 아넬로벡터 조성물의 제조 방법을 설명한다: (a) 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따른 복수의 아넬로벡터 또는 조성물을 제공하는 단계; (b) 선택적으로, 다음 중 하나 이상에 대하여 복수를 평가하는 단계: 본원에 기재된 오염물질, 광학 밀도 측정치(예를 들어, OD 260), (예를 들어, HPLC에 의한) 입자 개수, 감염성(예를 들어, 형광 및/또는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같은, 예를 들어, 입자:감염성 유닛 비); 및 (c) 예를 들어, (b)의 파라미터 중 하나 이상이 명시된 임계값을 만족한다면, 복수의 아넬로벡터를 예를 들어, 대상체로의 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계.
농축 및 정제
수확된 아넬로벡터는 예를 들어, 아넬로벡터 제제를 생성하기 위해 정제 및/또는 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수확된 아넬로벡터는 예를 들어, 바이러스 입자를 정제하기 위해 당업계에 알려진 방법(예를 들어, 침강, 크로마토그래피 및/또는 한외여과에 의한 정제)을 사용하여 수확 용액에 존재하는 다른 구성요소(constituent) 또는 오염물질로부터 단리된다. 일부 실시형태에서, 수확된 아넬로벡터는 친화도 정제(예를 들어, 헤파린 친화도 정제)에 의해 정제된다. 일부 실시형태에서, 수확된 아넬로벡터는 크기 배제 크로마토그래피(예를 들어, Tris 완충액 이동상을 사용함)에 의해 정제된다. 일부 실시형태에서, 수확된 아넬로벡터는 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, Mustang Q 막 크로마토그래피)에 의해 정제된다. 일부 실시형태에서, 수확된 아넬로벡터는 혼합 모드 크로마토그래피(예를 들어, 혼합 모드 수지, 예를 들어, Cato700 수지를 사용함)에 의해 정제된다. 일부 실시형태에서, 정제 단계는 제제로부터 혈청, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, 유전 요소가 결여된 입자 및/또는 페놀 레드 중 하나 이상을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수확된 아넬로벡터는, 예를 들어, 바이러스 입자를 농축시키기 위한 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 수확 용액에 존재하는 다른 구성요소 또는 오염물질에 비하여 농축된다.
일부 실시형태에서, 생성된 제제 또는 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 허용 가능한 기간 및 온도에 걸쳐 안정할 것이고/것이거나, 요망되는 투여 경로 및/또는 이러한 투여 경로가 필요로 할 임의의 디바이스, 예를 들어, 니들 또는 주사기와 양립 가능할 것이다.
II. 아넬로벡터
일부 양태에서, 본 개시내용은 아넬로벡터를 사용 및 제조하는 조성물 및 방법, 아넬로벡터 제제, 및 치료적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스), 또는 그의 단편 또는 부분, 또는 다른 실질적으로 비-병원성인 바이러스, 예를 들어, 상리공생 바이러스(symbiotic virus), 편리공생 바이러스(commensal virus), 고유 바이러스에 기반한 서열, 구조 및/또는 기능을 포함하는 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스-기반의 아넬로벡터는 아넬로바이러스에 대하여 외인성인 적어도 하나의 요소, 예를 들어, 외인성 이펙터 또는 아넬로벡터의 유전 요소 내에 배치된 외인성 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스-기반의 아넬로벡터는 아넬로바이러스 유래의 또 다른 요소에 대하여 이종인 적어도 하나의 요소, 예를 들어, 또 다른 연결된 핵산 서열, 예컨대 프로모터 요소에 대하여 이종인 이펙터-인코딩 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 유전 요소의 나머지 및/또는 단백질성 외부에 비하여 이종인 적어도 하나의 요소(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 이펙터를 인코딩하는 외인성 요소)를 포함하는 유전 요소(예를 들어, 환형 DNA, 예를 들어, 단일 가닥 DNA)를 포함한다. 아넬로벡터는 페이로드를 위한 숙주, 예를 들어, 인간 내로의 운반 비히클(예를 들어, 실질적으로 비병원성 운반 비히클)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 복제 가능하다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서 실질적으로 비병원성 및/또는 실질적으로 비통합성이다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 실질적으로 비-면역원성이다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 복제-결핍이다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 복제-적격이다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 예를 들어, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 제PCT/US2018/037379호에 기재된 바와 같은, 큐론 또는 그의 구성성분(예를 들어, 이펙터를 인코딩하는 서열, 및/또는 단백질성 외부를 포함하는, 예를 들어, 유전 요소)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 예를 들어, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 PCT/US19/65995호에 기재된 바와 같은 아넬로벡터 또는 그의 구성성분(예를 들어, 이펙터를 인코딩하는 서열, 및/또는 단백질성 외부를 포함하는, 예를 들어, 유전 요소)을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소, 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어, 페이로드)를 인코딩하는 서열 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열, 예를 들어, 패키징 신호)을 포함하는 유전 요소로서, 유전 요소가 단일-가닥 DNA이며, 다음의 특성 중 하나 또는 둘 모두를 갖는 유전 요소: 환형이고/환형이거나 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 진핵 세포의 게놈 내로 통합됨; 및 (ii) 단백질성 외부를 포함하는 아넬로벡터를 포함하며; 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되며; 아넬로벡터는 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있다.
본원에 기재된 아넬로벡터의 일부 실시형태에서, 유전 요소는 세포에 유입되는 유전 요소의 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2% 미만의 빈도로 통합된다. 일부 실시형태에서, 대상체에 투여되는 복수의 아넬로벡터로부터 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 미만의 유전 요소는 대상체 내의 하나 이상의 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 것이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터의 집단의 유전 요소는 유사한 AAV 바이러스의 집단의 것보다 더 낮은 빈도로, 예를 들어, 유사한 AAV 바이러스의 집단보다 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상 더 낮은 빈도로 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 프로모터 요소 및 이펙터(예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어, 페이로드)를 인코딩하는 서열, 및 단백질 결합 서열(예를 들어, 외부 단백질 결합 서열)을 포함하는 유전 요소로서, 유전 요소가 야생형 아넬로바이러스 서열(예를 들어, 야생형 토르크 테노 바이러스(TTV), 토르크 테노 미니 바이러스(TTMV) 또는 TTMDV 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스 서열)에 대하여 적어도 75%(예를 들어, 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 유전 요소; 및 (ii) 단백질성 외부를 포함하는 아넬로벡터를 포함하며; 유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되며; 아넬로벡터는 유전 요소를 진핵 세포 내로 운반할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은
a) (i) 외부 단백질(예를 들어, 비-병원성 외부 단백질)을 인코딩하는 서열, (ii) 유전 요소를 비-병원성 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열, 및 (iii) 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 인코딩하는 서열을 포함하는 유전 요소; 및
b) 유전 요소와 회합된, 예를 들어, 이를 둘러싸거나 봉입하는 단백질성 외부를 포함하는 아넬로벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 비-외피, 환형, 단일-가닥 DNA 바이러스로부터의(또는 이와 70% 초과, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100%의 상동성을 갖는) 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 동물 환형 단일-가닥 DNA 바이러스는 일반적으로 진핵 비-식물 숙주를 감염시키고, 환형 게놈을 갖는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 바이러스의 하위군을 지칭한다. 따라서, 동물 환형 ssDNA 바이러스는 원핵생물을 감염시키는 ssDNA 바이러스(즉, 마이크로바이러스과 및 이노바이러스과) 및 식물을 감염시키는 ssDNA 바이러스(즉, 제미니바이러스과 및 나노바이러스과)와 구별 가능하다. 그들은 또한 비-식물 진핵생물을 감염시키는 선형 ssDNA 바이러스(즉, 파보바이러스과)와 구별 가능하다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 숙주 세포 기능을 예를 들어, 일시적으로 또는 장기간 조절한다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 안정하게 변경되며, 예컨대 조절은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 이상 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 일시적으로 변경되며, 예를 들어, 예컨대 조절은 약 30분 이하 내지 약 7일 또는 약 1시간 이하, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 프로모터 요소를 포함한다. 실시형태들에서, 프로모터 요소는 RNA 중합효소 II-의존성 프로모터, RNA 중합효소 III-의존성 프로모터, PGK 프로모터, CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, SV40 프로모터, CAGG 프로모터 또는 UBC 프로모터, TTV 바이러스 프로모터, 조직 특이적, U6(pollIII), 활성화 단백질(TetR-VP16, Gal4-VP16, dCas9-VP16 등)에 대한 상류 DNA 결합 부위가 있는 최소 CMV 프로모터로부터 선택된다. 실시형태들에서, 프로모터 요소는 TATA 박스를 포함한다. 실시형태들에서, 프로모터 요소는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 아넬로바이러스에 대하여 내인성이다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 다음의 특징 중 하나 이상을 포함한다: 단일-가닥, 환형, 음성 가닥 및/또는 DNA. 실시형태들에서, 유전 요소는 에피솜을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이펙터를 배제한 유전 요소의 부분은 약 2.5 내지 5 kb(예를 들어, 약 2.8 내지 4 kb, 약 2.8 내지 3.2 kb, 약 3.6 내지 3.9 kb 또는 약 2.8 내지 2.9 kb), 약 5 kb 미만(예를 들어, 약 2.9 kb, 3.2 kb, 3.6 kb, 3.9 kb 또는 4 kb 미만) 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 1 kb)의 조합된 크기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터 또는 아넬로벡터에 포함되는 유전 요소는 세포(예를 들어, 인간 세포) 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 일단 아넬로벡터 또는 유전 요소가 세포 내로 도입되면, 예를 들어, 아넬로벡터의 유전 요소에 의해 인코딩되는 이펙터(예를 들어, RNA, 예를 들어, miRNA)는 세포(예를 들어, 인간 세포)에서 발현된다. 실시형태들에서, 세포 내로의 아넬로벡터 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 예를 들어, 세포에 의한 표적 분자의 발현 수준을 변경시킴으로써 세포에서 표적 분자(예를 들어, 표적 핵산, 예를 들어, RNA 또는 표적 폴리펩티드)의 수준을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 실시형태들에서, 아넬로벡터 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포에 의해 생성되는 인터페론의 수준을 감소시킨다. 실시형태들에서, 세포 내로의 아넬로벡터 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포의 기능을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 실시형태들에서, 세포 내로의 아넬로벡터 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포의 생존력을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 실시형태들에서, 세포 내로의 아넬로벡터 또는 거기에 포함된 유전 요소의 도입은 세포(예를 들어, 암 세포)의 생존력을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아넬로벡터(예를 들어, 합성 아넬로벡터)는 70% 미만의 항체 출현율(예를 들어, 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만의 항체 출현율)을 유도한다. 실시형태들에서, 항체 출현율은 해당 분야에 알려진 방법에 따라 결정된다. 실시형태들에서, 항체 출현율은 예를 들어, 문헌[Tsuda et al., 1999; J. Virol. Methods 77: 199-206](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV 항체 검출 방법 및/또는 문헌[Kakkola et al., 2008; Virology 382: 182-189](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-TTV IgG 혈청학적 출현율의 결정 방법에 따라 생물학적 시료에서 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 그에 기초한 아넬로벡터에 대한 항체를 검출함으로써 결정된다. 아넬로바이러스 또는 그에 기초한 아넬로벡터에 대한 항체는 또한 항-바이러스 항체를 검출하기 위한 해당 분야의 방법, 예를 들어, 문헌[Calcedo et al., 2013; Front. Immunol. 4(341): 1-7](본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 예를 들어, 항-AAV 항체의 검출 방법에 의해 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 복제 결핍, 복제 결함 또는 복제 비적격 유전 요소는 유전 요소의 복제에 필요한 필수 기구 또는 구성성분의 전부를 인코딩하지 않는다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 유전 요소는 복제 인자를 인코딩하지 않는다. 일부 실시형태에서, 복제 결함 유전 요소는 하나 이상의 ORF(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, 및/또는 ORF2t/3)를 인코딩하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소에 의해 인코딩되지 않는 기구 또는 구성성분은 (예를 들어, 숙주 세포에 의해 포함되는, 예를 들어, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 핵산에 인코딩되어) 트랜스로 제공되어, 예를 들어, 유전 요소가 트랜스로 제공되는 기구 또는 구성성분의 존재 하에 복제를 겪을 수 있게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 패키징 결핍, 패키징 결함 또는 패키징 비적격 유전 요소는 단백질성 외부(예를 들어, 단백질성 외부는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 또는 그의 부분을 포함함) 내에 패키징될 수 없다. 일부 실시형태에서, 패키징 결핍 유전 요소는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스에 비하여 10% 미만(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01% 또는 0.001% 미만)의 효율로 단백질성 외부 내로 패키징된다. 일부 실시형태에서, 패키징 결함 유전 요소는 심지어 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3)의 존재 하에서도 단백질성 외부 내에 패키징될 수 없다. 일부 실시형태에서, 패키징 결핍 유전 요소는 심지어 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3)의 존재 하에서도, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스에 비하여 10% 미만(예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01% 또는 0.001% 미만)의 효율로 단백질성 외부 내로 패키징된다.
일부 실시형태에서, 패키징 적격 유전 요소는 단백질성 외부(예를 들어, 단백질성 외부는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 포함하는, 캡시드 또는 그의 부분을 포함함) 내로 패키징될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 적격 유전 요소는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스에 비하여 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 이상)의 효율로 단백질성 외부 내에 패키징된다. 일부 실시형태에서, 패키징 적격 유전 요소는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3)의 존재 하에서, 단백질성 외부 내로 패키징될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 적격 유전 요소는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스의 유전 요소의 패키징을 허용할 인자(예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 또는 ORF2t/3)의 존재 하에서, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 야생형 아넬로바이러스에 비하여 적어도 20%(예를 들어, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 이상)의 효율로 단백질성 외부 내로 패키징된다.
아넬로바이러스
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터는 아넬로바이러스로부터 유래된 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로바이러스에 비하여 외인성인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로바이러스에 비하여 내인성인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로벡터 내의 하나 이상의 다른 서열 또는 발현 생성물에 비하여 이종인 하나 이상의 서열 또는 발현 생성물을 포함한다. 아넬로바이러스는 일반적으로 음의 극성을 갖는 단일-가닥 환형 DNA 게놈을 갖는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 또는 본원에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어, 아넬로바이러스 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 서열 또는 그의 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스의 TATA 박스, 캡 부위, 개시자 요소, 전사 시작 부위, 5' UTR 보존된 도메인, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3, 3개의 오픈-리딩 프레임 영역, 폴리(A) 신호, GC-풍부 영역, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 아넬로바이러스 중 임의의 것의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편) 또는 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 ORF2t/3 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 개시자 요소 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스의 3개의 오픈-리딩 프레임 영역의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 A1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 개시자 요소 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스의 3개의 오픈-리딩 프레임 영역의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 B1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 TAIP 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 개시자 요소 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스의 3개의 오픈-리딩 프레임 영역의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 C1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 TAIP 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 개시자 요소 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스의 3개의 오픈-리딩 프레임 영역의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 D1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 ORF1/1 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 ORF1/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 ORF2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 ORF2/2 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 ORF2/3 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 TAIP 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 TATA 박스 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 개시자 요소 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 전사 시작 부위 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스의 3개의 오픈-리딩 프레임 영역의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 폴리(A) 신호 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 표 E1의 아넬로바이러스 GC-풍부 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 또는 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나, 예를 들어, 아넬로바이러스 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 서열 또는 그의 단편에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 표 A1 내지 M2 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 표 표 A2 내지 M2 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터는 본원에 기재된 아넬로바이러스(예를 들어, 표 A 내지 M 중 임의의 것에 주석이 달리거나, 그에 열거된 서열에 의해 인코딩되는 바와 같은 아넬로바이러스 서열) 중 임의의 것의 TATA 박스, 캡 부위, 개시인자 요소, 전사 시작 부위, 5' UTR 보존된 도메인, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3, 3개의 오픈-리딩 프레임 영역, 폴리(A) 신호, GC-풍부 영역 중 하나 이상 또는 그의 임의의 조합에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 아넬로바이러스(예를 들어, 표 A 내지 M 중 임의의 것에 주석이 달리거나, 그에 열거된 서열에 의해 인코딩되는 바와 같은 아넬로바이러스 서열) 중 임의의 것의 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 아넬로바이러스 ORF1 또는 ORF2 단백질(예를 들어, 표 A2 내지 M2 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 ORF1 또는 ORF2 아미노산 서열, 또는 표 A1 내지 M1 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 핵산 서열에 의해 인코딩되는 ORF1 또는 ORF2 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 핵산 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 표 A2 내지 M2 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 ORF1 아미노산 서열 또는 표 A1 내지 M1 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 핵산 서열에 의해 인코딩되는 ORF1 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터는 키메라 아넬로벡터이다. 일부 실시형태에서, 키메라 아넬로벡터는 아넬로바이러스 이외의 바이러스로부터의 하나 이상의 요소, 폴리펩티드 또는 핵산을 추가로 포함한다.
실시형태들에서, 키메라 아넬로벡터는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 복수의 상이한 아넬로바이러스로부터의 서열을 포함하는 복수의 폴리펩티드(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 및/또는 ORF2t/3)를 포함한다. 예를 들어, 키메라 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스로부터의 ORF1 분자(예를 들어, 고리1 ORF1 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1 분자) 및 상이한 아넬로바이러스로부터의 ORF2 분자(예를 들어, 고리2 ORF2 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자)를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 키메라 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스로부터의 제1 ORF1 분자(예를 들어, 고리1 ORF1 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1 분자) 및 상이한 아넬로바이러스로부터의 제2 ORF1 분자(예를 들어, 고리2 ORF1 분자, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1 분자)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 예를 들어, 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 적어도 하나의 부분 및 상이한 바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 폴리펩티드(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 및/또는 ORF2t/3)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 예를 들어, 하나의 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 적어도 하나의 부분 및 상이한 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 폴리펩티드(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3 및/또는 ORF2t/3)를 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF1 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF1 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 ORF1 분자를 포함한다. 실시형태들에서, 키메라 ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 ORF1 젤리-롤 도메인 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 상이한 아넬로바이러스로부터의 ORF1 아미노산 하위서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 키메라 ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 ORF1 아르기닌-풍부 영역 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 상이한 아넬로바이러스로부터의 ORF1 아미노산 하위서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 키메라 ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 ORF1 초가변 도메인 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 상이한 아넬로바이러스로부터의 ORF1 아미노산 하위서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 키메라 ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 ORF1 N22 도메인 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 상이한 아넬로바이러스로부터의 ORF1 아미노산 하위서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 키메라 ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 ORF1 C-말단 도메인 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 상이한 아넬로바이러스로부터의 ORF1 아미노산 하위서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF1/1 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1/1 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF1/1 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1/1 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 ORF1/1 분자를 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF1/2 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1/2 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF1/2 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF1/2 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 ORF1/2 분자를 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF2 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF2 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 ORF2 분자를 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF2/2 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2/2 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF2/2 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2/2 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 ORF2/2 분자를 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF2/3 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2/3 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF2/3 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2/3 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 ORF2/3 분자를 포함한다. 실시형태들에서, 아넬로벡터는 하나의 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF2T/3 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2T/3 분자의 적어도 하나의 부분, 및 상이한 아넬로바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터의 ORF2T/3 분자 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 ORF2T/3 분자의 적어도 하나의 부분을 포함하는 키메라 ORF2T/3 분자를 포함한다.
본원에 포함된 서열 또는 하위서열이 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 활용될 수 있는 추가의 예시적인 아넬로바이러스 게놈은 예를 들어, PCT 출원 PCT/US2018/037379호 및 PCT/US19/65995호(그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 예시적인 아넬로바이러스 서열은 본원에 참조로 포함된 PCT/US19/65995호의 표 A1, A3, A5, A7, A9, A11, B1 내지 B5, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 17 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예시적인 아넬로바이러스 서열은 본원에 참조로 포함된 PCT/US19/65995호의 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예시적인 아넬로바이러스 서열은 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 PCT/US19/65995호의 표 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, D2, D4, D6, D8, D10 또는 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은, ORF1 분자 서열, 또는 ORF1 분자 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
표 A1. 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(알파토르크바이러스 , 클레이드 3)
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
표 A2. 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(알파토르크바이러스 , 클레이드 3)
Figure pct00035
Figure pct00036
표 B1. 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(베타토르크바이러스)
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
표 B2. 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(베타토르크바이러스)
Figure pct00040
표 C1. 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(감마토르크바이러스)
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
표 C2. 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(감마토르크바이러스)
Figure pct00044
Figure pct00045
표 D1. 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(베타토르크바이러스)
Figure pct00046
Figure pct00047
표 D2. 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(베타토르크바이러스)
Figure pct00048
Figure pct00049
표 E1. 예시적인 아넬로바이러스 핵산 서열(베타토르크바이러스)
Figure pct00050
Figure pct00051
표 E2. 예시적인 아넬로바이러스 아미노산 서열(베타토르크바이러스)
Figure pct00052
Figure pct00053
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 제PCT/US2018/037379호에 열거된 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 제PCT/US2018/037379호에 열거된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 PCT/US19/65995호에 열거된 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 PCT/US19/65995호에 열거된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
ORF1 분자
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 ORF1 분자 및/또는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일반적으로, ORF1 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질)의 구조적 특징 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 아넬로바이러스 ORF1 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질)에 비하여 절단을 포함한다. ORF1 분자는 다른 ORF1 분자에 결합하여, 예를 들어, (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 단백질성 외부, 예를 들어, 캡시드를 형성하는 능력이 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전 요소)를 봉입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 ORF1 분자는 예를 들어, 단백질성 외부를 형성하기 위해 다합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다합체는 동종다합체일 수 있다. 다른 실시형태에서, 다합체는 이종다합체일 수 있다.
ORF1 분자는 일부 실시형태에서, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 아르기닌 풍부 영역, 예를 들어, 적어도 60%의 염기성 잔기(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 염기성 잔기; 예를 들어, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 70% 내지 90% 또는 70 내지 80%의 염기성 잔기)를 갖는 영역을 포함하는 제1 영역, 및 젤리-롤 도메인, 예를 들어, 적어도 6개의 베타 가닥(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 베타 가닥)을 포함하는 제2 영역.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ORF1 분자는 야생형 ORF1 단백질 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)에 비하여 하나 이상의 라이신에서 히스티딘으로의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, ORF1 분자는 아르기닌-풍부 영역 및/또는 제1 베타 가닥에서 하나 이상의 라이신에서 히스티딘으로의 돌연변이를 포함한다.
아르기닌-풍부 영역
아르기닌 풍부 영역은 본원에 기재된 아르기닌-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 70%(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%) 서열 동일성을 갖거나, 적어도 60%, 70% 또는 80%의 염기성 잔기(예를 들어, 아르기닌, 라이신 또는 그의 조합)를 포함하는 적어도 약 40개의 아미노산의 서열을 갖는다.
젤리 롤 도메인
젤리-롤 도메인 또는 영역은 다음의 특징 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 더 큰 폴리펩티드에 포함된 도메인 또는 영역)를 포함한다(예를 들어, 이로 이루어진다):
(i) 젤리-롤 도메인의 적어도 30%(예를 들어, 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% 이상)의 아미노산이 하나 이상의 β-시트의 부분임;
(ii) 젤리-롤 도메인의 2차 구조는 적어도 4개(예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함함; 및/또는
(iii) 젤리-롤 도메인의 3차 구조는 적어도 2개(예를 들어, 적어도 2, 3 또는 4개)의 β-시트를 포함함; 및/또는
(iv) 젤리-롤 도메인은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1의 β-시트 대 α-나선의 비를 포함함.
특정 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 2개의 β-시트를 포함한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 약 8개(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 8개의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 7개의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 6개의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 5개의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 β-시트는 4개의 β-가닥을 포함한다.
일부 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 제2 β-시트에 대한 역평행 배향의 제1 β-시트를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 β-시트는 약 4개(예를 들어, 3, 4, 5 또는 6개)의 β-가닥을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 β-시트는 약 4개(예를 들어, 3, 4, 5 또는 6개)의 β-가닥을 포함한다. 실시형태들에서, 제1 및 제2 β-시트는 총 약 8개(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 β-가닥을 포함한다.
특정 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 캡시드 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ORF1 분자)의 구성성분이다. 특정 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 자가-어셈블리 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 젤리-롤 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 젤리-롤 도메인을 포함하는 또 다른 카피의 폴리펩티드에 결합한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 젤리-롤 도메인은 제2 카피의 폴리펩티드의 젤리-롤 도메인에 결합한다.
N22 도메인
ORF1 분자는 또한, 아넬로바이러스 N22 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 N22 도메인)의 구조 또는 활성을 포함하는 제3 영역, 및/또는 아넬로바이러스 C-말단 도메인(CTD)(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 CTD)의 구조 또는 활성을 포함하는 제4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 N-말단에서 C-말단 순서로, 제1, 제2, 제3 및 제4 영역을 포함한다.
초가변 영역(HVR)
ORF1 분자는 일부 실시형태에서, 초가변 영역(HVR), 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 HVR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, HVR은 제2 영역과 제3 영역 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, HVR은 적어도 약 55개(예를 들어, 적어도 약 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 65개)의 아미노산(예를 들어, 약 45 내지 160, 50 내지 160, 55 내지 160, 60 내지 160, 45 내지 150, 50 내지 150, 55 내지 150, 60 내지 150, 45 내지 140, 50 내지 140, 55 내지 140 또는 60 내지 140개의 아미노산)을 포함한다.
예시적인 ORF1 서열
예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 서열 및 예시적인 ORF1 도메인의 서열이 하기 표에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 분자)는 예를 들어, 표 N 내지 Z) 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아넬로벡터는 예를 들어, 표 N 내지 Z 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아넬로벡터는 예를 들어, 표 N 내지 Z 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 유전 요소)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 아넬로바이러스 ORF1 하위서열은 아르기닌(Arg)-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, 초가변 영역(HVR), N22 도메인 또는 C-말단 도메인(CTD)(예를 들어, 표 N 내지 Z 중 임의의 것에 기재된 바와 같음), 또는 이에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 상이한 아넬로바이러스로부터의 복수의 하위서열(예를 들어, 표 N 내지 Z에 열거된 알파토르크바이러스 클레이드 1 내지 7 하위서열로부터 선택된 ORF1 하위서열의 임의의 조합)을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, N22 도메인, 및 CTD 그리고 다른 아넬로바이러스로부터의 HVR 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 젤리-롤 도메인, HVR, N22 도메인 및 CTD, 및 다른 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인, HVR, N22 도메인 및 CTD, 및 다른 아넬로바이러스로부터의 젤리-롤 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, HVR 및 CTD, 및 다른 아넬로바이러스로부터의 N22 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태들에서, ORF1 분자는 하나의 아넬로바이러스로부터의 Arg-풍부 도메인, 젤리-롤 도메인, HVR 및 N22 도메인, 및 다른 아넬로바이러스로부터의 CTD 중 하나 이상을 포함한다.
ORF1 분자, 또는 그의 스플라이스 변이체 또는 기능적 단편이 (예를 들어, 유전 요소를 봉입함으로써, 예를 들어, 아넬로벡터의 단백질성 외부를 형성하기 위한) 본원에 기재된 조성물 및 방법에 활용될 수 있는 추가의 예시적인 아넬로바이러스는 예를 들어, PCT 출원 PCT/US2018/037379호 및 PCT/US19/65995호(그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
표 N. 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스, 클레이드 3)
Figure pct00054
Figure pct00055
표 O. 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(알파토르크바이러스, 클레이드 3)
Figure pct00056
표 P. 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(베타토르크바이러스)
Figure pct00057
Figure pct00058
표 Q. 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(베타토르크바이러스)
Figure pct00059
표 R. 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(감마토르크바이러스)
Figure pct00060
표 S. 예시적인 아넬로바이러스 ORF1 아미노산 하위서열(감마토르크바이러스)
Figure pct00061
일부 실시형태에서, 제1 영역은 핵산 분자(예를 들어, DNA)에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기성 잔기는 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아르기닌 잔기(예를 들어, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 70% 내지 90% 또는 70 내지 80%의 아르기닌 잔기)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 약 30 내지 120개의 아미노산(예를 들어, 약 40 내지 120, 40 내지 100, 40 내지 90, 40 내지 80, 40 내지 70, 50 내지 100, 50 내지 90, 50 내지 80, 50 내지 70, 60 내지 100, 60 내지 90 또는 60 내지 80개의 아미노산)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 바이러스 ORF1 아르기닌-풍부 영역(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 아르기닌-풍부 영역)의 구조 또는 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 핵 국소화 신호를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 영역은 젤리-롤 도메인, 예를 들어, 바이러스 ORF1 젤리-롤 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 단백질로부터의 젤리-롤 도메인)의 구조 또는 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 영역은 또 다른 ORF1 분자의 제2 영역에 결합하여, 예를 들어, 단백질성 외부(예를 들어, 캡시드) 또는 그의 부분을 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제4 영역은 단백질성 외부(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1 분자의 다합체를 포함하는 단백질성 외부)의 표면 상에 노출된다.
일부 실시형태에서, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 및/또는 HVR은 각각 4개 미만(예를 들어, 0, 1, 2 또는 3개)의 베타 시트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역, 및/또는 HVR 중 하나 이상은 이종 아미노산 서열(예를 들어, 이종 ORF1 분자로부터의 상응하는 영역)에 의해 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 아미노산 서열은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 요망되는 작용성을 갖는다.
일부 실시형태에서, ORF1 분자는 (예를 들어, PCT/US19/65995호의 도 34에 나타낸 바와 같이) 복수의 보존된 모티프(예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 아미노산을 포함하는 모티프)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 보존된 모티프는 하나 이상의 야생형 아넬로바이러스 클레이드(예를 들어, 알파토르크바이러스, 클레이드 1; 알파토르크바이러스, 클레이드 2; 알파토르크바이러스, 클레이드 3; 알파토르크바이러스, 클레이드 4; 알파토르크바이러스, 클레이드 5; 알파토르크바이러스, 클레이드 6; 알파토르크바이러스, 클레이드 7; 베타토르크바이러스; 및/또는 감마토르크바이러스)의 ORF1 단백질에 대하여 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 100% 서열 동일성을 보일 수 있다. 실시형태들에서, 보존된 모티프는 각각 1 내지 1000개(예를 들어, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 10 내지 15, 10 내지 20, 15 내지 20, 5 내지 50, 5 내지 100, 10 내지 50, 10 내지 100, 10 내지 1000, 50 내지 100, 50 내지 1000 또는 100 내지 1000개)의 아미노산의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 보존된 모티프는 약 2 내지 4%(예를 들어, 약 1 내지 8%, 1 내지 6%, 1 내지 5%, 1 내지 4%, 2 내지 8%, 2 내지 6%, 2 내지 5% 또는 2 내지 4%)의 ORF1 분자의 서열로 이루어지며, 각각은 야생형 아넬로바이러스 클레이드의 ORF1 단백질 내의 상응하는 모티프에 대하여 100% 서열 동일성을 보인다. 특정 실시형태에서, 보존된 모티프는 약 5 내지 10%(예를 들어, 약 1 내지 20%, 1 내지 10%, 5 내지 20% 또는 5 내지 10%)의 ORF1 분자의 서열로 이루어지며, 각각은 야생형 아넬로바이러스 클레이드의 ORF1 단백질 내의 상응하는 모티프에 대하여 80% 서열 동일성을 보인다. 특정 실시형태에서, 보존된 모티프는 약 10 내지 50%(예를 들어, 약 10 내지 20%, 10 내지 30%, 10 내지 40%, 10 내지 50%, 20 내지 40%, 20 내지 50% 또는 30 내지 50%)의 ORF1 분자의 서열로 이루어지며, 각각은 야생형 아넬로바이러스 클레이드의 ORF1 단백질 내의 상응하는 모티프에 대하여 60% 서열 동일성을 보인다. 일부 실시형태에서, 보존된 모티프는 표 19에 열거된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, ORF1 분자 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 ORF1 단백질에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경)를 포함한다.
N22 도메인 내의 보존된 ORF1 모티프
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 분자)는 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829)을 포함하며, Xn은 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열이다. 예를 들어, X2는 임의의 2개의 아미노산의 인접 서열을 나타낸다. 일부 실시형태에서, YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829)은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, ORF1 분자의 N22 도메인 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 아미노산 서열 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829)을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF1 분자를 인코딩하는 핵산 서열)을 포함하며, Xn은 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 분자)는 예를 들어, N22 도메인 내의, 예를 들어, YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프의 부분을 포함하고/하거나 이에 측접하는 보존된 2차 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 보존된 2차 구조는 제1 베타 가닥 및/또는 제2 베타 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 베타 가닥은 약 5 내지 6개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 베타 가닥은 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프의 N-종말단에 티로신(Y) 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프는 랜덤 코일(예를 들어, 약 8 내지 9개의 아미노산의 랜덤 코일)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 베타 가닥은 약 7 내지 8개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개) 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 베타 가닥은 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프의 C-종말단에 아스파라긴(N) 잔기를 포함한다.
예시적인 YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프-측접 2차 구조는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT/US19/65995호의 실시예 47 및 도 48에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 PCT/US19/65995호의 도 48에 나타낸 2차 구조 요소(예를 들어, 베타 가닥)의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 전부)을 포함하는 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) YNPX2DXGX2N(SEQ ID NO: 829) 모티프에 측접하는, PCT/US19/65995호의 도 48에 나타낸 2차 구조 요소(예를 들어, 베타 가닥) 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 전부)을 포함하는 영역을 포함한다.
ORF1 젤리-롤 도메인 내의 보존된 2차 구조 모티프
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, ORF1 분자)는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 아넬로바이러스 ORF1 단백질에 의해 포함되는 하나 이상의 2차 구조 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은) 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 젤리-롤 도메인에 의해 포함되는 하나 이상의 2차 구조 요소를 포함한다. 일반적으로, ORF1 젤리-롤 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로, 제1 베타 가닥, 제2 베타 가닥, 제1 알파 나선, 제3 베타 가닥, 제4 베타 가닥, 제5 베타 가닥, 제2 알파 나선, 제6 베타 가닥, 제7 베타 가닥, 제8 베타 가닥 및 제9 베타 가닥을 포함하는 2차 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 N-말단에서 C-말단 방향의 순서로, 제1 베타 가닥, 제2 베타 가닥, 제1 알파 나선, 제3 베타 가닥, 제4 베타 가닥, 제5 베타 가닥, 제2 알파 나선, 제6 베타 가닥, 제7 베타 가닥, 제8 베타 가닥 및/또는 제9 베타 가닥을 포함하는 2차 구조를 포함한다.
일부 실시형태에서, 보존된 2차 구조 요소(즉, 베타 가닥 및/또는 알파 나선)의 쌍은 예를 들어, 랜덤 코일 서열, 베타 가닥 또는 알파 나선 또는 그의 조합을 포함하는 개재 아미노산 서열에 의해 분리된다. 보존된 2차 구조 요소 사이의 개재 아미노산 서열은 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 하나 이상의 추가의 베타 가닥 및/또는 알파 나선을 (예를 들어, 젤리-롤 도메인 내에) 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연속 베타 가닥 또는 연속 알파 나선이 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 베타 가닥 및 제2 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제3 베타 가닥 및 제4 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제4 베타 가닥 및 제5 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제6 베타 가닥 및 제7 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제7 베타 가닥 및 제8 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 제8 베타 가닥 및 제9 베타 가닥은 더 큰 베타 가닥 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 제1 베타 가닥은 약 5 내지 7개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 베타 가닥은 약 15 내지 16개(예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 알파 나선은 약 15 내지 17개(예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제3 베타 가닥은 약 3 내지 4개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제4 베타 가닥은 약 10 내지 11개(예를 들어, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제5 베타 가닥은 약 6 내지 7개(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 알파 나선은 약 8 내지 14개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 알파 나선은 (예를 들어, 랜덤 코일 서열에 의해 분리된) 2개의 더 작은 알파 나선으로 파단될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 더 작은 알파 나선의 각각은 약 4 내지 6개(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제6 베타 가닥은 약 4 내지 5개(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제7 베타 가닥은 약 5 내지 6개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제8 베타 가닥은 약 7 내지 9개(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 제9 베타 가닥은 약 5 내지 7개(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산 길이이다.
예시적인 젤리-롤 도메인 2차 구조는 PCT/US19/65995호의 실시예 47 및 도 47에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 분자는 PCT/US19/65995호의 도 47에 나타낸 젤리-롤 도메인 2차 구조 중 임의의 것의 2차 구조 요소(예를 들어, 베타 가닥 및/또는 알파 나선)의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 전부)을 포함하는 영역을 포함한다.
공통 ORF1 도메인 서열
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, ORF1 분자는 젤리-롤 도메인, N22 도메인, 및/또는 C-말단 도메인(CTD) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은) 젤리-롤 도메인 공통 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, N22 도메인은 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은) N22 도메인 공통 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CTD 도메인은 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은) CTD 도메인 공통 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 37A 내지 37C 중 임의의 것에 형식 "(Xa-b)"로 열거된 아미노산은 인접 아미노산의 연속물을 포함하며, 여기서, 연속물은 적어도 a개 및 최대 b개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 연속물에서 모든 아미노산은 동일하다. 다른 실시형태에서, 연속물은 적어도 2개(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개)의 상이한 아미노산을 포함한다.
표 37A. 알파토르크바이러스 ORF1 도메인 공통 서열
Figure pct00062
표 37B. 베타토르크바이러스 ORF1 도메인 공통 서열
Figure pct00063
표 37C. 감마토르크바이러스 ORF1 도메인 공통 서열
Figure pct00064
일부 실시형태에서, 젤리-롤 도메인은 표 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, D2, D4, D6, D8, D10 또는 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 젤리-롤 도메인 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, N22 도메인은 표 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, D2, D4, D6, D8, D10 또는 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 N22 도메인 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CTD 도메인은 표 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, D2, D4, D6, D8, D10 또는 37A 내지 37C 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 CTD 도메인 아미노산 서열 또는 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
ORF1 단백질 서열의 식별
일부 실시형태에서, 아넬로바이러스 ORF1 단백질 서열, 또는 ORF1 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 아넬로바이러스의 게놈(예를 들어, 핵산 시퀀싱 기술, 예를 들어, 심층 시퀀싱 기술에 의해 식별된 추정 아넬로바이러스 게놈)으로부터 식별될 수 있다. 일부 실시형태에서, ORF1 단백질 서열은 다음의 선택 기준 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 또는 3개 모두)에 의해 식별된다:
(i) 길이 선택: 단백질 서열(예를 들어, 하기 (ii) 또는 (iii)에 기재된 기준을 통과하는 추정 아넬로바이러스 ORF1 서열)은 추정 아넬로바이러스 ORF1 단백질을 식별하기 위해 약 600개 초과의 아미노산 잔기에 대해 크기-선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스 ORF1 단백질 서열은 적어도 약 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 알파토르크바이러스 ORF1 단백질 서열은 적어도 약 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 900 또는 1000개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 베타토르크바이러스 ORF1 단백질 서열은 적어도 약 650, 660, 670, 680, 690, 700, 750, 800, 900 또는 1000개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 감마토르크바이러스 ORF1 단백질 서열은 적어도 약 650, 660, 670, 680, 690, 700, 750, 800, 900 또는 1000개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스 ORF1 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 적어도 약 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 또는 2500개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 알파토르크바이러스 ORF1 단백질 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 적어도 약 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2400 또는 2500개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 베타토르크바이러스 ORF1 단백질 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 적어도 약 1900, 1950, 2000, 2500, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2400 또는 2500 또는 1000개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 감마토르크바이러스 ORF1 단백질 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 적어도 약 1900, 1950, 2000, 2500, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2400 또는 2500 또는 1000개의 뉴클레오티드 길이이다.
(ii) ORF1 모티프의 존재: 단백질 서열(예를 들어, 위의 (i) 또는 하기 (iii)에 기재된 기준을 통과하는 추정 아넬로바이러스 ORF1 서열)은 위에 기재된 N22 도메인 내의 보존된 ORF1 모티프를 함유하는 것들을 식별하기 위해 필터링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추정 아넬로바이러스 ORF1 서열은 서열 YNPXXDXGXXN을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추정 아넬로바이러스 ORF1 서열은 서열 Y[NCS]PXXDX[GASKR]XX[NTSVAK]를 포함한다.
(iii) 아르기닌-풍부 영역의 존재: 단백질 서열(예를 들어, 위의 (i) 및/또는 (ii)에 기재된 기준을 통과하는 추정 아넬로바이러스 ORF1 서열)은 아르기닌-풍부 영역(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함하는 것들에 대해 필터링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추정 아넬로바이러스 ORF1 서열은 적어도 약 30%(예를 들어, 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%) 아르기닌 잔기를 포함하는 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70개의 아미노산의 인접 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추정 아넬로바이러스 ORF1 서열은 적어도 30% (예를 들어, 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%) 아르기닌 잔기를 포함하는 약 35 내지 40, 40 내지 45, 45 내지 50, 50 내지 55, 55 내지 60, 60 내지 65 또는 65 내지 70개의 아미노산의 인접 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아르기닌-풍부 영역은 추정 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 시작 코돈의 적어도 약 30, 40, 50, 60, 70 또는 80개의 아미노산 하류에 위치한다. 일부 실시형태에서, 아르기닌-풍부 영역은 추정 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 시작 코돈의 적어도 약 50개의 아미노산 하류에 위치한다.
ORF2 분자
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 ORF2 분자 및/또는 ORF2 분자를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일반적으로, ORF2 분자는 아넬로바이러스 ORF2 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 임의의 것에 열거된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF2 단백질)의 구조적 특징 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은 아넬로바이러스 ORF2 단백질 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, ORF2 분자는 알파토르크바이러스, 베타토르크바이러스 또는 감마토르크바이러스 ORF2 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자(예를 들어, 알파토르크바이러스 ORF2 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자)는 250개 이하의 아미노산(예를 들어, 약 150 내지 200개의 아미노산)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자(예를 들어, 베타토르크바이러스 ORF2 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자)는 약 50 내지 150개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자(예를 들어, 감마토르크바이러스 ORF2 단백질에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 ORF2 분자)는 약 100 내지 200개의 아미노산(예를 들어, 약 100 내지 150개의 아미노산)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 나선-회전-나선 모티프(예를 들어, 회전 영역에 측접하는 2개의 알파 나선을 포함하는 나선-회전-나선 모티프)를 포함한다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 TTV 단리주 TA278 또는 TTV 단리주 SANBAN의 ORF2 단백질의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자는 단백질 포스파타제 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, ORF2 분자 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은(예를 들어, 표 A2, A4, A6, A8, A10, A12, C1 내지 C5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 중 임의의 것에 나타낸 바와 같은) 야생형 ORF2 단백질에 비하여 적어도 하나의 차이(예를 들어, 돌연변이, 화학적 변형 또는 후성적 변경)를 포함한다.
보존된 ORF2 모티프
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, ORF2 분자)는 아미노산 서열 [W/F]X7HX3CX1CX5H(SEQ ID NO: 949)를 포함하며, 여기서, Xn은 임의의 N개의 아미노산의 인접 서열이다. 실시형태들에서, X7은 임의의 7개의 아미노산의 인접 서열을 나타낸다. 실시형태들에서, X3은 임의의 3개의 아미노산의 인접 서열을 나타낸다. 실시형태들에서, X1은 임의의 단일의 아미노산을 나타낸다. 실시형태들에서, X5는 임의의 5개의 아미노산의 인접 서열을 나타낸다. 일부 실시형태에서, [W/F]는 트립토판 또는 페닐알라닌 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, [W/F]X7HX3CX1CX5H(SEQ ID NO: 949)는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ORF2 분자의 N22 도메인 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 유전 요소는 아미노산 서열 [W/F]X7HX3CX1CX5H(SEQ ID NO: 949)를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, ORF2 분자를 인코딩하는 핵산 서열)을 포함하며, 여기서, Xn은 임의의 n개의 아미노산의 인접 서열이다.
유전 요소
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 다음의 특징 중 하나 이상을 갖는다: 숙주 세포의 게놈과 실질적으로 비-통합성임, 에피솜 핵산임, 단일 가닥 RNA임, 환형임, 약 1 내지 10 kb임, 세포의 핵 내에 존재함, 내인성 단백질에 의해 결합될 수 있음, 이펙터, 예컨대 숙주 또는 표적 세포의 유전자, 활성 또는 기능을 표적화하는 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어, RNA, iRNA, 마이크로RNA)를 생성함. 일 실시형태에서, 유전 요소는 실질적으로 비-통합성이다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 패키징 신호, 예를 들어, 캡시드 단백질에 결합하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 패키징 또는 캡시드-결합 서열의 외부에서, 유전 요소는 야생형 아넬로바이러스 핵산 서열에 대하여 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만의 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 이는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 핵산 서열에 대하여 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 패키징 또는 캡시드-결합 서열의 외부에서, 유전 요소는 아넬로바이러스 핵산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 8%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100개 미만의 인접 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 20 kb 미만(예를 들어, 약 19 kb, 18 kb, 17 kb, 16 kb, 15 kb, 14 kb, 13 kb, 12 kb, 11 kb, 10kb, 9 kb, 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb 또는 그 미만)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 독립적으로 또는 부가적으로 1000b 초과(예를 들어, 적어도 약 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2 kb, 2.1 kb, 2.2 kb, 2.3 kb, 2.4 kb, 2.5 kb, 2.6 kb, 2.7 kb, 2.8 kb, 2.9 kb, 3 kb, 3.1 kb, 3.2 kb, 3.3 kb, 3.4 kb, 3.5 kb, 3.6 kb, 3.7 kb, 3.8 kb, 3.9 kb, 4 kb, 4.1 kb, 4.2 kb, 4.3 kb, 4.4 kb, 4.5 kb, 4.6 kb, 4.7 kb, 4.8 kb, 4.9 kb, 5 kb 이상)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2.5 내지 4.6, 2.8 내지 4.0, 3.0 내지 3.8 또는 3.2 내지 3.7 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 1.5 내지 2.0, 1.5 내지 2.5, 1.5 내지 3.0, 1.5 내지 3.5, 1.5 내지 3.8, 1.5 내지 3.9, 1.5 내지 4.0, 1.5 내지 4.5 또는 1.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2.0 내지 2.5, 2.0 내지 3.0, 2.0 내지 3.5, 2.0 내지 3.8, 2.0 내지 3.9, 2.0 내지 4.0, 2.0 내지 4.5 또는 2.0 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2.5 내지 3.0, 2.5 내지 3.5, 2.5 내지 3.8, 2.5 내지 3.9, 2.5 내지 4.0, 2.5 내지 4.5 또는 2.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 3.0 내지 5.0, 3.5 내지 5.0, 4.0 내지 5.0 또는 4.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 1.5 내지 2.0, 2.0 내지 2.5, 2.5 내지 3.0, 3.0 내지 3.5, 3.1 내지 3.6, 3.2 내지 3.7, 3.3 내지 3.8, 3.4 내지 3.9, 3.5 내지 4.0, 4.0 내지 4.5 또는 4.5 내지 5.0 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 3.6 내지 3.9 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2.8 내지 2.9 kb의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 약 2.0 내지 3.2 kb의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에 기재된 특징, 예를 들어, 실질적으로 비-병원성인 단백질을 인코딩하는 서열, 단백질 결합 서열, 조절 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 서열, 하나 이상의 조절 서열, 복제 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 서열 및 기타 서열 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태에서, 유전 요소는 이중-가닥 환형 DNA로부터 생성되었다(예를 들어, 전사에 의해 생성됨).
일부 실시형태에서, 유전 요소는 하나 이상의 박테리아 플라스미드 요소(예를 들어, 박테리아 복제 원점 또는 선택 가능한 마커, 예를 들어, 박테리아 내성 유전자)를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 박테리아 플라스미드 백본을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 실질적으로 비-병원성인 외부 단백질, (ii) 유전 요소를 실질적으로 비-병원성인 외부 단백질에 결합시키는 외부 단백질 결합 서열 및 (iii) 조절 핵산을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, RNA 서열)을 포함하는 유전 요소를 제공한다. 이러한 실시형태에서, 유전 요소는 고유 바이러스 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 고유 아넬로바이러스 서열)에 대한 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
단백질 결합 서열
일부 실시형태에서, 유전 요소는 실질적으로 비-병원성인 단백질에 결합하는 단백질 결합 서열을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 단백질성 외부로의 유전 요소의 패키징을 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 실질적으로 비-병원성인 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 PCT/US19/65995호의 실시예 8에 기재된 바와 같은 단백질 결합 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 서열의 5' UTR 보존된 도메인 또는 GC-풍부 도메인에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단백질 결합 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 단백질 결합 서열은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 5' UTR 보존된 도메인 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
5' UTR 영역
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자(예를 들어, 유전 요소, 유전 요소 작제물 또는 유전 요소 영역)는 5' UTR 서열, 예를 들어, 본원에(예를 들어, 표 A1, B1 또는 C1 중 임의의 것에) 기재된 바와 같은 5' UTR 보존된 도메인 서열, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 핵산 서열 AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGGGX1CAGTCT, 또는 이에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 핵산 서열 AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGGGX1CAGTCT, 또는 이에 비하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 차이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, X1은 A이다. 실시형태들에서, X1은 부재이다.
일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 알파토르크바이러스의 5' UTR의 핵산 서열(예를 들어, 고리1), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 5' UTR 서열은 표 A1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인의 핵산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 A1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 A1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 95.775% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 A1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 A1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 97.183% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 핵산 서열 AGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGC, 또는 이에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 핵산 서열 AGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGC, 또는 이에 비하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 차이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 베타토르크바이러스의 5' UTR의 핵산 서열(예를 들어, 고리2), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 5' UTR 서열은 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인의 핵산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 87% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 87.324% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 88% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 88.732% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 91% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 91.549% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 92.958% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 94% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 94.366% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 95.775% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 B1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 97.183% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 핵산 서열 AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGATCAGTCT, 또는 이에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 핵산 서열 AGGTGAGTGAAACCACCGAAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTAGATCAGTCT, 또는 이에 비하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 차이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 감마토르크바이러스의 5' UTR의 핵산 서열(예를 들어, 고리4), 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 5' UTR 서열은 표 C1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인의 핵산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 C1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 표 C1에 열거된 5' UTR 보존된 도메인에 대하여 적어도 97.183% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 핵산 서열 AGGTGAGTGAAACCACCGAGGTCTAGGGGCAATTCGGGCTAGGGCAGTCT, 또는 이에 대하여 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 5' UTR 서열은 핵산 서열 AGGTGAGTGAAACCACCGAGGTCTAGGGGCAATTCGGGCTAGGGCAGTCT, 또는 이에 비하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 차이(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 아넬로바이러스 5' UTR 서열, 예를 들어, 표 38에 나타낸 핵산 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 공통 5' UTR 서열의 핵산 서열을 포함하며, X1, X2, X3, X4 및 X5는 각각 독립적으로, 임의의 뉴클레오티드이며, 예를 들어, X1 = G 또는 T이며, X2 = C 또는 A이며, X3 = G 또는 A이며, X4 = T 또는 C이며, X5 = A, C 또는 T이다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 공통 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 예시적인 TTV 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-CT30F 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-HD23a 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-JA20 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-TJN02 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 TTV-tth8 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 공통 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 1 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 2 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 3 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 4 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 5 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 6 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 38에 나타낸 알파토르크바이러스 클레이드 7 5' UTR 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
표 38. 아넬로바이러스로부터의 예시적인 5' UTR 서열
Figure pct00065
Figure pct00066
5' UTR 서열의 식별
일부 실시형태에서, 아넬로바이러스 5' UTR 서열은 아넬로바이러스의 게놈(예를 들어, 핵산 시퀀싱 기술, 예를 들어, 심층 시퀀싱 기술에 의해 식별된 추정 아넬로바이러스 게놈) 내에서 식별될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로바이러스 5' UTR 서열은 다음의 단계 중 하나 또는 둘 모두에 의해 식별된다:
(i) 환화 접합점의 식별: 일부 실시형태에서, 5' UTR은 전장의 환화된 아넬로바이러스 게놈의 환화 접합점 근처에 위치할 것이다. 환화 접합점은 예를 들어, 서열의 중첩 영역을 식별함으로써 식별될 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열의 중첩 영역은 환화된 전장 아넬로바이러스 게놈 서열을 생성하기 위해 서열로부터 트리밍될 수 있다. 일부 실시형태에서, 게놈 서열은 소프트웨어를 사용하여 이러한 방식으로 환화된다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 게놈을 전산적으로 환화하면 서열의 시작 위치가 비-생물학적으로 배향되는 것을 초래할 수 있다. 서열 내의 랜드마크는 서열을 적절한 방향으로 재-배향하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 랜드마크 서열은 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 게놈 내의 하나 이상의 요소(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 아넬로바이러스의 TATA 박스, 캡 부위, 개시자 요소, 전사 시작 부위, 5' UTR 보존된 도메인, ORF1, ORF1/1, ORF1/2, ORF2, ORF2/2, ORF2/3, ORF2t/3, 3개의 오픈-리딩 프레임 영역, 폴리(A) 신호 또는 GC-풍부 영역 중 하나 이상)에 대하여 실질적으로 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
(ii) 5' UTR 서열의 식별: 추정 아넬로바이러스 게놈 서열이 수득되면, 서열(또는 예를 들어, 약 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90 또는 90 내지 100개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 그의 일부)은 이에 실질적으로 상동성을 갖는 서열을 식별하기 위해 하나 이상의 아넬로바이러스 5' UTR 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)과 비교될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추정 아넬로바이러스 5' UTR 영역은 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 5' UTR 서열에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
GC-풍부 영역
일부 실시형태에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 핵산 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 GC-풍부 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 바와 같은 36-뉴클레오티드 GC-풍부 서열(예를 들어, 36-뉴클레오티드 공통 GC-풍부 영역 서열 1, 36-뉴클레오티드 공통 GC-풍부 영역 서열 2, TTV 클레이드 1 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 단리주 GH1 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 sle1932 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 4 ctdc002 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 5 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 6 36-뉴클레오티드 영역 또는 TTV 클레이드 7 36-뉴클레오티드 영역)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 바와 같은 36-뉴클레오티드 GC-풍부 서열(예를 들어, 36-뉴클레오티드 공통 GC-풍부 영역 서열 1, 36-뉴클레오티드 공통 GC-풍부 영역 서열 2, TTV 클레이드 1 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 단리주 GH1 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 3 sle1932 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 4 ctdc002 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 5 36-뉴클레오티드 영역, TTV 클레이드 6 36-뉴클레오티드 영역 또는 TTV 클레이드 7 36-뉴클레오티드 영역)의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 예를 들어, 표 39에 열거된 바와 같은, 예를 들어, TTV-CT30F, TTV-P13-1, TTV-tth8, TTV-HD20a, TTV-16, TTV-TJN02 또는 TTV-HD16d로부터 선택되는 알파토르크바이러스 GC-풍부 영역 서열에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 예를 들어, 표 39에 열거된 바와 같은, 예를 들어, TTV-CT30F, TTV-P13-1, TTV-tth8, TTV-HD20a, TTV-16, TTV-TJN02 또는 TTV-HD16d로부터 선택되는 알파토르크바이러스 GC-풍부 영역 서열의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 104, 105, 108, 110, 111, 115, 120, 122, 130, 140, 145, 150, 155 또는 156개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
실시형태들에서, 36-뉴클레오티드 GC-풍부 서열은 하기로부터 선택된다:
(i) CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160),
(ii) GCGCTX1CGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 164), 여기서, X1은 T, G 또는 A로부터 선택됨;
(iii) GCGCTTCGCGCGCCGCCCACTAGGGGGCGTTGCGCG(SEQ ID NO: 165);
(iv) GCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGCGCAATGCG(SEQ ID NO: 166);
(v) GCGCTGCGCGCGCGGCCCCCGGGGGAGGCATTGCCT(SEQ ID NO: 167);
(vi) GCGCTGCGCGCGCGCGCCGGGGGGGCGCCAGCGCCC(SEQ ID NO: 168);
(vii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 169);
(viii) GCGCTTCGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 170);
(ix) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTGCGCCCCCCC(SEQ ID NO: 171); 또는
(x) GCGCTACGCGCGCGCGCCGGGGGGCTCTGCCCCCCC(SEQ ID NO: 172).
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 핵산 서열 CGCGCTGCGCGCGCCGCCCAGTAGGGGGAGCCATGC(SEQ ID NO: 160)를 포함한다.
실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 공통 GC-풍부 서열의 핵산 서열을 포함하며, X1, X4, X5, X6, X7, X12, X13, X14, X15, X20, X21, X22, X26, X29, X30 및 X33은 각각 독립적으로 임의의 뉴클레오티드이며, X2, X3, X8, X9, X10, X11, X16, X17, X18, X19, X23, X24, X25, X27, X28, X31, X32 및 X34는 각각 독립적으로 부재이거나, 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, X1 내지 X34 중 하나 이상(예를 들어, 이들 전부)는 각각 독립적으로 표 39에 특정된 뉴클레오티드(또는 부재)이다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 예시적인 TTV GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 3)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-CT30F GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3, 단편 4, 단편 5, 단편 6, 단편 7, 단편 8 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 7)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-HD23a GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3, 단편 4, 단편 5, 단편 6 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 6)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-JA20 GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 및 2)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-TJN02 GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3, 단편 4, 단편 5, 단편 6, 단편 7, 단편 8 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 8)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 TTV-tth8 GC-풍부 서열(예를 들어, 전체 서열, 단편 1, 단편 2, 단편 3, 단편 4, 단편 5, 단편 6, 단편 7, 단편 8, 단편 9 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 순서대로 단편 1 내지 6)에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 단편 7에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 단편 8에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 실시형태들에서, 유전 요소(예를 들어, 유전 요소의 단백질-결합 서열)는 표 39에 나타낸 단편 9에 대하여 적어도 약 75%(예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
표 39. 아넬로바이러스로부터의 예시적인 GC-풍부 서열
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
이펙터
일부 실시형태에서, 유전 요소는 이펙터, 예를 들어, 기능적 이펙터, 예를 들어, 내인성 이펙터 또는 외인성 이펙터, 예를 들어, 치료적 폴리펩티드 또는 핵산, 예를 들어, 세포독성 또는 세포용해 RNA 또는 단백질이거나, 이를 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기능적 핵산은 비-코딩 RNA이다. 일부 실시형태에서, 기능적 핵산은 코딩 RNA이다. 이펙터는 생물학적 활성을 조절할 수 있으며, 예를 들어, 효소 활성, 유전자 발현, 세포 신호전달 및 세포 또는 기관 기능을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 이펙터 활성은 또한 조절 단백질에 결합하여, 조절제의 활성, 예컨대 전사 또는 번역을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 이펙터 활성은 또한, 활성화제 또는 저해제 기능을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터는 효소에서 증가된 기질 친화성을 촉발시킴으로써 효소 활성을 유도할 수 있으며, 예를 들어, 프룩토스 2,6-비스포스페이트는 포스포프룩토키나제 1을 활성화시키고, 인슐린에 반응하여 당분해 속도를 증가시킨다. 또 다른 예에서, 이펙터는 수용체로의 기질 결합을 저해하고, 그의 활성화를 저해할 수 있으며, 예를 들어, 날트렉손(naltrexone) 및 날록손(naloxone)은 활성화시키지 않고 오피오이드 수용체에 결합하며, 오피오이드에 결합하는 수용체의 능력을 차단한다. 이펙터 활성은 또한, 단백질 안정성/분해 및/또는 전사물 안정성/분해를 조절하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 분해를 위해 폴리펩티드 보조-인자, 유비퀴틴에 의해 단백질 상에 표적화되어, 분해를 위해 그들을 표시할 수 있다. 또 다른 예에서, 이펙터는 효소의 활성 부위를 차단함으로써 효소 활성을 저해하며, 예를 들어, 메토트렉세이트는 천연 기질보다 1000배 더 단단하게 다이하이드로폴레이트 환원효소에 결합하고, 뉴클레오티드 염기 합성을 저해하는, 효소 다이하이드로폴레이트 환원효소에 대한 보조효소인 테트라하이드로폴레이트의 구조적 유사체이다.
일부 실시형태에서, 이펙터를 인코딩하는 서열은 100 내지 2000개, 100 내지 1000개, 100 내지 500개, 100 내지 200개, 200 내지 2000개, 200 내지 1000개, 200 내지 500개, 500 내지 1000, 500 내지 2000 또는 1000 내지 2000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 핵산 또는 단백질 페이로드이다.
조절 핵산
일부 실시형태에서, 이펙터는 조절 핵산이다. 조절 핵산은 내인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 변경시킨다. 일 실시형태에서, 조절 핵산은 숙주 유전자를 표적화한다. 조절 핵산은 내인성 유전자(예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA)에 혼성화되는 핵산, 외인성 핵산, 예컨대 바이러스 DNA 또는 RNA에 혼성화하는 핵산, RNA에 혼성화하는 핵산, 유전자 전사를 간섭하는 핵산, RNA 번역을 간섭하는 핵산, RNA를 안정화시키거나, 예컨대 분해에 대한 표적화를 통하여 RNA를 불안정화시키는 핵산, 및 DNA 또는 RNA 결합 인자를 조절하는 핵산을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 실시형태들에서, 조절 핵산은 miRNA를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 야생형 아넬로바이러스에 대하여 내인성이다. 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 야생형 아넬로바이러스에 대하여 외인성이다.
일부 실시형태에서, 조절 핵산은 전형적으로 5 내지 500개의 염기쌍(특정 RNA 구조에 따라, 예를 들어, miRNA 5 내지 30 bp, lncRNA 200 내지 500 bp)을 함유하는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 포함하며, 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열 또는 세포 내의 발현된 표적 유전자를 인코딩하는 서열과 동일하거나(또는 상보성이거나) 거의 동일한(또는 실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절 핵산은 핵산 서열, 예를 들어, 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 표적화 모이어티는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. gRNA 짧은 합성 RNA는 불완전한 이펙터 모이어티로의 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열 및 게놈 표적에 대한 사용자-정의된 약 20개의 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성될 수 있다. 실시에서, 가이드 RNA 서열은 일반적으로 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖도록 설계되고 표적화된 핵산 서열에 대하여 상보성이다. 커스텀 gRNA 생성자 및 알고리즘은 효율적인 가이드 RNA의 설계에 사용하기 위하여 상업적으로 이용 가능하다. 유전자 편집은 또한, 자연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고 tracrRNA(뉴클레아제에 결합) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집에 대해 표적화된 서열로 가이드함) 둘 모두를 함유하는 엔지니어링된(합성) 단일 RNA 분자인, 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA")를 사용하여 달성되었다. 화학적으로 변형된 sgRNA는 또한, 게놈 편집에서 효율적인 것으로 입증되었으며; 예를 들어, 문헌[Hendel et al. (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991]을 참조한다.
조절 핵산은 특정 DNA 서열(예를 들어, 프로모터, 유전자의 인핸서, 침묵자 또는 억제자에 인접하거나 그 내의 서열)을 인식하는 gRNA를 포함한다.
특정 조절 핵산은 RNA 간섭(RNAi)의 생물학적 프로세스를 통하여 유전자 발현을 저해할 수 있다. RNAi 분자는 전형적으로 15 내지 50개의 염기쌍(예컨대 약 18 내지 25개의 염기쌍)을 함유하고, 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열과 동일하거나(상보성이거나) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 갖는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 포함한다. RNAi 분자는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 메로듀플렉스(meroduplex) 및 다이서(dicer) 기질(미국 특허 제8,084,599호, 제8,349,809호 및 제8,513,207호)을 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
긴 비-코딩 RNA(lncRNA)는 100개 초과의 뉴클레오티드의 비-단백질 코딩 전사물로서 정의된다. 이러한 다소 임의의 제한은 lncRNA를 소형 조절 RNA, 예컨대 마이크로RNA(miRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA) 및 다른 짧은 RNA로부터 구별한다. 일반적으로, 대다수(약 78%)의 lncRNA는 조직-특이적인 것으로 특성화된다. 근처의 단백질-코딩 유전자에 대하여 반대 방향으로 전사되는(포유동물 게놈 내에 총 lncRNA의 유의미한 비율 약 20%를 포함하는) 분지 lncRNA는 아마도 근처의 유전자의 전사를 조절할 수 있다.
유전 요소는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA)의 전부 또는 그의 단편에 실질적으로 상보성이거나, 완전히 상보성인 서열을 갖는 조절 핵산을 인코딩할 수 있다. 조절 핵산은 인트론과 엑손 사이의 경계에서의 서열에 상보성이어서, 특정 유전자의 새로 생성된 핵 RNA 전사물이 전사를 위해 mRNA로 성숙되는 것을 방지할 수 있다. 특정 유전자에 상보성인 조절 핵산은 당해 유전자에 대한 mRNA와 혼성화하고, 그의 번역을 방지할 수 있다. 안티센스 조절 핵산은 DNA, RNA 또는 그의 유도체 또는 혼성물일 수 있다.
관심 전사물에 혼성화하는 조절 핵산의 길이는 5 내지 30개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 30개의 뉴클레오티드 또는 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사물에 대한 조절 핵산의 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%여야 한다.
유전 요소는 조절 핵산, 예를 들어, 표적 유전자의 약 5 내지 약 25개의 인접 뉴클레오티드와 동일한 마이크로 RNA(miRNA) 분자를 인코딩할 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 서열은 mRNA를 표적화하며, 다이뉴클레오티드 AA로 시작하며, 약 30 내지 70%(약 30 내지 60%, 약 40 내지 60% 또는 약 45% 내지 55%)의 GC-함량을 포함하며, 예를 들어, 표준 BLAST 검색에 의해 결정시, 그것이 도입될 포유동물의 게놈 내의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열에 대하여 높은 동일성 백분율을 갖지 않는다.
siRNA 및 shRNA는 내인성 마이크로RNA(miRNA) 유전자의 가공 경로 내의 중간체와 유사하다(문헌[Bartel, Cell 116:281-297, 2004]). 일부 실시형태에서, siRNA는 miRNA로서 기능할 수 있으며, 그 역도 그러하다(문헌[Zeng et al., Mol Cell 9:1327-1333, 2002]; 문헌[Doench et al., Genes Dev 17:438-442, 2003]). siRNA와 같이 마이크로RNA는 RISC를 사용하여, 표적 유전자를 하향조절하지만, siRNA와 달리, 대부분의 동물 miRNA는 mRNA를 절단하지 않는다. 대신에, miRNA는 번역 억제 또는 폴리A 제거 및 mRNA 분해를 통해 단백질 출력물을 감소시킨다(문헌[Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4034-4039, 2006]). 알려진 miRNA 결합 부위는 mRNA 3' UTR 내에 존재하며; miRNA는 miRNA의 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 2 내지 8에 대하여 거의 완벽하게 상보성을 갖는 부위를 표적화하는 것으로 보인다(문헌[Rajewsky, Nat Genet 38 Suppl:S8-13, 2006]; 문헌[Lim et al., Nature 433:769-773, 2005]). 이러한 영역은 씨드 영역으로 공지되어 있다. siRNA 및 miRNA가 상호 교환 가능하기 때문에, 외인성 siRNA는 siRNA에 대하여 씨드 상보성을 갖는 mRNA를 하향조절한다(문헌[Birmingham et al., Nat Methods 3:199-204, 2006]). 3' UTR 내의 다수의 표적 부위는 더 강한 하향조절을 제공한다(문헌[Doench et al., Genes Dev 17:438-442, 2003]).
알려진 miRNA 서열의 목록은 특히 Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 및 European Molecule Biology Laboratory와 같은 연구 기관에 의해 유지되는 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 또한, 알려진 효과적인 siRNA 서열 및 동족(cognate) 결합 부위는 관련 문헌에서 잘 나타나 있다. RNAi 분자는 해당 분야에 알려진 기술에 의해 쉽게 설계되고 생성된다. 또한, 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 찾는 기회를 증가시키는 컴퓨터 기반 도구가 존재한다(문헌[Lagana et al., Methods Mol. Bio., 2015, 1269:393-412]).
조절 핵산은 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절할 수 있다. 다수의 유전자가 서로 어느 정도의 서열 상동성을 공유할 수 있기 때문에, 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자의 부류를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 상이한 유전자 표적 간에 공유되는 또는 특정 유전자 표적에 특유한 서열에 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 몇몇의 유전자 간에 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적화하여, 그에 의해, 유전자 과 내의 몇몇의 유전자(예를 들어, 상이한 유전자 아이소폼, 슬라이스 변이체, 돌연변이 유전자 등)를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절 핵산은 단일 유전자의 특정 RNA 서열에 특유한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 조절 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본원의 다른 곳에 기재된 gRNA는 유전자 편집을 위한 CRISPR 시스템의 부분으로서 사용된다. 유전자 편집의 목적을 위하여, 아넬로벡터는 요망되는 표적 DNA 서열에 상응하는 하나의 또는 다수의 가이드 RNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Cong et al. (2013) Science, 339:819-823]; 문헌[Ran et al. (2013) Nature Protocols, 8:2281 - 2308]을 참조한다. 적어도 약 16 또는 17개의 뉴클레오티드의 gRNA 서열은 일반적으로 Cas9-매개된 DNA 절단이 발생하게 하며; Cpf1에 있어서, 적어도 약 16개의 뉴클레오티드의 gRNA 서열이 검출 가능한 DNA 절단을 달성하는 데 필요하다.
치료적 이펙터(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드)
일부 실시형태에서, 유전 요소는 치료적 발현 서열, 예를 들어, 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 세포내 펩티드 또는 세포내 폴리펩티드, 분비 폴리펩티드 또는 단백질 대체 치료제를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 단백질, 예를 들어, 치료적 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 치료적 단백질의 일부 예는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체(예를 들어, 적어도 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 하나 또는 복수의 폴리펩티드), 전사 인자, 수용체(예를 들어, 막 수용체), 리간드, 막 수송체, 분비 단백질, 펩티드, 담체 단백질, 구조 단백질, 뉴클레아제 또는 그의 구성성분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 펩티드, 예를 들어, 치료적 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 펩티드는 약 5 내지 약 500개의 아미노산, 약 15 내지 약 400개의 아미노산, 약 20 내지 약 325개의 아미노산, 약 25 내지 약 250개의 아미노산, 약 50 내지 약 200개의 아미노산 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 치료적 발현 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 위의 것들 중 임의의 기능적 변이체 또는 그의 단편, 예를 들어, 그의 UniProt ID를 참조하여 본원의 표에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질일 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료적 발현 서열은 위의 것들 중 임의의 것에 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 그의 UniProt ID를 참조하여 본원의 표에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질에 대한 항체를 인코딩할 수 있다. 본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 이들이 요망되는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하는 다양한 항체 구조를 포괄한다. "항체 단편"은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄를 포함하고 항원에 결합하는 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 세포내 폴리펩티드 이펙터
일부 실시형태에서, 이펙터는 사이토졸 폴리펩티드 또는 사이토졸 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 DPP-4 억제제, GLP-1 신호전달의 활성화제 또는 호중구 엘라스타제의 억제제인 사이토졸 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 성장 인자 또는 그의 수용체(예를 들어, FGF 수용체, 예를 들어, FGFR3)의 수준 또는 활성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 n-myc 상호작용 단백질 활성의 억제제(예를 들어, n-myc 상호작용 단백질 억제제); EGFR 활성의 억제제(예를 들어, EGFR 억제제); IDH1 및/또는 IDH2 활성의 억제제(예를 들어, IDH1 억제제 및/또는 IDH2 억제제); LRP5 및/또는 DKK2 활성의 억제제(예를 들어, LRP5 및/또는 DKK2 억제제); KRAS 활성의 억제제; HTT 활성의 활성화제; 또는 DPP-4 활성의 억제제(예를 들어, DPP-4 억제제)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이펙터는 조절 세포내 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절 세포내 폴리펩티드는 표적 세포에 대하여 내인성인 하나 이상의 분자(예를 들어, 단백질 또는 핵산)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 조절 세포내 폴리펩티드는 표적 세포에 대하여 내인성인 하나 이상의 분자(예를 들어, 단백질 또는 핵산)의 수준 또는 활성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 조절 세포내 폴리펩티드는 표적 세포에 대하여 내인성인 하나 이상의 분자(예를 들어, 단백질 또는 핵산)의 수준 또는 활성을 감소시킨다.
예시적인 분비 폴리펩티드 이펙터
예시적인 분비 치료제는 본원에서, 예를 들어, 하기 표에 기재되어 있다.
표 50. 예시적인 사이토카인 및 사이토카인 수용체
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 50의 사이토카인, 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 상동체(예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 그의 UniProt ID를 참조하여 표 50에 열거된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 동일한 조건 하에서 동일한 수용체에 대해 상응하는 야생형 사이토카인의 Kd보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이하로 더 높거나 더 낮은 Kd로 상응하는 사이토카인 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, 이펙터는 제1 영역(예를 들어, 표 50의 사이토카인 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편) 및 제2, 이종 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 영역은 표 50의 제1 사이토카인 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 제2 영역은 표 50의 제2 사이토카인 폴리펩티드이며, 여기서 제1 및 제2 사이토카인 폴리펩티드는 야생형 세포에서 서로 사이토카인 이종이합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 표 50의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체는 신호 서열, 예를 들어, 이펙터에 대하여 내인성인 신호 서열 또는 이종 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 50의 사이토카인을 인코딩하는 아넬로벡터 또는 그의 기능적 변이체는 본원에 기재된 질병 또는 장애의 치료에 사용된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 50의 사이토카인에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 50의 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 분자는 신호 서열을 포함한다.
예시적인 사이토카인 및 사이토카인 수용체는 예를 들어, 그 안의 표 I를 포함하여 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Akdis et al., "Interleukins (from IL-1 to IL-38), interferons, transforming growth factor β, and TNF-α: Receptors, functions, and roles in diseases" October 2016 Volume 138, Issue 4, Pages 984-1010]에 기재되어 있다.
표 51. 예시적인 폴리펩티드 호르몬 및 수용체
Figure pct00077
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 51의 호르몬, 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 상동체(예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 그의 UniProt ID를 참조하여 표 51에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 동일한 조건 하에서 동일한 수용체에 대해 상응하는 야생형 호르몬의 Kd보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이하 더 높은 Kd로 상응하는 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표 51의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체는 신호 서열, 예를 들어, 이펙터에 대하여 내인성인 신호 서열 또는 이종 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 51의 호르몬을 인코딩하는 아넬로벡터 또는 그의 기능적 변이체는 본원에 기재된 질병 또는 장애의 치료에 사용된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 51의 호르몬에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 51의 호르몬 수용체에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 분자는 신호 서열을 포함한다.
표 52. 예시적인 성장 인자
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 52의 성장 인자, 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 상동체(예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 그의 UniProt ID를 참조하여 표 52에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 동일한 조건 하에서 동일한 수용체에 대해 상응하는 야생형 성장 인자의 Kd보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이하 더 높은 Kd로 상응하는 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표 52의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체는 신호 서열, 예를 들어, 이펙터에 대하여 내인성인 신호 서열 또는 이종 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 52의 성장 인자를 인코딩하는 아넬로벡터 또는 그의 기능적 변이체는 본원에 기재된 질병 또는 장애의 치료에 사용된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 52의 성장 인자에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 52의 성장 인자 수용체에 결합하는 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 분자는 신호 서열을 포함한다.
예시적인 성장 인자 및 성장 인자 수용체는 예를 들어, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Bafico et al., "Classification of Growth Factors and Their Receptors" Holland-Frei Cancer Medicine. 6th edition]에 기재되어 있다.
표 53. 응고-연관된 인자
Figure pct00081
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 53의 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 상동체(예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 그의 UniProt ID를 참조하여 표 53에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 상응하는 야생형 단백질과 동일한 반응을, 예를 들어, 야생형 단백질보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이하의 더 낮은 속도로 촉매한다. 일부 실시형태에서, 표 53의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체는 신호 서열, 예를 들어, 이펙터에 대하여 내인성인 신호 서열 또는 이종 신호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 53의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체를 인코딩하는 아넬로벡터는 표 53의 질병 또는 장애의 치료에 사용된다.
예시적인 단백질 대체 치료제
예시적인 단백질 대체 치료제는 본원에, 예를 들어, 하기 표에 기재되어 있다.
표 54. 예시적인 효소 이펙터 및 상응하는 적응증
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 54의 효소 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 상동체(예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 그의 UniProt ID를 참조하여 표 54에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 예를 들어, 야생형 단백질보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 더 낮은 속도로, 상응하는 야생형 단백질과 동일한 반응을 촉매시킨다. 일부 실시형태에서, 표 54의 효소 또는 그의 기능적 변이체를 인코딩하는 아넬로벡터는 표 54의 질병 또는 장애의 치료를 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 우리딘 다이포스페이트 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 또는 그의 기능적 변이체를 표적 세포, 예를 들어, 간 세포로 운반하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 OCA1 또는 그의 기능적 변이체를 표적 세포, 예를 들어, 망막 세포로 운반하기 위해 사용된다.
표 55. 예시적인 비-효소적 이펙터 및 상응하는 적응증
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 에리트로포이에틴(EPO), 예를 들어, 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에리트로포이에틴 또는 그의 기능적 변이체를 인코딩하는 아넬로벡터는 적혈구형성을 자극하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 에리트로포이에틴 또는 그의 기능적 변이체를 인코딩하는 아넬로벡터는 질병 또는 장애, 예를 들어, 빈혈의 치료를 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 EPO 또는 그의 기능적 변이체를 표적 세포, 예를 들어, 적혈구로 운반하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 표 55의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 상동체(예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그) 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 그의 UniProt ID를 참조하여 표 55에 열거된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표 55의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체를 인코딩하는 아넬로벡터는 표 55의 질병 또는 장애의 치료에 사용된다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 SMN 또는 그의 기능적 변이체를 표적 세포, 예를 들어, 척수 및/또는 운동 뉴런의 세포로 운반하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 마이크로-디스트로핀을 표적 세포, 예를 들어, 근세포로 운반하기 위해 사용된다.
예시적인 마이크로-디스트로핀은 문헌[Duan, "Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy." Mol Ther. 2018 Oct 3;26(10):2337-2356. doi: 10.1016/j.ymthe.2018.07.011. Epub 2018 Jul 17]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 응고 인자, 예를 들어, 본원에서 표 54 또는 표 55에 열거된 응고 인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 돌연변이되는 경우 리소좀 축적 장애를 야기하는 단백질, 예를 들어, 본원에서 표 54 또는 표 55에 열거된 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 이펙터는 수송체 단백질, 예를 들어, 본원에서 표 55에 열거된 수송체 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 야생형 단백질의 기능적 변이체는 야생형 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 단백질을 포함하며, 예를 들어, 기능적 변이체는 예를 들어, 야생형 단백질보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 더 낮은 속도로, 상응하는 야생형 단백질과 동일한 반응을 촉매시킨다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 야생형 단백질에 의해 결합되는 동일한 결합 파트너에, 예를 들어, 동일한 조건 하의 동일한 결합 파트너에 대해 상응하는 야생형 단백질의 Kd보다 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이하로 더 큰 Kd로 결합한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 야생형 폴리펩티드의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 상응하는 야생형 단백질의 상동체(예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 융합물은 상응하는 야생형 단백질에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 제1 영역 및 제2 이종 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기능적 변이체는 상응하는 야생형 단백질의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진다.
재생, 복구 및 섬유증 인자
본원에 기재된 치료적 폴리펩티드는 예를 들어, 표 56에 개시된 바와 같은 성장 인자 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 UniProt ID를 참조하여 표 56에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질도 포함한다. 이러한 성장 인자에 대한 항체 또는 그의 단편, 또는 재생 및 복구를 촉진하는 miRNA도 포함된다.
표 56. 예시적인 재생, 복구 및 섬유증 인자
Figure pct00092
형질전환 인자
본원에 기재된 치료적 폴리펩티드는 형질전환 인자, 예를 들어, 섬유아세포를 분화 세포로 형질전환시키는 단백질 인자, 예를 들어, 표 57에 개시된 인자 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 UniProt ID를 참조하여 표 57에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질도 포함한다.
표 57. 예시적인 형질전환 인자
Figure pct00093
세포 재생을 촉진하는 단백질
본원에 기재된 치료적 폴리펩티드는 세포 재생을 자극하는 단백질, 예를 들어, 표 58에 개시된 단백질 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어, 그의 UniProt ID를 참조하여 표 58에 개시된 단백질 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% 동일성을 갖는 단백질도 포함한다.
표 58. 세포 재생을 자극하는 예시적인 단백질
Figure pct00094
STING 조절자 이펙터
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 분비 이펙터는 STING/cGAS 신호전달을 조절한다. 일부 실시형태에서, STING 조절자는 폴리펩티드, 예를 들어, 바이러스 폴리펩티드 또는 그의 기능적 변이체이다. 예를 들어, 이펙터는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Maringer et al. "Message in a bottle: lessons learned from antagonism of STING signalling during RNA virus infection" Cytokine & Growth Factor Reviews Volume 25, Issue 6, December 2014, Pages 669-679]에 기재된 STING 조절자(예를 들어, 억제제)를 포함할 수 있다. 추가의 STING 조절자(예를 들어, 활성화제)는 예를 들어, 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Wang et al. "STING activator c-di-GMP enhances the anti-tumor effects of peptide vaccines in melanoma-bearing mice." Cancer Immunol Immunother. 2015 Aug;64(8):1057-66. doi: 10.1007/s00262-015-1713-5. Epub 2015 May 19; Bose "cGAS/STING Pathway in Cancer: Jekyll and Hyde Story of Cancer Immune Response" Int J Mol Sci. 2017 Nov; 18(11): 2456; 및 Fu et al. "STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumors resistant to PD-1 blockade" Sci Transl Med. 2015 Apr 15; 7(283): 283ra52]에 기재되어 있다.
펩티드의 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드 치료제, 천연적인 생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드들을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 본 발명에 유용한 펩티드는 또한, 항원-결합 펩티드, 예를 들어, 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디(예를 들어, 문헌[Steeland et al. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113] 참조)를 포함한다. 이러한 항원 결합 펩티드는 시토졸 항원, 핵 항원 또는 소기관-내 항원에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 작은 펩티드, 펩티도미메틱(예를 들어, 펩토이드), 아미노산 및 아미노산 유사체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 치료제는 일반적으로 몰당 약 5,000그램 미만의 분자량, 몰당 약 2,000그램 미만의 분자량, 몰당 약 1,000그램 미만의 분자량, 몰당 약 500그램 미만의 분자량, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 기타 약제학적으로 허용 가능한 형태를 갖는다. 이러한 치료제는 신경전달물질, 호르몬, 약물, 독소, 바이러스 또는 미생물 입자, 합성 분자, 및 그의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 또는 아넬로벡터는 특이적 위치, 조직 또는 세포를 표적화할 수 있는 리간드에 연결된 폴리펩티드를 포함한다.
유전자 편집 구성성분
아넬로벡터의 유전 요소는 유전자 편집 시스템의 구성성분을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 유전자 편집 시스템은 클러스터링된 조절적으로 산재된 짧은 회문 반복부(CRISPR) 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터-기반의 뉴클레아제(TALEN)를 포함한다. ZFN, TALEN 및 CRISPR-기반의 방법은 예를 들어, 문헌[Gaj et al. Trends Biotechnol. 31.7(2013):397-405]에 기재되어 있으며; 유전자 편집의 CRISPR 방법은 예를 들어, 문헌[Guan et al., Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair 2016 Oct;46:1-8. doi: 10.1016/j.dnarep.2016.07.004]; 문헌[Zheng et al., Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques, Vol. 57, No. 3, September 2014, pp. 115-124]에 기재되어 있다.
CRISPR 시스템은 원래 박테리아 및 조류에서 관찰되는 적응 방어 시스템이다. CRISPR 시스템은 CRISPR-회합 또는 "Cas" 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)로 명명되는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 사용하여, 외래 DNA를 절단한다. 전형적인 CRISPR/Cas 시스템에서, 엔도뉴클레아제는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 서열을 표적화하는 서열-특이적 비-코딩 "가이드 RNA"에 의해 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열-편집될 게놈 내의 부위)에 지향된다. CRISPR 시스템의 3가지 부류(I 내지 III)가 확인된 바 있다. 부류 II CRISPR 시스템은 (다수의 Cas 단백질보다는) 단일의 Cas 엔도뉴클레아제를 사용한다. 하나의 부류 II CRISPR 시스템은 II형 Cas 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9, CRISPR RNA("crRNA") 및 트랜스-활성화 crRNA("tracrRNA")를 포함한다. crRNA는 "가이드 RNA", 전형적으로 표적 DNA 서열에 상응하는 약 20-뉴클레오티드 RNA 서열을 함유한다. crRNA는 또한, tracrRNA에 결합하여, RNase III에 의해 절단되는 부분 이중-가닥 구조를 형성하여, crRNA/tracrRNA 혼성물을 초래하는 영역을 함유한다. 이어서, crRNA/tracrRNA 혼성물은 Cas9 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열을 인식하고 절단하게 한다. 표적 DNA 서열은 일반적으로 주어진 Cas 엔도뉴클레아제에 특이적인 "프로토스페이서 인접 모티프"("PAM")에 인접해야 하지만; PAM 서열은 주어진 게놈의 도처에서 나타난다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 CRISPR 엔도뉴클레아제에 대한 유전자를 포함한다. 예를 들어, 다양한 원핵생물 종으로부터 확인되는 일부 CRISPR 엔도뉴클레아제는 독특한 PAM 서열 요건을 가지며; PAM 서열의 예는 5'-NGG(스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)), 5'-NNAGAA(스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CRISPR1), 5'-NGGNG(스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR3) 및 5'-NNNGATT(네이세리아 메닌지디티스(Neisseria meningiditis))를 포함한다. 일부 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제는 G-풍부 PAM 부위, 예를 들어, 5'-NGG와 회합되며, PAM 부위(이로부터 5')로부터 3개 뉴클레오티드 상류의 위치에서 표적 DNA의 블런트-말단 절단을 수행한다. 또 다른 부류 II CRISPR 시스템은 Cas9보다 더 작은 V형 엔도뉴클레아제 Cpf1을 포함하며; 예에는 AsCpf1(아시드아미노코커스(Acidaminococcus) 종 유래) 및 LbCpf1(라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 종 유래)이 포함된다. Cpf1 엔도뉴클레아제는 T-풍부 PAM 부위, 예를 들어, 5'-TTN과 회합된다. 또한, Cpf1은 5'-CTA PAM 모티프를 인식할 수 있다. Cpf1은 4- 또는 5-뉴클레오티드 5' 오버행을 갖는 오프셋 또는 스태거형 이중-가닥 파단부를 도입함으로써, 예를 들어, 코딩 가닥 상의 PAM 부위(그로부터 3')로부터 18개 뉴클레오티드 하류, 및 상보성 가닥 상의 PAM 부위로부터 23개 뉴클레오티드 하류에 위치한 5-뉴클레오티드 오프셋 또는 스태거형 절단으로 표적 DNA를 절단함으로써 표적 DNA를 절단하며; 이러한 오프셋 절단으로부터 초래되는 5-뉴클레오티드 오버행은 상동성 재조합에 의한 DNA 삽입에 의해 블런트-말단 절단된 DNA에서의 삽입에 의한 것보다 더욱 정밀한 게놈 편집을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell, 163:759 - 771]을 참조한다.
다양한 CRISPR 회합(Cas) 유전자가 아넬로벡터 내에 포함될 수 있다. 유전자의 구체적인 예는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cpf1, C2C1 또는 C2C3을 포함하는 부류 II 시스템으로부터의 Cas 단백질을 인코딩하는 것들이다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 Cas 단백질, 예를 들어, 다양한 원핵생물 종 중 임의의 것으로부터일 수 있는 Cas9 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 특정 Cas 단백질, 예를 들어, 특정 프로토스페이서-인접 모티프(PAM) 서열을 인식하도록 선택되는 특정 Cas9 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 세포, 접합체, 배아 또는 동물 내로 도입되어, 예를 들어, 동일한, 유사한 또는 상이한 PAM 모티프를 포함하는 부위의 인식 및 변형을 가능하게 할 수 있는 2가지 이상의 상이한 Cas 단백질 또는 2가지 이상의 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 불활성화된 뉴클레아제를 갖는 변형된 Cas 단백질, 예를 들어, 뉴클레아제-결함 Cas9를 인코딩하는 유전자를 포함한다.
야생형 Cas9 단백질이 gRNA에 의해 표적화된 특정 DNA 서열에서 이중-가닥 파단부(DSB)를 생성하는 한편, 변형된 기능을 갖는 수많은 CRISPR 엔도뉴클레아제가 알려져 있으며, 예를 들어, "닉카제" 버전의 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 오직 단일-가닥 파단만을 생성하며; 촉매적으로 비활성인 Cas 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9("dCas9")는 표적 DNA를 절단하지 않는다. dCas9를 인코딩하는 유전자를 이펙터 도메인을 인코딩하는 유전자와 융합시켜, 표적 유전자의 발현을 억제(CRISPRi)하거나 활성화(CRISPRa)시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자는 전사 침묵화제(예를 들어, KRAB 도메인) 또는 전사 활성화제(예를 들어, dCas9-VP64 융합물)를 갖는 Cas9 융합물을 인코딩할 수 있다. 2개의 gRNA에 상동성인 표적 서열에 DSB를 생성하기 위하여, FokI 뉴클레아제에 융합된 촉매적 비활성 Cas9(dCas9)("dCas9-FokI")를 인코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 예를 들어, 애드진 레포지터리(Addgene repository)(Addgene, 75 Sidney St., Suite 550A, Cambridge, MA 02139; addgene.org/crispr/)에 개시되고, 그로부터 공개적으로 이용 가능한 수많은 CRISPR/Cas9 플라스미드를 참조한다. 각각 개별 가이드 RNA에 의해 유도되는, 2개의 개별 이중-가닥 파단을 도입하는 "이중 닉카제" Cas9는 더욱 정확한 게놈 편집을 달성하는 것으로 문헌[Ran et al. (2013) Cell, 154:1380 - 1389]에 기재되어 있다.
진핵생물의 유전자를 편집하기 위한 CRISPR 기술은 미국 특허 출원 공개 제2016/0138008A1호 및 제US2015/0344912A1호에, 그리고 미국 특허 제8,697,359호, 제8,771,945호, 제8,945,839호, 제8,999,641호, 제8,993,233호, 제8,895,308호, 제8,865,406호, 제8,889,418호, 제8,871,445호, 제8,889,356호, 제8,932,814호, 제8,795,965호 및 제8,906,616호에 개시되어 있다. Cpf1 엔도뉴클레아제 및 상응하는 가이드 RNA 및 PAM 부위는 미국 특허 출원 공개 제2016/0208243 A1호에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 본원에 기재된 폴리펩티드, 예를 들어, 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9, 예를 들어, 야생형 Cas9, 닉카제 Cas9(예를 들어, Cas9 D10A), 데드(dead) Cas9(dCas9), eSpCas9, Cpf1, C2C1 또는 C2C3, 및 gRNA를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 뉴클레아제 및 gRNA(들)를 인코딩하는 유전자의 선택은 표적화된 돌연변이가 뉴클레오티드의 결실인지, 치환인지 또는 부가인지, 예를 들어, 표적화된 서열에 대한 뉴클레오티드의 결실인지, 치환인지 또는 부가인지에 의해 결정된다. (하나 이상의) 이펙터 도메인(예를 들어, VP64)의 전부 또는 그의 일부(예를 들어, 그의 생물학적 활성 부분)와 테더링된 촉매적 비활성 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데드 Cas9(dCas9, 예를 들어, D10A; H840A)를 인코딩하는 유전자는 하나 이상의 표적 핵산 서열의 활성 및/또는 발현을 조절할 수 있는 키메라 단백질을 생성한다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 본원에 기재된 방법에서 유용한 키메라 단백질을 생성하기 위하여 하나 이상의 이펙터 도메인의 전부 또는 부분(예를 들어, 전장 야생형 이펙터 도메인, 또는 그의 단편 또는 변이체, 예를 들어, 그의 생물학적 활성 부분)와 dCas9의 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 dCas9-메틸라제 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 다른 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 내인성 유전자를 표적화하기 위하여 부위-특이적 gRNA와 함께 dCas9-효소 융합물을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 양태에서, 아넬로벡터는 dCas9와 융합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 이펙터 도메인(모든 또는 생물학적 활성 부분)을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
조절 서열
일부 실시형태에서, 유전 요소는 이펙터를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 유전 요소가 mRNA인 경우, 프로모터는 유전 요소에 부재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소 작제물은 RNA 유전 요소의 생성을 구동하기 위해 사용되는 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 발현 생성물을 인코딩하는 DNA 서열에 인접하여 위치한 DNA 서열을 포함한다. 프로모터는 인접 DNA 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않는 경우 발현되는 생성물의 양에 비하여 DNA 서열로부터 발현되는 생성물의 양을 증가시킨다. 하나의 유기체로부터의 프로모터를 사용하여 또 다른 유기체로부터 기원한 DNA 서열로부터의 생성물 발현을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 척추동물 프로모터는 척추동물에서 해파리 GFP의 발현을 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 하나의 프로모터 요소는 하나 이상의 생성물의 발현을 향상시킬 수 있다. 다수의 프로모터 요소는 당업자에게 널리 알려져 있다.
일 실시형태에서, 높은 수준의 구성적 발현이 요망된다. 이러한 프로모터의 예는 제한 없이, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터/인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 조기 프로모터/인핸서(예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참고), SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질.베타.-액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 유도성 프로모터가 요망될 수 있다. 유도성 프로모터는 제한 없이, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088호); 테트라사이클린-억제성 시스템(문헌[Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]); 테트라사이클린-유도성 시스템(문헌[Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)]; 또한, 문헌[Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조); RU486-유도성 시스템(문헌[Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및 문헌[Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]); 및 라파마이신-유도성 시스템(문헌[Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]; 문헌[Rivera et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)])을 포함하여, 예를 들어, 시스로 또는 트랜스로 제공되는, 외인적으로 공급되는 화합물에 의해 조절되는 것들이다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성 단계에 의해 또는 오직 복제하는 세포에서만 조절되는 것들이다.
일부 실시형태에서, 관심 유전자 또는 핵산 서열에 대한 고유 프로모터가 사용된다. 유전자 또는 핵산 서열의 발현이 고유 발현을 모방하는 것이 요망되는 경우에 고유 프로모터가 사용될 수 있다. 유전자 또는 다른 핵산 서열의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에, 고유 프로모터가 사용될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 다른 고유 발현 제어 요소, 예컨대, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작(Kozak) 공통 서열도 또한 고유 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자를 포함한다. 예를 들어, 골격근에서의 발현이 요망되는 경우, 근육에서 활성인 프로모터가 사용될 수 있다. 이들은 골격 α-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 인코딩하는 유전자로부터의 프로모터 및 자연-발생 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터를 포함한다. 문헌[Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)]을 참조한다. 특히 간 알부민, 문헌[Miyatake et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997)]; B형 간염 바이러스 코어 프로모터, 문헌[Sandig et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996)]; 알파-태아단백질(AFP), 문헌[Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)], 골(오스테오칼신(osteocalcin), 문헌[Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)]; 골 시알로단백질(sialoprotein), 문헌[Chen et al., J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996)]), 림프구(CD2, 문헌[Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)]; 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 a 쇄), 뉴런(뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 문헌[Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)]; 신경필라멘트 경쇄 유전자, 문헌[Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)]; 뉴런-특이적 vgf 유전자, 문헌[Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]을 위한 조직-특이적인 프로모터의 예가 알려져 있다.
유전 요소 작제물은 인핸서, 예를 들어, 유전자를 인코딩하는 DNA 서열에 인접하여 위치한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하거나, 코딩 DNA 서열(예를 들어, 생성물 또는 생성물들로 전사 또는 번역되는 DNA 서열)의 하류에 또는 그 내에 위치할 수 있다. 그러므로, 인핸서 요소는 생성물을 인코딩하는 DNA 서열의 100개 염기쌍, 200개 염기쌍 또는 300개 이상의 염기쌍 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 DNA 서열로부터 발현되는 재조합 생성물의 양을 프로모터 요소에 의해 제공되는 증가된 발현을 초과하여 증가시킬 수 있다. 다중의 인핸서 요소는 당업자에게 용이하게 이용 가능하다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에 기재된 발현 생성물을 인코딩하는 서열을 측접하는 하나 이상의 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에 기재된 발현 생성물을 인코딩하는 서열을 측접하는 하나 이상의 긴 말단 반복부(LTR)를 포함한다. 사용될 수 있는 프로모터 서열의 예는 시미안 바이러스 40(SV40) 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스테인-바 바이러스 즉시 조기 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
기타 서열
일부 실시형태에서, 유전 요소는 생성물(예를 들어, 리보자임, 단백질을 인코딩하는 치료적 mRNA, 외인성 유전자)을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 숙주 또는 숙주 세포에서의 아넬로벡터의 종 및/또는 조직 및/또는 세포 향성(예를 들어, 캡시드 단백질 서열), 감염성(예를 들어, 캡시드 단백질 서열), 면역억제/활성화(예를 들어, 조절 핵산), 바이러스 게놈 결합 및/또는 패키징, 면역 회피(비-면역원성 및/또는 관용), 약동학, 엔도시토시스 및/또는 세포 부착, 핵 유입, 세포내 조절 및 국소화, 엑소시토시스 조절, 증식 및 핵산 보호에 영향을 미치는 하나 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 DNA, RNA 또는 인공 핵산을 포함하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 다른 서열은 게놈 DNA, cDNA, 또는 tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 다른 RNAi 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 유전 요소는 조절 핵산과 동일한 유전자 발현 생성물의 상이한 유전자좌를 표적화하기 위하여 siRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 유전 요소는 조절 핵산과 상이한 유전자 발현 생성물을 표적화하기 위하여 siRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 다음의 서열 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열, 외인성 유전자를 인코딩하는 서열, 치료제를 인코딩하는 서열, 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 서열(siRNA, lncRNA, shRNA)을 인코딩하는 서열, 및 치료적 mRNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열.
다른 서열은 약 2 내지 약 5000개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 250개의 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 350개의 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 약 1000 내지 약 2000개의 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개의 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개의 뉴클레오티드, 약 4000 내지 약 5000개의 뉴클레오티드 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다.
인코딩된 유전자
예를 들어, 유전 요소는 신호전달 생화학 경로와 연관된 유전자, 예를 들어, 신호전달 생화학 경로-연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예에는 질병 연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. "질병-연관" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 비 질병 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여, 질병-이환된 조직으로부터 유래된 세포에서 전사 또는 번역 생성물을 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태로 제공하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며; 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며, 여기서, 변경된 발현은 질병의 발생 및/또는 진행과 상호연관된다. 질병-연관 유전자는 또한, 질병의 병인의 직접적인 원인이 되거나, 질병의 병인을 담당하는 유전자(들)와 연관 불균형인 돌연변이(들) 또는 유전적 변이를 지니는 유전자를 지칭한다.
질병-연관 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 맥쿠식-나탄스(McKusick-Nathans) 유전 의학 기관, 존스 홉킨스 대학(미국 메릴랜드주 볼티모어) 및 국립 생명과학 정보 센터, 국립 의학 도서관(미국 메릴랜드주 베데스다)로부터 이용 가능하다. 질병-연관 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 본원에 그들 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제8,697,359호의 표 A 및 B에 열거되어 있다. 질병 특이적 정보는 맥쿠식-나탄스 유전 의학 기관, 존스 홉킨스 대학(미국 메릴랜드주 볼티모어) 및 국립 생명과학 정보 센터, 국립 의학 도서관(미국 메릴랜드주 베데스다)로부터 이용 가능하다. 신호전달 생화학 경로-연관 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 본원에 그들 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제8,697,359호의 표 A 내지 C에 열거되어 있다.
또한, 유전 요소는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 표적화 모이어티를 인코딩할 수 있다. 이는 예를 들어, 당, 당지질 또는 단백질, 예컨대 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 표적화 모이어티의 추가의 생성 방법을 안다.
바이러스 서열
일부 실시형태에서, 유전 요소는 적어도 하나의 바이러스 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열은 단일 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아넬로바이러스, 비드나바이러스, 써코바이러스, 제미니바이러스, 게노모바이러스, 이노바이러스, 마이크로바이러스, 나노바이러스, 파보바이러스 및 스피라바이러스로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 서열은 이중 가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 암풀라바이러스, 아스코바이러스, 아스파바이러스, 배큘로바이러스, 푸셀로바이러스, 글로불로바이러스, 구타바이러스, 하이트로사바이러스, 헤르페스바이러스, 이리도바이러스, 리포트릭스바이러스, 니마바이러스 및 폭스바이러스로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 서열은 RNA 바이러스, 예를 들어, 알파바이러스, 푸로바이러스, 간염 바이러스, 호르데이바이러스, 토바모바이러스, 토브라바이러스, 트리코르나바이러스, 루비바이러스, 비르나바이러스, 시스토바이러스, 파르티티바이러스 및 레오바이러스로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 비-병원성 바이러스, 예를 들어, 상리공생 바이러스, 예를 들어, 편리공생 바이러스, 예를 들어, 고유 바이러스, 예를 들어, 아넬로바이러스로부터의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 명명법의 최근의 변화는 인간 세포를 감염시킬 수 있는 3가지 아넬로바이러스를 알파토르크바이러스(TT), 베타토르크바이러스(TTM) 및 감마토르크바이러스(TTMD) 속의 아넬로바이러스과의 바이러스로 분류하였다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 토르크 테노 바이러스(TT), 환형 음성-센스 게놈을 갖는 비-외피, 단일-가닥 DNA 바이러스에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 SEN 바이러스, 센티넬(Sentinel) 바이러스, TTV-유사 미니 바이러스 및 TT 바이러스에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. TT 바이러스 유전형 6, TT 바이러스 군, TTV-유사 바이러스 DXL1 및 TTV-유사 바이러스 DXL2를 포함하는 상이한 유형의 TT 바이러스가 기재된 바 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 더 작은 바이러스, 토르크 테노-유사 미니 바이러스(TTM) 또는 토르크 테노-유사 미디 바이러스(TTMD)로 지칭되는 TTV와 TTMV 사이의 게놈 크기를 갖는 제3 바이러스에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에, 예를 들어, 표 19에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 비-병원성 바이러스로부터의 하나 이상의 서열 또는 서열의 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 본원에, 예를 들어, 표 41에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 실질적으로 비-병원성인 바이러스로부터의 하나 이상의 서열 또는 서열의 단편을 포함할 수 있다.
표 41. 아넬로바이러스 및 그들의 서열의 예. 수탁 번호 및 관련 서열 정보는 2018년 12월 11일자에 언급된 바와 같이 www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/에서 수득될 수 있다.
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
일부 실시형태에서, 유전 요소는 하나 이상의 비-아넬로바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스, 백시니아 바이러스, SV40, 파필로마 바이러스, RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티 바이러스, 단일-가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 간염 바이러스, 또는 이중-가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 로타바이러스로부터의 하나 이상의 서열에 대하여 상동성 또는 동일성을 갖는 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레트로바이러스가 결함이 있기 때문에, 감염성 입자를 생성하도록 지원이 제공될 수 있다. 이러한 지원은 예를 들어, LTR 내의 조절 서열의 제어 하에 레트로바이러스의 구조적 유전자의 전부를 인코딩하는 플라스미드를 함유하는 헬퍼 세포주를 사용함으로써 제공될 수 있다. 본원에 기재된 아넬로벡터를 복제하는 데 적합한 세포주는 해당 분야에 알려진 세포주, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있는 A549 세포를 포함한다. 상기 유전 요소는 선택 가능한 마커를 인코딩하는 유전자를 추가로 함유하여, 요망되는 유전 요소가 확인되게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전 요소는 서열이 제1 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하게 유지되거나, 또는 다르게 본 발명을 실시하는 데 유용하다면, 인코딩된 폴리펩티드에 아미노산 차이를 초래하는 비-침묵 돌연변이, 예를 들어, 염기 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 이와 관련하여, 일반적으로 전체 단백질 기능을 불활성화시키지 않는 것으로 인식되는 특정 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다: 예컨대 양으로 하전된 아미노산(및 그의 역)에 관하여, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 음으로 하전된 아미노산(및 그의 역)에 관하여, 아스파르트산 및 글루탐산; 및 특정 군의 중성으로 하전된 아미노산(및 모든 경우에, 또한 그의 역)에 관하여, (1) 알라닌 및 세린, (2) 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘, (3) 시스테인 및 세린, (4) 글리신 및 프롤린, (5) 이소류신, 류신 및 발린, (6) 메티오닌, 류신 및 이소류신, (7) 페닐알라닌, 메티오닌, 류신 및 티로신, (8) 세린 및 트레오닌, (9) 트립토판 및 티로신, (10) 및 예를 들어, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌. 아미노산은 물리적 특성 및 이차 및 삼차 단백질 구조에 대한 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로의 치환으로서 해당 분야에 인식된다.
동일한 또는 특정 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성(예를 들어, 비교 윈도우 또는 표기된 영역에 걸쳐 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬되는 경우, 특정 영역에 걸쳐 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성)은 하기 기재된 디폴트 파라미터와 함께 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 수동의 정렬 및 육안의 검사(예를 들어, NCBI 웹 사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 등 참조)에 의해 측정될 수 있다. 동일성은 또한 시험 서열의 상보물을 지칭할 수 있거나 이에 적용될 수 있다. 동일성은 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열 및 치환을 갖는 서열을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 알고리즘은 갭 등을 설명한다. 동일성은 적어도 약 10개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 15개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 20개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 25개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 30개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 35개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 40개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 45개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이, 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이 이상인 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 유전 암호가 축퇴성이기 때문에, 상동성 뉴클레오티드 서열은 임의의 수의 침묵 염기 변경, 즉, 그럼에도 불구하고 동일한 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
단백질성 외부
일부 실시형태에서, 아넬로벡터, 예를 들어, 합성 아넬로벡터는 유전 요소를 봉입하는 단백질성 외부를 포함한다. 단백질성 외부는 포유동물에서 원치 않는 면역 반응을 유도하지 못하는 실질적으로 비-병원성인 외부 단백질을 포함할 수 있다. 아넬로벡터의 단백질성 외부는 전형적으로 단백질성 외부를 구성하는 정20면체 형성으로 자가-어셈블될 수 있는 실질적으로 비-병원성인 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질성 외부 단백질은 아넬로벡터의 유전 요소의 서열에 의해 인코딩된다(예를 들어, 유전 요소와 시스로 존재한다). 다른 실시형태에서, 단백질성 외부 단백질은 아넬로벡터의 유전 요소로부터 분리된 핵산에 의해 인코딩된다(예를 들어, 유전 요소와 트랜스로 존재한다).
일부 실시형태에서, 단백질, 예를 들어, 실질적으로 비-병원성인 단백질 및/또는 단백질성 외부 단백질은 하나 이상의 글리코실화된 아미노산, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질, 예를 들어, 실질적으로 비-병원성인 단백질 및/또는 단백질성 외부 단백질은 적어도 하나의 친수성 DNA-결합 영역, 아르기닌-풍부 영역, 트레오닌-풍부 영역, 글루타민-풍부 영역, N-말단 폴리아르기닌 서열, 가변 영역, C-말단 폴리글루타민/글루탐산염 서열 및 하나 이상의 이황화 가교를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질은 캡시드 단백질이며, 예를 들어, 본원에 기재된 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 분자 및/또는 캡시드 단백질 서열 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단백질 또는 캡시드 단백질의 기능적 단편은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 캡시드 단백질 또는 캡시드 단백질의 기능적 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 분자에 대하여 적어도 약 60%, 70% 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 더 낮은 서열 동일성을 갖는 아미노산의 범위는 본원에 기재된 특성 중 하나 이상 및 세포/조직/종 특이성(예를 들어, 향성)의 차이를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 단백질성 외부 내에 지질이 결여된다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터에는 지질 이중층, 예를 들어, 바이러스 외피가 결여된다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터의 내부는 단백질성 외부에 의해 완전히 덮인다(예를 들어, 100% 커버리지). 일부 실시형태에서, 아넬로벡터의 내부는 단백질성 외부에 의해 100% 미만, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 이하의 커버리지로 덮인다. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 유전 요소가 아넬로벡터에 보유되는 한, 예를 들어, 물, 이온, 펩티드 또는 소분자에 대한 투과 가능성을 허용하는 갭 또는 불연속부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 숙주 세포 내로의 유전 요소의 유입을 매개하기 위하여 숙주 세포를 특이적으로 인식하고/하거나 이에 결합하는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 상보성 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어, ORF1 분자의, 아르기닌-풍부 영역, 젤리-롤 영역, N22 도메인, 초가변 영역, 및/또는 C-말단 도메인. 일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상의 글리코실화된 단백질, 친수성 DNA-결합 영역, 아르기닌-풍부 영역, 트레오닌-풍부 영역, 글루타민-풍부 영역, N-말단 폴리아르기닌 서열, 가변 영역, C-말단 폴리글루타민/글루탐산염 서열 및 하나 이상의 이황화 가교. 예를 들어, 단백질성 외부는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로바이러스 ORF1 핵산에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질성 외부는 다음의 특징 중 하나 이상을 포함한다: 정20면체 대칭, 하나 이상의 숙주 세포 분자와 상호작용하는 분자를 인식하고/하거나 이에 결합하여, 숙주 세포로의 유입을 매개함, 지질 분자가 결여됨, 탄수화물이 결여됨, pH 및 온도 안정성임, 세제 저항성임 및 숙주에서 실질적으로 비-면역원성이거나 실질적으로 비-병원성임.
III. 이용 방법
본원에 기재된 아넬로벡터 및 아넬로벡터를 포함하는 조성물은 예를 들어, 질병, 장애 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 포유동물 대상체, 예를 들어, 인간 대상체)에서의 질병, 장애 또는 질환의 치료 방법에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 약제학적 조성물의 투여는 예를 들어, 비경구(정맥내, 종양내, 복강내, 근육내, 강내 및 피하 포함) 투여로 이루어질 수 있다. 아넬로벡터는 단독으로 또는 약제학적 조성물로서 제형화되어 투여될 수 있다.
아넬로벡터는 단위-용량 조성물, 예컨대 단위 용량 비경구 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 혼합에 의해 제조되며, 비경구 투여를 위하여 적합하게 조정될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 주사 및 주입 용액 또는 현탁액 또는 좌제 또는 에어로졸의 형태로 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터 또는 이를 포함하는 조성물의 투여는 아넬로벡터에 의해 포함되는 유전 요소가 예를 들어, 대상체 내의 표적 세포로 운반되게 할 수 있다.
예를 들어, 이펙터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 이펙터)를 포함하는 본원에 기재된 아넬로벡터 또는 그의 조성물을 사용하여 이펙터를 세포, 조직 또는 대상체에 운반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터 또는 그의 조성물을 사용하여, 이펙터를 골수, 혈액, 심장, GI 또는 피부에 운반한다. 본원에 기재된 아넬로벡터 조성물의 투여에 의한 이펙터의 운반은 세포, 조직 또는 대상체에서 비코딩 RNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 조절할 수 있다(예를 들어, 증가 또는 감소시킬 수 있다). 이러한 방식으로의 발현 수준의 조절은 이펙터가 운반되는 세포에서 기능적 활성의 변경을 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절된 기능적 활성은 성질이 효소적, 구조적 또는 조절적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터 또는 그의 카피는 세포로의 운반 후 24시간(예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 30일 또는 1개월)에 세포에서 검출 가능하다. 실시형태들에서, 아넬로벡터 또는 그의 조성물은 표적 세포 상에서 효과를 매개하며, 효과는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 2, 3 또는 4주 또는 1, 2, 3, 6 또는 12개월 동안 지속된다. (예를 들어, 아넬로벡터 또는 그의 조성물이 외인성 단백질을 인코딩하는 유전 요소를 포함하는) 일부 실시형태에서, 효과는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일, 2, 3 또는 4주 또는 1, 2, 3, 6 또는 12개월 미만 동안 지속된다.
본원에 기재된 아넬로벡터 또는 아넬로벡터를 포함하는 조성물로 치료될 수 있는 질병, 장애 및 질환의 예는 제한 없이, 면역 장애, 인터페론병증(예를 들어, I형 인터페론병증), 감염성 질병, 염증성 장애, 자가면역 질환, 암(예를 들어, 고형 종양, 예를 들어, 폐암, 비-소세포 폐암, 예를 들어, mIR-625, 예를 들어, 카스파제-3에 반응성인 유전자를 발현하는 종양) 및 위장 장애를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로벡터가 접촉되는 세포 내에서 활성 또는 기능을 조절한다(예를 들어, 증가 또는 감소시킨다). 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로벡터가 접촉되는 세포에서 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)의 수준 또는 활성을 조절한다(예를 들어, 증가 또는 감소시킨다). 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로벡터가 접촉되는 세포, 예를 들어, 암 세포의 생존력을 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 아넬로벡터가 접촉되는 세포, 예를 들어, 암 세포의 생존력을 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 감소시키는 이펙터, 예를 들어, miRNA, 예를 들어, miR-625를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 예를 들어, 카스파제-3 활성을 증가시킴으로써 아넬로벡터가 접촉되는 세포, 예를 들어, 암 세포의 아폽토시스를 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 예를 들어, 카스파제-3 활성을 증가시킴으로써, 아넬로벡터가 접촉되는 세포, 예를 들어, 암 세포의 아폽토시스를 예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 증가시키는 이펙터, 예를 들어, miRNA, 예를 들어, miR-625를 포함한다.
IV. 투여/운반
조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터를 포함하는 약제학적 조성물)은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하도록 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균 및/또는 발열원-부재일 수 있다. 약제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
본원에 제공되는 약제학적 조성물의 설명이 주로 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 다른 동물로의, 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유동물로의 투여에 적합하다는 것을 당업자라면 이해할 것이다. 조성물이 다양한 동물로의 투여에 적합하게 만들기 위해 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물을 변형하는 것이 충분히 이해되며, 숙련된 수의학 약리학자는 존재한다면, 단지 일상적인 실험을 사용하여 이러한 변형을 설계하고/하거나 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 기타 영장류; 포유동물, 예컨대 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 랫트; 및/또는 조류, 예컨대 상업적으로 관련된 조류, 예컨대 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나, 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분이 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합되게 한 다음, 필요하면 그리고/또는 바람직하면, 생성물을 나누고/나누거나, 성형하고/하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체로 아넬로벡터를 운반하는 방법을 특징으로 한다. 당해 방법은 본원에 기재된 바와 같은 아넬로벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여된 아넬로벡터는 대상체에서 복제한다(예를 들어, 대상체의 바이러스체의 일부가 된다).
약제학적 조성물은 야생형 또는 고유 바이러스 요소 및/또는 변형된 바이러스 요소를 포함할 수 있다. 아넬로벡터는 하나 이상의 아넬로바이러스 서열(예를 들어, 핵산 서열 또는 그의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 이에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 아넬로벡터는 하나 이상의 아넬로바이러스 서열(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 핵산 서열)에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 아넬로벡터는 아넬로바이러스 아미노산 서열(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 분자의 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 아넬로벡터는 아넬로바이러스 아미노산 서열(예를 들어, 아넬로바이러스 ORF1 분자의 아미노산 서열)에 대하여 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 내인성 유전자 및 단백질 발현을 기준, 예를 들어, 건강한 대조군에 비하여 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 증가(자극)시키기에 충분하다. 특정 실시형태에서, 아넬로벡터는 내인성 유전자 및 단백질 발현을 기준, 예를 들어, 건강한 대조군에 비하여 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 감소(저해)시키기에 충분하다.
일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 숙주 또는 숙주 세포에서 하나 이상의 바이러스 특성, 예를 들어, 향성, 감염성, 면역억제/활성화를 기준, 예를 들어, 건강한 대조군에 비하여 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 저해/향상시킨다.
일부 실시형태에서, 바이러스 유전 정보에서 표현되지 않는 하나 이상의 바이러스 주를 추가로 포함하는 약제학적 조성물이 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아넬로벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 바이러스 감염을 조절하기에 충분한 용량 및 시간으로 투여된다. 바이러스 감염의 일부 비제한적인 예는 아데노-연관 바이러스, 아이치(Aichi) 바이러스, 호주 박쥐 리사 바이러스(lyssavirus), BK 폴리오마바이러스(polyomavirus), 반나 바이러스(Banna virus), 바르마 포레스트(Barmah forest) 바이러스, 부니아무에라(Bunyamwera) 바이러스, 부니아바이러스 라 크로세(Bunyavirus La Crosse), 부니아바이러스 스노우슈 하레(Bunyavirus snowshoe hare), 세르코피테신 헤르페스바이러스(Cercopithecine herpesvirus), 찬디푸라 바이러스(Chandipura virus), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 코사바이러스(Cosavirus) A, 우두 바이러스, 콕사키바이러스(Coxsackievirus), 크리민-콩고 출혈성 열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 뎅기(Dengue) 바이러스, 도리(Dhori) 바이러스, 더그비(Dugbe) 바이러스, 두벤하게(Duvenhage) 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 에볼라바이러스, 에코바이러스(Echovirus), 뇌심근염(Encephalomyocarditis) 바이러스, 엡스테인-바 바이러스, 유럽 박쥐 리사바이러스, GB 바이러스 C/G형 간염 바이러스, 한탄(Hantaan) 바이러스, 헨드라(Hendra) 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 간염 델타 바이러스, 마두 바이러스, 인간 아데노바이러스, 인간 아스트로바이러스, 인간 코로나바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 엔테로바이러스 68, 인간 엔테로바이러스 70, 인간 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 2, 인간 헤르페스바이러스 6, 인간 헤르페스바이러스 7, 인간 헤르페스바이러스 8, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 파필로마바이러스 1, 인간 파필로마바이러스 2, 인간 파필로마바이러스 16, 인간 파필로마바이러스 18, 인간 파라인플루엔자, 인간 파보바이러스 B19, 인간 호흡기 융합 바이러스, 인간 리노바이러스, 인간 SARS 코로나바이러스, 인간 스푸마레트로바이러스(spumaretrovirus), 인간 T-림포트로픽 바이러스, 인간 토로바이러스(torovirus), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 이스파한(Isfahan) 바이러스, JC 폴리오마바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 주닌 아레나바이러스(Junin arenavirus), KI 폴리오마바이러스, 쿤진(Kunjin) 바이러스, 라고스(Lagos) 박쥐 바이러스, 레이크 빅토리아 마르부르그바이러스(Lake Victoria marburgvirus), 란가트(Langat) 바이러스, 라사(Lassa) 바이러스, 로즈데일(Lordsdale) 바이러스, 라우핑 일(Louping ill) 바이러스, 림프구 맥락수막염 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 마이아로(Mayaro) 바이러스, MERS 코로나바이러스, 홍역 바이러스, 멘고(Mengo) 뇌심근염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마바이러스(Merkel cell polyomavirus), 모콜라(Mokola) 바이러스, 전염성 연속종 바이러스, 원두 바이러스, 볼거리 바이러스, 무레이 밸리(Murray valley) 뇌염 바이러스, 뉴욕 바이러스, 니파(Nipah) 바이러스, 노르워크(Norwalk) 바이러스, 오뇽-뇽(O'nyong-nyong) 바이러스, 올프(Orf) 바이러스, 오로퓨스(Oropouche) 바이러스, 피친데(Pichinde) 바이러스, 폴리오바이러스, 푼타 토로 플레보바이러스(Punta toro phlebovirus), 푸말라(Puumala) 바이러스, 광견병 바이러스, 리프트계곡열 바이러스, 로사바이러스(Rosavirus) A, 로스 강(Ross river) 바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스 B, 로타바이러스 C, 풍진 바이러스, 사기야마(Sagiyama) 바이러스, 살리바이러스(Salivirus) A, 모래파리 열 시실리안(Sandfly fever sicilian) 바이러스, 삿포로(Sapporo) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스, 서울(Seoul) 바이러스, 유인원 포미(Simian foamy) 바이러스, 유인원 바이러스 5, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 사우샘프턴(Southampton) 바이러스, 세인트 루이스 뇌염(St. louis encephalitis) 바이러스, 틱-본 포와산(Tick-borne powassan) 바이러스, 토르크 테노 바이러스, 토스카나(Toscana) 바이러스, 우우쿠니에미(Uukuniemi) 바이러스, 백시니아 바이러스, 바리셀라-조스터(Varicella-zoster) 바이러스, 바리올라(Variola) 바이러스, 베네주엘란(Venezuelan) 말 뇌염 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, WU 폴리오마바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 야바(Yaba) 원숭이 종양 바이러스, 야바-유사 질병 바이러스, 황열 바이러스 및 지카 바이러스를 포함한다. 특정 실시형태에서, 아넬로벡터는 대상체에 이미 존재하는 바이러스를 예를 들어, 기준에 비하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상 능가하고/하거나 대체하기에 충분하다. 특정 실시형태에서, 아넬로벡터는 만성 또는 급성 바이러스 감염과 경쟁하기에 충분하다. 특정 실시형태에서, 아넬로벡터는 바이러스 감염으로부터 보호하기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 바이러스전(provirotic)). 일부 실시형태에서, 아넬로벡터는 (예를 들어, 표현형, 바이러스 수준, 유전자 발현, 다른 바이러스와의 경쟁, 병태 등을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상) 조절하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 치료, 치료하는 및 그의 동원어(cognate)는, 예를 들어, 질병, 병리학적 상태 또는 장애를 개선시키거나, 호전시키거나, 안정화시키거나, 예방하거나, 치유하려는 의도로 (예를 들어, 아넬로벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 아넬로벡터를 투여함으로써) 대상체의 의학적 관리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 적극 치료(질병, 병리학적 상태 또는 장애를 개선시키기 위한 치료), 원인 치료(연관된 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 원인에 대한 치료), 완화 치료(증상의 경감을 위해 설계된 치료), 예방적 치료(연관된 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 예방하거나, 최소화시키거나, 부분적으로 또는 완전히 억제하기 위한 치료) 및/또는 지지 치료(다른 요법을 보완하기 위해 사용된 치료)를 포함한다.
본원에 언급된 모든 참고문헌 및 간행물은 본원에 참조로 포함된다. 다음의 실시예는 본 발명의 일부 실시형태를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 제한하고자 하지 않으며; 당업자에게 알려져 있는 다른 절차, 방법 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 그들의 예시적인 성질에 의해 이해될 것이다.
실시예
목차
실시예 1: 배큘로바이러스를 사용하여 생성된 ORF1을 사용한 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
실시예 2: mRNA를 캡시드화하는 고리2 ORF1-기반 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
실시예 3: 변형된 ORF1 단백질을 사용한 mRNA-캡시드화 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
실시예 4: 변형된 mRNA를 사용한 mRNA-캡시드화 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
실시예 5: 아넬로바이러스 ORF1 캡시드 단백질의 구조 분석
실시예 1: 배큘로바이러스를 사용하여 생성된 ORF1을 사용한 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
이 실시예에서, 아넬로바이러스 단백질(예를 들어, ORF1)의 발현에 적합한 배큘로바이러스 작제물을 시험관 내 어셈블리에 의해 생성하였다.
제1 실시예에서, N-말단 HIS6-태그(HIS-ORF1)에 융합된 고리2 ORF1을 인코딩하는 DNA를 곤충 발현을 위해 코돈 최적화하였고, 제조업체 지침(ThermoFisher Scientific)에 따라 배큘로바이러스 발현 벡터 pFASTbac 시스템 내로 클로닝하였다. 10 리터의 곤충 세포 배양액(Sf9)을 고리2 HIS-ORF1 배큘로바이러스로 감염시키고, 감염 3-일 후 원심분리에 의해 세포를 수확하였다. 세포를 용해시키고, 용해물을 킬레이팅 수지 컬럼을 사용한, 현장에서 표준 방법을 사용하여 정제하였다. HIS-ORF1을 함유하는 용출 분획을 투석하고, DNAse로 처리하여, 숙주 세포 DNA를 소화시켰다. 생성된 물질을 킬레이팅 수지 컬럼을 사용하여 다시 정제하고, ORF1을 함유하는 분획을 핵산 캡시드화 및 바이러스 벡터 정제를 위해 보유하였다. ORF1-함유 분획도 음성 염색 전자 현미경에 의해 분석하였다.
제2 실시예에서, N-말단 HIS6-태그(HIS-ORF1)에 융합된 고리10 ORF1을 인코딩하는 DNA를 곤충 발현을 위해 코돈 최적화하였고, 제조업체 지침(ThermoFisher Scientific)에 따라 배큘로바이러스 발현 벡터 pFASTbac 시스템 내로 클로닝하였다. 곤충 세포(Sf9)를 고리 HIS-ORF1 배큘로바이러스로 감염시키고, 감염 3-일 후 원심분리에 의해 세포를 수확하였다. 세포를 용해시키고, 단백질을 킬레이팅 수지 친화도 컬럼(HisTrap, GE Healthcare)을 사용한, 현장에서 표준 방법을 사용하여 정제하였다. 생성된 물질을 다시 헤파린 친화도 컬럼(Heparin HiTrap, GE Healthcare)을 사용하여 정제하고, ORF1을 함유하는 분획을 음성 염색 전자 현미경에 의해 분석하였다.
제3 실시예에서, N-말단 HIS6-플래그-태그(HIS-Flag-Vp1) 및 헬퍼 단백질(Vp2)에 융합된 닭 빈혈 바이러스(CAV) 캡시드 단백질(Vp1)을 인코딩하는 DNA를 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화하였고, CMV 프로모터를 사용하는 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 포유동물 세포(293expi)를 CAV Vp1 및 Vp2 발현 벡터로 형질주입시켰다. 감염 3-일 후 원심분리에 의해 세포를 수확하였다. 세포를 용해시키고, 킬레이트화 및 헤파린 정제 프로세스를 사용하여 용해물을 정제하였다. 닭 빈혈 바이러스(CAV) Vp1을 함유하는 용출 분획을 음성 염색 전자현미경에 의해 분석하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 고리 2 ORF1 및 고리 10 ORF1 둘 모두는 약 35 nm 바이러스-유사 입자를 형성하는 경향을 보였다.
핵산 캡시드화 및 바이러스 벡터 정제: 고리 ORF1(야생형 단백질, 키메라 단백질 또는 그의 단편)은 VLP 또는 바이러스 캡시드를 분리하여 핵산 카고와 재어셈블리할 수 있도록 하기에 충분한 조건으로 처리될 것이다. 핵산 카고는 예를 들어, 치료제로서 운반하고자 하는 관심 유전자를 인코딩하는 RNA로 정의될 수 있다. 정의된 농도의 핵산 카고는 정의된 농도의 고리 ORF1과 조합되고, 핵산 캡시드화를 허용하기에 충분한 조건으로 처리될 것이며, 바이러스 벡터로서 정의된 생성된 입자는 후속적으로 표준 바이러스 정제 절차를 사용하여 정제될 것이다.
실시예 2: mRNA를 캡시드화하는 고리2 ORF1-기반 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
고리2 ORF1은 바이러스 입자 또는 VLP를 분산된 단백질 또는 캡소머로 분리하기 위해, 500 mM NaCl을 갖는 Tris pH 8.0, 0.1% SDS와 함께 500 mM NaCl을 갖는 Tris pH 8.0, 150 mM NaCl을 갖는 CAPS 완충액 pH 10.5, 500 mM NaCl을 갖는 CAPS 완충액 pH 10.5 또는 0.1% SDS와 함께 500 mM NaCl을 갖는 CAPS 완충액 pH 10.5를 포함하는 이동상을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제된다.
제1 실시예에서, ORF1은 mRNA, 형광 표지된 mRNA 또는 벡터 형성을 유도하기에 적격인 것으로 실시예 1에 나타낸 ssDNA의 세그먼트에 화학적으로 컨쥬게이션된 mRNA 트랜스진과 혼합된다. 바이러스 벡터는 (예를 들어, 유지된 형광 흡수에 의해 측정된 바와 같은) 아넬로벡터 캡시드화 RNA를 단리하기 위해 Tris pH 8.0 완충액을 사용하여 투석 및 SEC 정제를 통해 형성된다. 아넬로벡터 어셈블리는 DLS 또는 전자 현미경과 같은 생물물리학적 평가에 의해 추가로 평가된다.
제2 실시예에서, 정제된 ORF1은 0.1% SDS와 함께 1 M NaCl로 처리되어 올리고머 또는 VLP를 분산된 단백질 또는 캡소머로 분리한다. 그런 다음, ORF1은 관심 유전자(예를 들어, 리포터 유전자, 예를 들어, GFP, mCherry; 또는 관심 이펙터, 예를 들어, EPO)를 번역하는 mRNA와 같은 mRNA와 혼합되고, VLP 형성을 허용하기 위해 150 mM NaCl를 갖는 Tris pH 8.0에 대해 투석된다. 후속 복합체는 AV 벡터 캡시드화 mRNA를 단리하기 위해 Tris pH 8.0 완충액을 사용하는 SEC에 의해 정제된다. 아넬로벡터 벡터 어셈블리는 예를 들어, 세포를 형질도입하고 리포터 유전자(예를 들어, mCherry 또는 GFP)의 발현을 관찰함으로써 또는 관심 이펙터의 발현을 통해(예를 들어, EPO와 같은 유전자의 발현을 검출하기 위해 ELISA를 사용하여) 시험관 내 또는 생체 내 판독에 의해 추가로 평가될 수 있다.
GFP mRNA를 캡시드화하는 고리2 ORF1-기반 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
추가 실시예에서, 고리2 ORF1 단백질을 곤충 세포에서 전장 단백질로서 발현시키고, 어셈블된 VLP를 헤파린 친화도 컬럼에 이어서, Tris 완충액 이동상을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제하였다. 단리된 고리2 ORF1 단백질로부터 형성된 VLP를 음성 염색 전자 현미경(EM)으로 관찰하였고, 이는 1010개의 입자/ml(pts/ml; 도 4a)의 추정된 입자 역가를 가졌다. VLP를 분해하기 위해 2몰(2 M) 요소를 사용하여 VLP를 처리하였다. EM에 의한 재이미징은 관찰된 VLP가 없음을 보여주었다(도 4b). 이어서, 요소-처리된 VLP를 투석하여, mRNA의 부재(도 4c) 또는 약 10x 과량의 GFP를 인코딩하는 mRNA의 존재(도 4d 및 4e) 하에 요소를 제거하였다. 요소로 처리되고 mRNA의 부재 하에 투석된 VLP 샘플의 경우, EM에 의해 입자가 거의 관찰되지 않았다(108개 미만의 입자/ml; 도 4c). 대조적으로, 과량의 mRNA의 존재 하에서의 투석은 EM에 의해 실질적으로 더 높은 역가의 입자(약 109 내지 1010개의 입자/ml; 도 4d 및 eE)의 관찰을 초래하였다. 이들 데이터는 VLP의 분해 및 재어셈블리가 mRNA의 존재 하에서 보다 효율적임을 입증하고, 아넬로바이러스 ORF1 단백질이 아넬로벡터를 형성하기 위해 시험관 내에서 mRNA를 캡시드화하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 변형된 ORF1 단백질을 사용한 mRNA-캡시드화 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
이 실시예에서, mRNA에 결합하는 접촉 잔기를 보유하도록 ORF1 단백질을 변형시킴으로써 mRNA 유전 요소의 패키징이 개선된다. 이 실시예에서, ssDNA 및/또는 N-말단 아르기닌-풍부 모티프(ARM)와 접촉하는 ssDNA 접촉 잔기 및/또는 젤리롤 베타 가닥을 mRNA 결합 바이러스 단백질 또는 기타 mRNA-결합 단백질의 구성성분으로 대체할 수 있어, mRNA의 효율적인 결합 및 패키징을 허용하였다. 이 mRNA-결합 키메라 ORF1은 0.1% SDS를 갖는 1 M NaCl로 처리되어, 올리고머 또는 VLP를 분산된 단백질 또는 캡소머로 분리한다. 그런 다음, 키메라 ORF1은 관심 유전자(예를 들어, 리포터 유전자, 예를 들어, GFP, mCherry; 또는 관심 이펙터, 예를 들어, EPO)를 인코딩하는 mRNA와 같은 mRNA와 혼합되고, VLP 형성을 허용하기 위해 150 mM NaCl를 갖는 Tris pH 8.0에 대해 투석된다. 후속 복합체는 아넬로벡터 캡시드화 mRNA를 단리하기 위해 Tris pH 8.0 완충액을 사용하는 SEC에 의해 정제된다. 아넬로벡터 어셈블리는 예를 들어, 세포를 형질도입하고 리포터 유전자(예를 들어, mCherry 또는 GFP)의 발현을 관찰함으로써 또는 관심 이펙터의 발현을 통해(예를 들어, EPO와 같은 유전자의 발현을 검출하기 위해 ELISA를 사용하여) 시험관 내 또는 생체 내 판독에 의해 추가로 평가될 수 있다.
ORF1 분자에 대한 예시적인 변형: 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 고리 ORF1 분자는 예를 들어, 여러 야생형 아넬로바이러스 ORF1 단백질; CAV 캡시드 단백질(VP1) 변이체; 어셈블리 효율, 수율 또는 안정성을 개선시키기 위한 돌연변이를 보유하는 아넬로바이러스 ORF1 단백질; 및 키메라 ORF1 균주 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 일부 예에서, 친화도 태그가 예를 들어, N-말단(SEQ ID NO: 561 내지 562)에서 ORF1 분자에 부착된다. 일부 예에서, ORF1 분자는 태그가 부착되지 않은 단백질이다. 고리 ORF1 분자는 단독으로 또는 비제한적으로 아넬로바이러스 ORF2 및/또는 ORF3 단백질을 포함하는 임의의 수의 헬퍼 단백질과 조합하여 발현될 수 있다.
어셈블리 효율을 개선시키기 위한 돌연변이를 보유하는 고리 ORF1 단백질은 예를 들어, pH 민감성 핵산 결합을 허용하여 입자 어셈블리를 촉발할 수 있는, ARG 아암의 pI를 변경하기 위해 N-말단 아르기닌-풍부 모티프(ARM) 내로 도입된 돌연변이를 보유하는 ORF1 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다 (SEQ ID NO: 563 내지 565). 안정성을 개선시키는 ORF1 돌연변이는 예를 들어, 프로토머 표면의 소수성 상태를 변경시키고/변경시키거나 캡시드 형성이 보다 열역학적으로 선호되도록 만들기 위해 예를 들어, 표준 젤리롤 베타-배럴(F 및 G 베타 가닥)의 베타 가닥 F 및 G와 접촉하는 인터프로토머에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다.
키메라 ORF1 단백질은 또 다른 캡시드 단백질, 예컨대, BFDV 캡시드 단백질, E형 간염 캡시드 단백질로부터의 비슷한 부분(예를 들어, ARG 아암 및/또는 또는 F 및 G 베타 가닥, 또는 그의 비슷한 구성성분)으로 대체된 이들의 서열의 일부 또는 일부들을 갖는 ORF1 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 키메라 ORF1 단백질은 다른 아넬로바이러스 ORF1 단백질의 비슷한 부분(예컨대, 젤리 롤 단편 또는 고리 9 ORF1의 비슷한 부분으로 대체된 고리 2 ORF1의 C-말단 부분; 예를 들어, SEQ ID NO: 568 내지 575 참고)으로 대체된 이들의 서열의 일부 또는 일부들을 갖는 ORF1 단백질을 포함할 수도 있다.
일반적으로 ORF1 분자는 비제한적으로 킬레이팅 정제, 헤파린 정제, 구배 침강 정제 및/또는 SEC 정제를 포함하는 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
실시예 4: 변형된 mRNA를 사용한 mRNA-캡시드화 아넬로벡터의 시험관 내 어셈블리
이 실시예에서, mRNA 기반 유전 요소의 캡시드화는 mRNA 분자를 ssDNA에 결합시키거나 백본의 섹션이 야생형 ORF1의 ssDNA 접촉 잔기에 대한 결합을 허용하는 방식으로 mRNA 이식유전자를 변형함으로써 최적화된다. mRNA는 일반적으로 리포터 유전자(예를 들어, GFP 또는 mCherry) 및/또는 이펙터 유전자(예를 들어, EPO)와 같은 관심 유전자를 인코딩한다.
일 실시예에서, 당 사슬 백본 덕분에 ORF1에 결합할 수 있지만 mRNA와 비공유적으로 쌍을 이룰 수도 있는 변형된 ssDNA는 mRNA/DNA 복합체를 생성하기 위해 관심 있는 mRNA와 혼합된다. 그런 다음 이 mRNA/DNA 복합체는 고리 ORF1을 사용하여 캡시드화되어 예를 들어, 하기에 설명된 대로 아넬로벡터를 형성할 수 있다.
다른 실시예에서 mRNA 분자는, 운반될 유전자(예를 들어, 리포터 유전자 또는 이펙터 유전자)를 인코딩하는 mRNA의 일부분을 간직하면서도 ORF1과의 결합 및 캡시드화가 가능하도록 하는 DNA 골격을 보유한 mRNA 분자의 절편 또는 절편들을 사용하여 합성된다. 그런 다음 이 mRNA/DNA 혼성 분자는 예를 들어, 아래에 설명된 바와 같이 아넬로벡터를 형성하기 위해 고리 ORF1을 사용하여 캡시드화될 수 있다.
시험관 내 어셈블리에 의한 캡시드화: 위에서 설명한 mRNA/DNA 유전 요소는 시험관 내 어셈블리에 의해 캡시드화된다. 간략하게, 아넬로벡터 ORF1은 올리고머 또는 VLP를 분산된 단백질 또는 캡소머로 분리시키기 위해 0.1% SDS를 갖는 1 M NaCl로 처리된다. 그런 다음 ORF1을 합성 mRNA 복합체 또는 혼성 분자와 혼합하고 150 mM NaCl로 Tris pH 8.0에 대해 투석하여 VLP 형성을 허용한다. 후속 입자는 아넬로벡터 캡시드화 mRNA를 단리하기 위해 Tris pH 8.0 버퍼를 사용하여 SEC에 의해 정제된다. 아넬로벡터 어셈블리는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 세포를 형질도입하고 리포터 유전자 또는 이펙터 유전자의 발현을 관찰함으로써 시험관내 또는 생체내 판독에 의해 추가로 평가될 수 있다.
실시예 5: 아넬로바이러스 ORF1 캡시드 단백질의 구조 분석
아넬로바이러스는 조류 병원체인 부리 및 깃털 질병 바이러스(BFDV) 또는 닭 빈혈 바이러스(CAV)와 같은 잘 특성화된 다른 바이러스에 대해 예측되는 구조적 특징을 공유한다.
아넬로바이러스 ORF1 캡시드 단백질은 BFDV의 것과 유사한 N-말단 ARM 서열을 함유한다. 2차 구조 예측은 균주에 좌우되는 ORF1의 처음 약 250개의 잔기가 8개의 예측된 베타 가닥을 포함함을 보여주었다(도 3). 젤리 롤 도메인 명명 규칙에 따라 B에서 I로 명명된 8개의 ORF1의 예측된 베타 가닥이 BFDV 및 Hep E의 캡시드 단백질에 대한 2차 구조 예측에 의해 정렬 가이드될 때, ORF1에 보존된 라이신 및 아르기닌 잔기는 BFDV 및 Hep E 캡시드 단백질의 알려진 ssDNA 접촉 잔기와 정렬된다 (도 3, 별표로 표시됨).
서열
아래 열거된 서열은 다음과 같이 주석 처리된다. 볼드체 및 밑줄이 그어진 텍스트는 킬레이팅 정제에 사용되는 His6 태그(HHHHHH) 및 예를 들어, 저-발현 단백질의 웨스턴 블롯 검출에 사용되는 강한 에피토프인 플래그 태그(DYKDDDDK)를 포함하는 서열을 나타낸다. 볼드체 및 이탤릭체 서열은 고리9 ORF1 서열 또는 그의 일부를 나타낸다. 볼드체가 아니고 밑줄이 그어지지 않은 서열은 고리2 서열 또는 그의 일부이다. 볼드체가 아닌 밑줄이 그어진 서열은 부리 및 깃털 질병 바이러스(BFDV)로부터 유래된 것이다. 회색 강조 표시는 예를 들어, 아르기닌-풍부 영역과 고리 9 ORF1의 제1 베타 가닥에서 라이신에서 히스티딘으로의 돌연변이의 위치를 나타낸다.
SEQ ID NO: 561:
고리 2 N-말단 HIS-FLAG-3C프로테아제-ORF1:
Figure pct00105
SEQ ID NO: 562:
고리 9 N-말단 HIS-FLAG-3C프로테아제-ORF1:
Figure pct00106
Figure pct00107
SEQ ID NO: 563:
고리 9의 ARG 아암을 갖는 고리 2 ORF1(고리 291)
Figure pct00108
SEQ ID NO: 564:
고리 9의 ARG 아암 및 베타 가닥 1 + 2722 에피토프를 갖는 고리 2 ORF1 (고리 292)
Figure pct00109
SEQ ID NO: 565:
ARG 아암 및 제1 베타 가닥에 LYS/HIS 돌연변이를 갖는 고리 9
Figure pct00110
Figure pct00111
SEQ ID NO: 566:
BFDV의 ARG 아암을 갖는 고리 9:
Figure pct00112
SEQ ID NO: 567:
BFDV 캡시드 단백질의 베타 가닥 F 및 G를 갖는 고리 9:
Figure pct00113
SEQ ID NO: 568:
고리 9의 베타 C를 갖는 고리 2:
Figure pct00114
Figure pct00115
SEQ ID NO: 569:
고리 9의 링커 1을 갖는 고리 2:
Figure pct00116
SEQ ID NO: 570:
고리 9의 베타 가닥 D를 갖는 고리 2:
Figure pct00117
SEQ ID NO: 571:
고리 9의 링커 2를 갖는 고리 2:
Figure pct00118
Figure pct00119
SEQ ID NO: 572:
고리 9의 베타 가닥 G DNA 결합을 갖는 고리 2:
Figure pct00120
SEQ ID NO: 573:
고리 9의 베타 가닥 F 인터프로토머 접촉부를 갖는 고리 2:
Figure pct00121
SEQ ID NO: 574:
고리 9의 C-말단 단편을 갖는 가닥 H 및 I를 갖는 고리 2 ORF1:
Figure pct00122
SEQ ID NO: 575:
고리 9의 가닥 I 및 C-말단 단편을 갖는 고리 2 ORF1:
Figure pct00123
SEQUENCE LISTING <110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC. <120> IN VITRO ASSEMBLY OF ANELLOVIRUS CAPSIDS ENCLOSING RNA <130> V2057-7017WO <140> <141> <150> 63/147,064 <151> 2021-02-08 <150> 63/130,360 <151> 2020-12-23 <160> 968 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 85 90 95 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 100 105 110 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 130 135 140 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His 195 200 205 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 210 215 220 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 245 250 255 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val 260 265 270 Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser 275 280 285 Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser 290 295 300 Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr 305 310 315 320 Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn 325 330 335 Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr 340 345 350 Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe 355 360 365 Asn Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys 370 375 380 Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp 385 390 395 400 Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu 405 410 415 Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu 420 425 430 Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp 435 440 445 Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu 450 455 460 Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr 465 470 475 480 Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu 500 505 510 Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys 515 520 525 Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu 530 535 540 Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn 545 550 555 560 Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro 565 570 575 Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile 580 585 590 Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala 595 600 605 Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr 610 615 620 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr 625 630 635 640 Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala 645 650 655 Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys 660 665 670 Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr 675 680 685 Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 690 695 <210> 2 <211> 688 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Pro Tyr Trp Arg Gln Lys Tyr Tyr Arg Arg Arg Tyr Arg 35 40 45 Pro Phe Ser Trp Arg Thr Arg Arg Ile Ile Gln Arg Arg Lys Arg Trp 50 55 60 Arg Tyr Arg Lys Pro Arg Lys Thr Tyr Trp Arg Arg Lys Leu Arg Val 65 70 75 80 Arg Lys Arg Phe Tyr Lys Arg Lys Leu Lys Lys Ile Val Leu Lys Gln 85 90 95 Phe Gln Pro Lys Ile Ile Arg Arg Cys Thr Ile Phe Gly Thr Ile Cys 100 105 110 Leu Phe Gln Gly Ser Pro Glu Arg Ala Asn Asn Asn Tyr Ile Gln Thr 115 120 125 Ile Tyr Ser Tyr Val Pro Asp Lys Glu Pro Gly Gly Gly Gly Trp Thr 130 135 140 Leu Ile Thr Glu Ser Leu Ser Ser Leu Trp Glu Asp Trp Glu His Leu 145 150 155 160 Lys Asn Val Trp Thr Gln Ser Asn Ala Gly Leu Pro Leu Val Arg Tyr 165 170 175 Gly Gly Val Thr Leu Tyr Phe Tyr Gln Ser Ala Tyr Thr Asp Tyr Ile 180 185 190 Ala Gln Val Phe Asn Cys Tyr Pro Met Thr Asp Thr Lys Tyr Thr His 195 200 205 Ala Asp Ser Ala Pro Asn Arg Met Leu Leu Lys Lys His Val Ile Arg 210 215 220 Val Pro Ser Arg Glu Thr Arg Lys Lys Arg Lys Pro Tyr Lys Arg Val 225 230 235 240 Arg Val Gly Pro Pro Ser Gln Met Gln Asn Lys Trp Tyr Phe Gln Arg 245 250 255 Asp Ile Cys Glu Ile Pro Leu Ile Met Ile Ala Ala Thr Ala Val Asp 260 265 270 Phe Arg Tyr Pro Phe Cys Ala Ser Asp Cys Ala Ser Asn Asn Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Cys Leu Asn Pro Leu Leu Phe Gln Asn Gln Asp Phe Asp His 290 295 300 Pro Ser Asp Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Lys Pro Gly Val Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 Ser Thr Gln Arg Ser Asn Lys Pro Ser Ser Ser Asp Cys Ile Tyr Leu 325 330 335 Gly Asn Thr Lys Asp Asn Gln Glu Gly Lys Ser Ala Ser Ser Leu Met 340 345 350 Thr Leu Lys Thr Gln Lys Ile Thr Asp Trp Gly Asn Pro Phe Trp His 355 360 365 Tyr Tyr Ile Asp Gly Ser Lys Lys Ile Phe Ser Tyr Phe Lys Pro Pro 370 375 380 Ser Gln Leu Asp Ser Ser Asp Phe Glu His Met Thr Glu Leu Ala Glu 385 390 395 400 Pro Met Phe Ile Gln Val Arg Tyr Asn Pro Glu Arg Asp Thr Gly Gln 405 410 415 Gly Asn Leu Ile Tyr Val Thr Glu Asn Phe Arg Gly Gln His Trp Asp 420 425 430 Pro Pro Ser Ser Asp Asn Leu Lys Leu Asp Gly Phe Pro Leu Tyr Asp 435 440 445 Met Cys Trp Gly Phe Ile Asp Trp Ile Glu Lys Val His Glu Thr Glu 450 455 460 Asn Leu Leu Thr Asn Tyr Cys Phe Cys Ile Arg Ser Ser Ala Phe Asn 465 470 475 480 Glu Lys Lys Thr Val Phe Ile Pro Val Asp His Ser Phe Leu Thr Gly 485 490 495 Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Val Lys Ser Ser Asp Gln Ala His Trp 500 505 510 His Pro Gln Ile Arg Phe Gln Thr Lys Ser Ile Asn Asp Ile Cys Leu 515 520 525 Thr Gly Pro Gly Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Asn Tyr Met Gln Ala 530 535 540 Lys Met Ser Tyr Lys Phe His Val Lys Trp Gly Gly Cys Pro Lys Thr 545 550 555 560 Tyr Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Cys Ser Gln Pro Asn Trp Thr Ile Pro 565 570 575 His Asn Leu Asn Glu Thr Ile Gln Ile Gln Asn Pro Asn Thr Cys Pro 580 585 590 Gln Thr Glu Leu Gln Glu Trp Asp Trp Arg Arg Asp Ile Val Thr Lys 595 600 605 Lys Ala Ile Glu Arg Ile Arg Gln His Thr Glu Pro His Glu Thr Leu 610 615 620 Gln Ile Ser Thr Gly Ser Lys His Asn Pro Pro Val His Arg Gln Thr 625 630 635 640 Ser Pro Trp Thr Asp Ser Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Lys Asp Gln 645 650 655 Thr Gln Glu Ile Gln Ile Gln Leu Asn Lys Leu Arg Lys His Gln Gln 660 665 670 His Leu Lys Gln Gln Leu Lys Gln Tyr Leu Lys Pro Gln Asn Ile Glu 675 680 685 <210> 3 <211> 714 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Pro Tyr Trp Arg Gln Lys Tyr Tyr Arg Arg Arg Tyr Arg 35 40 45 Pro Phe Ser Trp Arg Thr Arg Arg Ile Ile Gln Arg Arg Lys Arg Trp 50 55 60 Arg Tyr Arg Lys Pro Arg Lys Thr Tyr Trp Arg Arg Lys Leu Arg Val 65 70 75 80 Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln 85 90 95 Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys 100 105 110 Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr 115 120 125 Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser 130 135 140 Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys 145 150 155 160 Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr 165 170 175 Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 180 185 190 Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr 195 200 205 Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile 210 215 220 Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile 225 230 235 240 Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr 245 250 255 Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn 260 265 270 Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr 275 280 285 Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val 290 295 300 Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe 305 310 315 320 Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln 325 330 335 Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg 340 345 350 Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe 355 360 365 Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn 370 375 380 Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser 385 390 395 400 Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn 405 410 415 Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro 420 425 430 Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp 435 440 445 Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro 450 455 460 Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile 465 470 475 480 Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn 485 490 495 Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys 500 505 510 Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly 515 520 525 Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp 530 535 540 Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln 545 550 555 560 Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile 565 570 575 Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys 580 585 590 Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro 595 600 605 Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro 610 615 620 Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr 625 630 635 640 Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val 645 650 655 Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu 660 665 670 Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu 675 680 685 Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg 690 695 700 Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 705 710 <210> 4 <211> 714 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Pro Tyr Trp Arg Gln Lys Tyr Tyr Arg Arg Arg Tyr Arg 35 40 45 Pro Phe Ser Trp Arg Thr Arg Arg Ile Ile Gln Arg Arg Lys Arg Trp 50 55 60 Arg Tyr Arg Lys Pro Arg Lys Thr Tyr Trp Arg Arg Lys Leu Arg Val 65 70 75 80 Arg Lys Arg Phe Tyr Lys Arg Lys Leu Lys Lys Ile Val Leu Lys Gln 85 90 95 Phe Gln Pro Lys Ile Ile Arg Arg Cys Thr Ile Phe Gly Thr Ile Cys 100 105 110 Leu Phe Gln Gly Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr 115 120 125 Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser 130 135 140 Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys 145 150 155 160 Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr 165 170 175 Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 180 185 190 Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr 195 200 205 Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile 210 215 220 Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile 225 230 235 240 Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr 245 250 255 Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn 260 265 270 Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr 275 280 285 Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val 290 295 300 Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe 305 310 315 320 Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln 325 330 335 Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg 340 345 350 Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe 355 360 365 Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn 370 375 380 Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser 385 390 395 400 Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn 405 410 415 Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro 420 425 430 Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp 435 440 445 Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro 450 455 460 Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile 465 470 475 480 Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn 485 490 495 Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys 500 505 510 Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly 515 520 525 Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp 530 535 540 Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln 545 550 555 560 Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile 565 570 575 Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys 580 585 590 Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro 595 600 605 Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro 610 615 620 Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr 625 630 635 640 Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val 645 650 655 Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu 660 665 670 Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu 675 680 685 Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg 690 695 700 Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 705 710 <210> 5 <211> 688 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Pro Tyr Trp Arg Gln Lys Tyr Tyr Arg Arg Arg Tyr Arg 35 40 45 Pro Phe Ser Trp Arg Thr Arg Arg Ile Ile Gln Arg Arg His Arg Trp 50 55 60 Arg Tyr Arg Lys Pro Arg His Thr Tyr Trp Arg Arg His Leu Arg Val 65 70 75 80 Arg His Arg Phe Tyr His Arg His Leu His His Ile Val Leu Lys Gln 85 90 95 Phe Gln Pro Lys Ile Ile Arg Arg Cys Thr Ile Phe Gly Thr Ile Cys 100 105 110 Leu Phe Gln Gly Ser Pro Glu Arg Ala Asn Asn Asn Tyr Ile Gln Thr 115 120 125 Ile Tyr Ser Tyr Val Pro Asp Lys Glu Pro Gly Gly Gly Gly Trp Thr 130 135 140 Leu Ile Thr Glu Ser Leu Ser Ser Leu Trp Glu Asp Trp Glu His Leu 145 150 155 160 Lys Asn Val Trp Thr Gln Ser Asn Ala Gly Leu Pro Leu Val Arg Tyr 165 170 175 Gly Gly Val Thr Leu Tyr Phe Tyr Gln Ser Ala Tyr Thr Asp Tyr Ile 180 185 190 Ala Gln Val Phe Asn Cys Tyr Pro Met Thr Asp Thr Lys Tyr Thr His 195 200 205 Ala Asp Ser Ala Pro Asn Arg Met Leu Leu Lys Lys His Val Ile Arg 210 215 220 Val Pro Ser Arg Glu Thr Arg Lys Lys Arg Lys Pro Tyr Lys Arg Val 225 230 235 240 Arg Val Gly Pro Pro Ser Gln Met Gln Asn Lys Trp Tyr Phe Gln Arg 245 250 255 Asp Ile Cys Glu Ile Pro Leu Ile Met Ile Ala Ala Thr Ala Val Asp 260 265 270 Phe Arg Tyr Pro Phe Cys Ala Ser Asp Cys Ala Ser Asn Asn Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Cys Leu Asn Pro Leu Leu Phe Gln Asn Gln Asp Phe Asp His 290 295 300 Pro Ser Asp Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Lys Pro Gly Val Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 Ser Thr Gln Arg Ser Asn Lys Pro Ser Ser Ser Asp Cys Ile Tyr Leu 325 330 335 Gly Asn Thr Lys Asp Asn Gln Glu Gly Lys Ser Ala Ser Ser Leu Met 340 345 350 Thr Leu Lys Thr Gln Lys Ile Thr Asp Trp Gly Asn Pro Phe Trp His 355 360 365 Tyr Tyr Ile Asp Gly Ser Lys Lys Ile Phe Ser Tyr Phe Lys Pro Pro 370 375 380 Ser Gln Leu Asp Ser Ser Asp Phe Glu His Met Thr Glu Leu Ala Glu 385 390 395 400 Pro Met Phe Ile Gln Val Arg Tyr Asn Pro Glu Arg Asp Thr Gly Gln 405 410 415 Gly Asn Leu Ile Tyr Val Thr Glu Asn Phe Arg Gly Gln His Trp Asp 420 425 430 Pro Pro Ser Ser Asp Asn Leu Lys Leu Asp Gly Phe Pro Leu Tyr Asp 435 440 445 Met Cys Trp Gly Phe Ile Asp Trp Ile Glu Lys Val His Glu Thr Glu 450 455 460 Asn Leu Leu Thr Asn Tyr Cys Phe Cys Ile Arg Ser Ser Ala Phe Asn 465 470 475 480 Glu Lys Lys Thr Val Phe Ile Pro Val Asp His Ser Phe Leu Thr Gly 485 490 495 Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Val Lys Ser Ser Asp Gln Ala His Trp 500 505 510 His Pro Gln Ile Arg Phe Gln Thr Lys Ser Ile Asn Asp Ile Cys Leu 515 520 525 Thr Gly Pro Gly Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Asn Tyr Met Gln Ala 530 535 540 Lys Met Ser Tyr Lys Phe His Val Lys Trp Gly Gly Cys Pro Lys Thr 545 550 555 560 Tyr Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Cys Ser Gln Pro Asn Trp Thr Ile Pro 565 570 575 His Asn Leu Asn Glu Thr Ile Gln Ile Gln Asn Pro Asn Thr Cys Pro 580 585 590 Gln Thr Glu Leu Gln Glu Trp Asp Trp Arg Arg Asp Ile Val Thr Lys 595 600 605 Lys Ala Ile Glu Arg Ile Arg Gln His Thr Glu Pro His Glu Thr Leu 610 615 620 Gln Ile Ser Thr Gly Ser Lys His Asn Pro Pro Val His Arg Gln Thr 625 630 635 640 Ser Pro Trp Thr Asp Ser Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Lys Asp Gln 645 650 655 Thr Gln Glu Ile Gln Ile Gln Leu Asn Lys Leu Arg Lys His Gln Gln 660 665 670 His Leu Lys Gln Gln Leu Lys Gln Tyr Leu Lys Pro Gln Asn Ile Glu 675 680 685 <210> 6 <211> 687 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Trp Gly Thr Ser Asn Cys Ala Cys Ala Lys Phe Gln Ile Arg 35 40 45 Arg Arg Tyr Ala Arg Pro Tyr Arg Arg Arg His Ile Arg Arg Tyr Arg 50 55 60 Arg Arg Arg Arg His Phe Arg Arg Arg Arg Phe Thr Thr Asn Arg Arg 65 70 75 80 Lys Arg Phe Tyr Lys Arg Lys Leu Lys Lys Ile Val Leu Lys Gln Phe 85 90 95 Gln Pro Lys Ile Ile Arg Arg Cys Thr Ile Phe Gly Thr Ile Cys Leu 100 105 110 Phe Gln Gly Ser Pro Glu Arg Ala Asn Asn Asn Tyr Ile Gln Thr Ile 115 120 125 Tyr Ser Tyr Val Pro Asp Lys Glu Pro Gly Gly Gly Gly Trp Thr Leu 130 135 140 Ile Thr Glu Ser Leu Ser Ser Leu Trp Glu Asp Trp Glu His Leu Lys 145 150 155 160 Asn Val Trp Thr Gln Ser Asn Ala Gly Leu Pro Leu Val Arg Tyr Gly 165 170 175 Gly Val Thr Leu Tyr Phe Tyr Gln Ser Ala Tyr Thr Asp Tyr Ile Ala 180 185 190 Gln Val Phe Asn Cys Tyr Pro Met Thr Asp Thr Lys Tyr Thr His Ala 195 200 205 Asp Ser Ala Pro Asn Arg Met Leu Leu Lys Lys His Val Ile Arg Val 210 215 220 Pro Ser Arg Glu Thr Arg Lys Lys Arg Lys Pro Tyr Lys Arg Val Arg 225 230 235 240 Val Gly Pro Pro Ser Gln Met Gln Asn Lys Trp Tyr Phe Gln Arg Asp 245 250 255 Ile Cys Glu Ile Pro Leu Ile Met Ile Ala Ala Thr Ala Val Asp Phe 260 265 270 Arg Tyr Pro Phe Cys Ala Ser Asp Cys Ala Ser Asn Asn Leu Thr Leu 275 280 285 Thr Cys Leu Asn Pro Leu Leu Phe Gln Asn Gln Asp Phe Asp His Pro 290 295 300 Ser Asp Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Lys Pro Gly Val Tyr Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Thr Gln Arg Ser Asn Lys Pro Ser Ser Ser Asp Cys Ile Tyr Leu Gly 325 330 335 Asn Thr Lys Asp Asn Gln Glu Gly Lys Ser Ala Ser Ser Leu Met Thr 340 345 350 Leu Lys Thr Gln Lys Ile Thr Asp Trp Gly Asn Pro Phe Trp His Tyr 355 360 365 Tyr Ile Asp Gly Ser Lys Lys Ile Phe Ser Tyr Phe Lys Pro Pro Ser 370 375 380 Gln Leu Asp Ser Ser Asp Phe Glu His Met Thr Glu Leu Ala Glu Pro 385 390 395 400 Met Phe Ile Gln Val Arg Tyr Asn Pro Glu Arg Asp Thr Gly Gln Gly 405 410 415 Asn Leu Ile Tyr Val Thr Glu Asn Phe Arg Gly Gln His Trp Asp Pro 420 425 430 Pro Ser Ser Asp Asn Leu Lys Leu Asp Gly Phe Pro Leu Tyr Asp Met 435 440 445 Cys Trp Gly Phe Ile Asp Trp Ile Glu Lys Val His Glu Thr Glu Asn 450 455 460 Leu Leu Thr Asn Tyr Cys Phe Cys Ile Arg Ser Ser Ala Phe Asn Glu 465 470 475 480 Lys Lys Thr Val Phe Ile Pro Val Asp His Ser Phe Leu Thr Gly Phe 485 490 495 Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Val Lys Ser Ser Asp Gln Ala His Trp His 500 505 510 Pro Gln Ile Arg Phe Gln Thr Lys Ser Ile Asn Asp Ile Cys Leu Thr 515 520 525 Gly Pro Gly Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Asn Tyr Met Gln Ala Lys 530 535 540 Met Ser Tyr Lys Phe His Val Lys Trp Gly Gly Cys Pro Lys Thr Tyr 545 550 555 560 Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Cys Ser Gln Pro Asn Trp Thr Ile Pro His 565 570 575 Asn Leu Asn Glu Thr Ile Gln Ile Gln Asn Pro Asn Thr Cys Pro Gln 580 585 590 Thr Glu Leu Gln Glu Trp Asp Trp Arg Arg Asp Ile Val Thr Lys Lys 595 600 605 Ala Ile Glu Arg Ile Arg Gln His Thr Glu Pro His Glu Thr Leu Gln 610 615 620 Ile Ser Thr Gly Ser Lys His Asn Pro Pro Val His Arg Gln Thr Ser 625 630 635 640 Pro Trp Thr Asp Ser Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Lys Asp Gln Thr 645 650 655 Gln Glu Ile Gln Ile Gln Leu Asn Lys Leu Arg Lys His Gln Gln His 660 665 670 Leu Lys Gln Gln Leu Lys Gln Tyr Leu Lys Pro Gln Asn Ile Glu 675 680 685 <210> 7 <211> 688 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Pro Tyr Trp Arg Gln Lys Tyr Tyr Arg Arg Arg Tyr Arg 35 40 45 Pro Phe Ser Trp Arg Thr Arg Arg Ile Ile Gln Arg Arg Lys Arg Trp 50 55 60 Arg Tyr Arg Lys Pro Arg Lys Thr Tyr Trp Arg Arg Lys Leu Arg Val 65 70 75 80 Arg Lys Arg Phe Tyr Lys Arg Lys Leu Lys Lys Ile Val Leu Lys Gln 85 90 95 Phe Gln Pro Lys Ile Ile Arg Arg Cys Thr Ile Phe Gly Thr Ile Cys 100 105 110 Leu Phe Gln Gly Ser Pro Glu Arg Ala Asn Asn Asn Tyr Ile Gln Thr 115 120 125 Ile Tyr Ser Tyr Val Pro Asp Lys Glu Pro Gly Gly Gly Gly Trp Thr 130 135 140 Leu Ile Thr Glu Ser Leu Ser Ser Leu Trp Glu Asp Trp Glu His Leu 145 150 155 160 Lys Asn Val Trp Thr Gln Ser Asn Ala Gly Leu Pro Leu Val Arg Tyr 165 170 175 Gly Gly Val Thr Leu Tyr Phe Tyr Gln Ser Ala Tyr Thr Asp Tyr Ile 180 185 190 Ala Gln Val Phe Asn Cys Tyr Pro Met Thr Asp Thr Lys Tyr Thr His 195 200 205 Ala Asp Ser Ala Pro Asn Arg Met Leu Leu Lys Lys His Ala Lys Lys 210 215 220 Trp Phe Ser Arg Glu Thr Arg Lys Lys Arg Lys Pro Gly Phe Lys Arg 225 230 235 240 Leu Leu Gly Pro Pro Ser Gln Met Gln Asn Lys Trp Tyr Phe Gln Arg 245 250 255 Asp Ile Cys Glu Ile Pro Leu Ile Met Ile Ala Ala Thr Ala Val Asp 260 265 270 Phe Arg Tyr Pro Phe Cys Ala Ser Asp Cys Ala Ser Asn Asn Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Cys Leu Asn Pro Leu Leu Phe Gln Asn Gln Asp Phe Asp His 290 295 300 Pro Ser Asp Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Lys Pro Gly Val Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 Ser Thr Gln Arg Ser Asn Lys Pro Ser Ser Ser Asp Cys Ile Tyr Leu 325 330 335 Gly Asn Thr Lys Asp Asn Gln Glu Gly Lys Ser Ala Ser Ser Leu Met 340 345 350 Thr Leu Lys Thr Gln Lys Ile Thr Asp Trp Gly Asn Pro Phe Trp His 355 360 365 Tyr Tyr Ile Asp Gly Ser Lys Lys Ile Phe Ser Tyr Phe Lys Pro Pro 370 375 380 Ser Gln Leu Asp Ser Ser Asp Phe Glu His Met Thr Glu Leu Ala Glu 385 390 395 400 Pro Met Phe Ile Gln Val Arg Tyr Asn Pro Glu Arg Asp Thr Gly Gln 405 410 415 Gly Asn Leu Ile Tyr Val Thr Glu Asn Phe Arg Gly Gln His Trp Asp 420 425 430 Pro Pro Ser Ser Asp Asn Leu Lys Leu Asp Gly Phe Pro Leu Tyr Asp 435 440 445 Met Cys Trp Gly Phe Ile Asp Trp Ile Glu Lys Val His Glu Thr Glu 450 455 460 Asn Leu Leu Thr Asn Tyr Cys Phe Cys Ile Arg Ser Ser Ala Phe Asn 465 470 475 480 Glu Lys Lys Thr Val Phe Ile Pro Val Asp His Ser Phe Leu Thr Gly 485 490 495 Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Val Lys Ser Ser Asp Gln Ala His Trp 500 505 510 His Pro Gln Ile Arg Phe Gln Thr Lys Ser Ile Asn Asp Ile Cys Leu 515 520 525 Thr Gly Pro Gly Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Asn Tyr Met Gln Ala 530 535 540 Lys Met Ser Tyr Lys Phe His Val Lys Trp Gly Gly Cys Pro Lys Thr 545 550 555 560 Tyr Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Cys Ser Gln Pro Asn Trp Thr Ile Pro 565 570 575 His Asn Leu Asn Glu Thr Ile Gln Ile Gln Asn Pro Asn Thr Cys Pro 580 585 590 Gln Thr Glu Leu Gln Glu Trp Asp Trp Arg Arg Asp Ile Val Thr Lys 595 600 605 Lys Ala Ile Glu Arg Ile Arg Gln His Thr Glu Pro His Glu Thr Leu 610 615 620 Gln Ile Ser Thr Gly Ser Lys His Asn Pro Pro Val His Arg Gln Thr 625 630 635 640 Ser Pro Trp Thr Asp Ser Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Lys Asp Gln 645 650 655 Thr Gln Glu Ile Gln Ile Gln Leu Asn Lys Leu Arg Lys His Gln Gln 660 665 670 His Leu Lys Gln Gln Leu Lys Gln Tyr Leu Lys Pro Gln Asn Ile Glu 675 680 685 <210> 8 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Arg Cys Thr Ile Phe Gly Thr Ile 85 90 95 Cys Leu Phe Gln Gly Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 100 105 110 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 130 135 140 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His 195 200 205 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 210 215 220 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 245 250 255 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val 260 265 270 Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser 275 280 285 Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser 290 295 300 Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr 305 310 315 320 Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn 325 330 335 Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr 340 345 350 Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe 355 360 365 Asn Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys 370 375 380 Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp 385 390 395 400 Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu 405 410 415 Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu 420 425 430 Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp 435 440 445 Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu 450 455 460 Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr 465 470 475 480 Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu 500 505 510 Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys 515 520 525 Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu 530 535 540 Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn 545 550 555 560 Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro 565 570 575 Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile 580 585 590 Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala 595 600 605 Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr 610 615 620 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr 625 630 635 640 Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala 645 650 655 Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys 660 665 670 Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr 675 680 685 Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 690 695 <210> 9 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 85 90 95 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Pro Glu Arg Ala Asn Asn Asn Tyr Ile Gln 100 105 110 Thr Ile Tyr Ser Tyr Val Pro Asp Lys Glu Pro Gly Gly Gly Gly Trp 115 120 125 Thr Leu Ile Thr Glu Ser Leu Ser Ser Leu Trp Glu Asp Trp Glu His 130 135 140 Leu Lys Asn Val Trp Thr Gln Ser Asn Ala Gly Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His 195 200 205 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 210 215 220 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 245 250 255 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val 260 265 270 Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser 275 280 285 Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser 290 295 300 Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr 305 310 315 320 Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn 325 330 335 Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr 340 345 350 Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe 355 360 365 Asn Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys 370 375 380 Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp 385 390 395 400 Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu 405 410 415 Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu 420 425 430 Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp 435 440 445 Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu 450 455 460 Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr 465 470 475 480 Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu 500 505 510 Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys 515 520 525 Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu 530 535 540 Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn 545 550 555 560 Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro 565 570 575 Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile 580 585 590 Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala 595 600 605 Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr 610 615 620 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr 625 630 635 640 Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala 645 650 655 Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys 660 665 670 Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr 675 680 685 Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 690 695 <210> 10 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 85 90 95 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 100 105 110 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 130 135 140 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Gly Gly Val Thr Leu Tyr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His 195 200 205 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 210 215 220 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 245 250 255 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val 260 265 270 Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser 275 280 285 Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser 290 295 300 Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr 305 310 315 320 Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn 325 330 335 Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr 340 345 350 Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe 355 360 365 Asn Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys 370 375 380 Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp 385 390 395 400 Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu 405 410 415 Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu 420 425 430 Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp 435 440 445 Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu 450 455 460 Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr 465 470 475 480 Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu 500 505 510 Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys 515 520 525 Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu 530 535 540 Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn 545 550 555 560 Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro 565 570 575 Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile 580 585 590 Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala 595 600 605 Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr 610 615 620 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr 625 630 635 640 Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala 645 650 655 Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys 660 665 670 Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr 675 680 685 Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 690 695 <210> 11 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 85 90 95 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 100 105 110 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 130 135 140 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Asn Cys Tyr Pro Met Thr Asp Thr Lys Tyr Thr 180 185 190 His Ala Asp Ser Ala Pro Asn Arg Met Leu Leu Lys Lys His Lys His 195 200 205 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 210 215 220 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 245 250 255 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val 260 265 270 Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser 275 280 285 Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser 290 295 300 Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr 305 310 315 320 Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn 325 330 335 Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr 340 345 350 Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe 355 360 365 Asn Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys 370 375 380 Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp 385 390 395 400 Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu 405 410 415 Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu 420 425 430 Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp 435 440 445 Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu 450 455 460 Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr 465 470 475 480 Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu 500 505 510 Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys 515 520 525 Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu 530 535 540 Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn 545 550 555 560 Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro 565 570 575 Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile 580 585 590 Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala 595 600 605 Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr 610 615 620 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr 625 630 635 640 Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala 645 650 655 Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys 660 665 670 Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr 675 680 685 Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 690 695 <210> 12 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 85 90 95 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 100 105 110 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 130 135 140 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His 195 200 205 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Lys Arg 210 215 220 Val Arg Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 245 250 255 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val 260 265 270 Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser 275 280 285 Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser 290 295 300 Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr 305 310 315 320 Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn 325 330 335 Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr 340 345 350 Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe 355 360 365 Asn Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys 370 375 380 Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp 385 390 395 400 Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu 405 410 415 Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu 420 425 430 Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp 435 440 445 Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu 450 455 460 Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr 465 470 475 480 Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu 500 505 510 Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys 515 520 525 Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu 530 535 540 Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn 545 550 555 560 Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro 565 570 575 Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile 580 585 590 Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala 595 600 605 Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr 610 615 620 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr 625 630 635 640 Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala 645 650 655 Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys 660 665 670 Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr 675 680 685 Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 690 695 <210> 13 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 85 90 95 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 100 105 110 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 130 135 140 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys His Val Ile 195 200 205 Arg Val Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 210 215 220 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 245 250 255 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val 260 265 270 Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser 275 280 285 Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser 290 295 300 Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr 305 310 315 320 Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn 325 330 335 Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr 340 345 350 Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe 355 360 365 Asn Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys 370 375 380 Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp 385 390 395 400 Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu 405 410 415 Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu 420 425 430 Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp 435 440 445 Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu 450 455 460 Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr 465 470 475 480 Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu 500 505 510 Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys 515 520 525 Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu 530 535 540 Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn 545 550 555 560 Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro 565 570 575 Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile 580 585 590 Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala 595 600 605 Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr 610 615 620 Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr 625 630 635 640 Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala 645 650 655 Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys 660 665 670 Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr 675 680 685 Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 690 695 <210> 14 <211> 673 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 85 90 95 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 100 105 110 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 130 135 140 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His 195 200 205 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 210 215 220 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Ile Met Ile Ala Ala Thr Ala Val 245 250 255 Asp Phe Arg Tyr Pro Phe Cys Ala Ser Asp Cys Ala Ser Asn Asn Leu 260 265 270 Thr Leu Thr Cys Leu Asn Pro Leu Leu Phe Gln Asn Gln Asp Phe Asp 275 280 285 His Pro Ser Asp Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Lys Pro Gly Val Tyr Leu 290 295 300 Tyr Ser Thr Gln Arg Ser Asn Lys Pro Ser Ser Ser Asp Cys Ile Tyr 305 310 315 320 Leu Gly Asn Thr Lys Asp Asn Gln Glu Gly Lys Ser Ala Ser Ser Leu 325 330 335 Met Thr Leu Lys Thr Gln Lys Ile Thr Asp Trp Gly Asn Pro Phe Trp 340 345 350 His Tyr Tyr Ile Asp Gly Ser Lys Lys Ile Phe Ser Tyr Phe Lys Pro 355 360 365 Pro Ser Gln Leu Asp Ser Ser Asp Phe Glu His Met Thr Glu Leu Ala 370 375 380 Glu Pro Met Phe Ile Gln Val Arg Tyr Asn Pro Glu Arg Asp Thr Gly 385 390 395 400 Gln Gly Asn Leu Ile Tyr Val Thr Glu Asn Phe Arg Gly Gln His Trp 405 410 415 Asp Pro Pro Ser Ser Asp Asn Leu Lys Leu Asp Gly Phe Pro Leu Tyr 420 425 430 Asp Met Cys Trp Gly Phe Ile Asp Trp Ile Glu Lys Val His Glu Thr 435 440 445 Glu Asn Leu Leu Thr Asn Tyr Cys Phe Cys Ile Arg Ser Ser Ala Phe 450 455 460 Asn Glu Lys Lys Thr Val Phe Ile Pro Val Asp His Ser Phe Leu Thr 465 470 475 480 Gly Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Val Lys Ser Ser Asp Gln Ala His 485 490 495 Trp His Pro Gln Ile Arg Phe Gln Thr Lys Ser Ile Asn Asp Ile Cys 500 505 510 Leu Thr Gly Pro Gly Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Asn Tyr Met Gln 515 520 525 Ala Lys Met Ser Tyr Lys Phe His Val Lys Trp Gly Gly Cys Pro Lys 530 535 540 Thr Tyr Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Cys Ser Gln Pro Asn Trp Thr Ile 545 550 555 560 Pro His Asn Leu Asn Glu Thr Ile Gln Ile Gln Asn Pro Asn Thr Cys 565 570 575 Pro Gln Thr Glu Leu Gln Glu Trp Asp Trp Arg Arg Asp Ile Val Thr 580 585 590 Lys Lys Ala Ile Glu Arg Ile Arg Gln His Thr Glu Pro His Glu Thr 595 600 605 Leu Gln Ile Ser Thr Gly Ser Lys His Asn Pro Pro Val His Arg Gln 610 615 620 Thr Ser Pro Trp Thr Asp Ser Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Lys Asp 625 630 635 640 Gln Thr Gln Glu Ile Gln Ile Gln Leu Asn Lys Leu Arg Lys His Gln 645 650 655 Gln His Leu Lys Gln Gln Leu Lys Gln Tyr Leu Lys Pro Gln Asn Ile 660 665 670 Glu <210> 15 <211> 673 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Asp Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro 35 40 45 Arg Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 65 70 75 80 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 85 90 95 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 100 105 110 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 115 120 125 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 130 135 140 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His 195 200 205 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 210 215 220 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 225 230 235 240 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 245 250 255 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Leu 260 265 270 Thr Leu Thr Cys Leu Asn Pro Leu Leu Phe Gln Asn Gln Asp Phe Asp 275 280 285 His Pro Ser Asp Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Lys Pro Gly Val Tyr Leu 290 295 300 Tyr Ser Thr Gln Arg Ser Asn Lys Pro Ser Ser Ser Asp Cys Ile Tyr 305 310 315 320 Leu Gly Asn Thr Lys Asp Asn Gln Glu Gly Lys Ser Ala Ser Ser Leu 325 330 335 Met Thr Leu Lys Thr Gln Lys Ile Thr Asp Trp Gly Asn Pro Phe Trp 340 345 350 His Tyr Tyr Ile Asp Gly Ser Lys Lys Ile Phe Ser Tyr Phe Lys Pro 355 360 365 Pro Ser Gln Leu Asp Ser Ser Asp Phe Glu His Met Thr Glu Leu Ala 370 375 380 Glu Pro Met Phe Ile Gln Val Arg Tyr Asn Pro Glu Arg Asp Thr Gly 385 390 395 400 Gln Gly Asn Leu Ile Tyr Val Thr Glu Asn Phe Arg Gly Gln His Trp 405 410 415 Asp Pro Pro Ser Ser Asp Asn Leu Lys Leu Asp Gly Phe Pro Leu Tyr 420 425 430 Asp Met Cys Trp Gly Phe Ile Asp Trp Ile Glu Lys Val His Glu Thr 435 440 445 Glu Asn Leu Leu Thr Asn Tyr Cys Phe Cys Ile Arg Ser Ser Ala Phe 450 455 460 Asn Glu Lys Lys Thr Val Phe Ile Pro Val Asp His Ser Phe Leu Thr 465 470 475 480 Gly Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Val Lys Ser Ser Asp Gln Ala His 485 490 495 Trp His Pro Gln Ile Arg Phe Gln Thr Lys Ser Ile Asn Asp Ile Cys 500 505 510 Leu Thr Gly Pro Gly Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Asn Tyr Met Gln 515 520 525 Ala Lys Met Ser Tyr Lys Phe His Val Lys Trp Gly Gly Cys Pro Lys 530 535 540 Thr Tyr Glu Lys Pro Tyr Asp Pro Cys Ser Gln Pro Asn Trp Thr Ile 545 550 555 560 Pro His Asn Leu Asn Glu Thr Ile Gln Ile Gln Asn Pro Asn Thr Cys 565 570 575 Pro Gln Thr Glu Leu Gln Glu Trp Asp Trp Arg Arg Asp Ile Val Thr 580 585 590 Lys Lys Ala Ile Glu Arg Ile Arg Gln His Thr Glu Pro His Glu Thr 595 600 605 Leu Gln Ile Ser Thr Gly Ser Lys His Asn Pro Pro Val His Arg Gln 610 615 620 Thr Ser Pro Trp Thr Asp Ser Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Lys Asp 625 630 635 640 Gln Thr Gln Glu Ile Gln Ile Gln Leu Asn Lys Leu Arg Lys His Gln 645 650 655 Gln His Leu Lys Gln Gln Leu Lys Gln Tyr Leu Lys Pro Gln Asn Ile 660 665 670 Glu <210> 16 <211> 3753 <212> DNA <213> Alphatorquevirus sp. <400> 16 tgctacgtca ctaacccacg tgtcctctac aggccaatcg cagtctatgt cgtgcacttc 60 ctgggcatgg tctacataat tatataaatg cttgcacttc cgaatggctg agtttttgct 120 gcccgtccgc ggagaggagc cacggcaggg gatccgaacg tcctgagggc gggtgccgga 180 ggtgagttta cacaccgaag tcaaggggca attcgggctc aggactggcc gggctttggg 240 caaggctctt aaaaatgcac ttttctcgaa taagcagaaa gaaaaggaaa gtgctactgc 300 tttgcgtgcc agcagctaag aaaaaaccaa ctgctatgag cttctggaaa cctccggtac 360 acaatgtcac ggggatccaa cgcatgtggt atgagtcctt tcaccgtggc cacgcttctt 420 tttgtggttg tgggaatcct atacttcaca ttactgcact tgctgaaaca tatggccatc 480 caacaggccc gagaccttct gggccaccgg gagtagaccc caacccccac atccgtagag 540 ccaggcctgc cccggccgct ccggagccct cacaggttga ttcgagacca gccctgacat 600 ggcatgggga tggtggaagc gacggaggcg ctggtggttc cggaagcggt ggacccgtgg 660 cagacttcgc agacgatggc ctcgatcagc tcgtcgccgc cctagacgac gaagagtaag 720 gaggcgcaga cggtggagga gggggagacg aaaaacaagg acttacagac gcaggagacg 780 ctttagacgc aggggacgaa aagcaaaact tataataaaa ctgtggcaac ctgcagtaat 840 taaaagatgc agaataaagg gatacatacc actgattata agtgggaacg gtacctttgc 900 cacaaacttt accagtcaca taaatgacag aataatgaaa ggccccttcg ggggaggaca 960 cagcactatg aggttcagcc tctacatttt gtttgaggag cacctcagac acatgaactt 1020 ctggaccaga agcaacgata acctagagct aaccagatac ttgggggctt cagtaaaaat 1080 atacaggcac ccagaccaag actttatagt aatatacaac agaagaaccc ctctaggagg 1140 caacatctac acagcaccct ctctacaccc aggcaatgcc attttagcaa aacacaaaat 1200 attagtacca agtttacaga caagaccaaa gggtagaaaa gcaattagac taagaatagc 1260 accccccaca ctctttacag acaagtggta ctttcaaaag gacatagccg acctcaccct 1320 tttcaacatc atggcagttg aggctgactt gcggtttccg ttctgctcac cacaaactga 1380 caacacttgc atcagcttcc aggtccttag ttccgtttac aacaactacc tcagtattaa 1440 tacctttaat aatgacaact cagactcaaa gttaaaagaa tttttaaata aagcatttcc 1500 aacaacaggc acaaaaggaa caagtttaaa tgcactaaat acatttagaa cagaaggatg 1560 cataagtcac ccacaactaa aaaaaccaaa cccacaaata aacaaaccat tagagtcaca 1620 atactttgca cctttagatg ccctctgggg agaccccata tactataatg atctaaatga 1680 aaacaaaagt ttgaacgata tcattgagaa aatactaata aaaaacatga ttacatacca 1740 tgcaaaacta agagaatttc caaattcata ccaaggaaac aaggcctttt gccacctaac 1800 aggcatatac agcccaccat acctaaacca aggcagaata tctccagaaa tatttggact 1860 gtacacagaa ataatttaca acccttacac agacaaagga actggaaaca aagtatggat 1920 ggacccacta actaaagaga acaacatata taaagaagga cagagcaaat gcctactgac 1980 tgacatgccc ctatggactt tactttttgg atatacagac tggtgtaaaa aggacactaa 2040 taactgggac ttaccactaa actacagact agtactaata tgcccttata cctttccaaa 2100 attgtacaat gaaaaagtaa aagactatgg gtacatcccg tactcctaca aattcggagc 2160 gggtcagatg ccagacggca gcaactacat accctttcag tttagagcaa agtggtaccc 2220 cacagtacta caccagcaac aggtaatgga ggacataagc aggagcgggc cctttgcacc 2280 taaggtagaa aaaccaagca ctcagctggt aatgaagtac tgttttaact ttaactgggg 2340 cggtaaccct atcattgaac agattgttaa agaccccagc ttccagccca cctatgaaat 2400 acccggtacc ggtaacatcc ctagaagaat acaagtcatc gacccgcggg tcctgggacc 2460 gcactactcg ttccggtcat gggacatgcg cagacacaca tttagcagag caagtattaa 2520 gagagtgtca gaacaacaag aaacttctga ccttgtattc tcaggcccaa aaaagcctcg 2580 ggtcgacatc ccaaaacaag aaacccaaga agaaagctca cattcactcc aaagagaatc 2640 gagaccgtgg gagaccgagg aagaaagcga gacagaagcc ctctcgcaag agagccaaga 2700 ggtccccttc caacagcagt tgcagcagca gtaccaagag cagctcaagc tcagacaggg 2760 aatcaaagtc ctcttcgagc agctcataag gacccaacaa ggggtccatg taaacccatg 2820 cctacggtag gtcccaggca gtggctgttt ccagagagaa agccagcccc agctcctagc 2880 agtggagact gggccatgga gtttctcgca gcaaaaatat ttgataggcc agttagaagc 2940 aaccttaaag atacccctta ctacccatat gttaaaaacc aatacaatgt ctactttgac 3000 cttaaatttg aataaacagc agcttcaaac ttgcaaggcc gtgggagttt cactggtcgg 3060 tgtctacctc taaaggtcac taagcactcc gagcgtaagc gaggagtgcg accctccccc 3120 ctggaacaac ttcttcggag tccggcgcta cgccttcggc tgcgccggac acctcagacc 3180 ccccctccac ccgaaacgct tgcgcgtttc ggaccttcgg cgtcgggggg gtcgggagct 3240 ttattaaacg gactccgaag tgctcttgga cactgagggg gtgaacagca acgaaagtga 3300 gtggggccag acttcgccat aaggccttta tcttcttgcc atttgtcagt gtccggggtc 3360 gccataggct tcgggctcgt ttttaggcct tccggactac aaaaatcgcc attttggtga 3420 cgtcacggcc gccatcttaa gtagttgagg cggacggtgg cgtgagttca aaggtcacca 3480 tcagccacac ctactcaaaa tggtggacaa tttcttccgg gtcaaaggtt acagccgcca 3540 tgttaaaaca cgtgacgtat gacgtcacgg ccgccatttt gtgacacaag atggccgact 3600 tccttcctct ttttcaaaaa aaagcggaag tgccgccgcg gcggcggggg gcggcgcgct 3660 gcgcgcgccg cccagtaggg ggagccatgc gccccccccc gcgcatgcgc ggggcccccc 3720 cccgcggggg gctccgcccc ccggcccccc ccg 3753 <210> 17 <211> 127 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 17 Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 1 5 10 15 Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 20 25 30 Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 35 40 45 Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 50 55 60 His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 65 70 75 80 Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 100 105 110 Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu 115 120 125 <210> 18 <211> 268 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 18 Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 1 5 10 15 Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 20 25 30 Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 35 40 45 Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 50 55 60 His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 65 70 75 80 Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 100 105 110 Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu Leu 115 120 125 Leu Lys Thr Pro Ala Ser Ser Pro Pro Met Lys Tyr Pro Val Pro Val 130 135 140 Thr Ser Leu Glu Glu Tyr Lys Ser Ser Thr Arg Gly Ser Trp Asp Arg 145 150 155 160 Thr Thr Arg Ser Gly His Gly Thr Cys Ala Asp Thr His Leu Ala Glu 165 170 175 Gln Val Leu Arg Glu Cys Gln Asn Asn Lys Lys Leu Leu Thr Leu Tyr 180 185 190 Ser Gln Ala Gln Lys Ser Leu Gly Ser Thr Ser Gln Asn Lys Lys Pro 195 200 205 Lys Lys Lys Ala His Ile His Ser Lys Glu Asn Arg Asp Arg Gly Arg 210 215 220 Pro Arg Lys Lys Ala Arg Gln Lys Pro Ser Arg Lys Arg Ala Lys Arg 225 230 235 240 Ser Pro Ser Asn Ser Ser Cys Ser Ser Ser Thr Lys Ser Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Asp Arg Glu Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser 260 265 <210> 19 <211> 276 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 19 Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 1 5 10 15 Met Trp Tyr Glu Ser Phe His Arg Gly His Ala Ser Phe Cys Gly Cys 20 25 30 Gly Asn Pro Ile Leu His Ile Thr Ala Leu Ala Glu Thr Tyr Gly His 35 40 45 Pro Thr Gly Pro Arg Pro Ser Gly Pro Pro Gly Val Asp Pro Asn Pro 50 55 60 His Ile Arg Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala Ala Pro Glu Pro Ser Gln 65 70 75 80 Val Asp Ser Arg Pro Ala Leu Thr Trp His Gly Asp Gly Gly Ser Asp 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Phe Ala 100 105 110 Asp Asp Gly Leu Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Glu Pro 115 120 125 Lys Lys Ala Ser Gly Arg His Pro Lys Thr Arg Asn Pro Arg Arg Lys 130 135 140 Leu Thr Phe Thr Pro Lys Arg Ile Glu Thr Val Gly Asp Arg Gly Arg 145 150 155 160 Lys Arg Asp Arg Ser Pro Leu Ala Arg Glu Pro Arg Gly Pro Leu Pro 165 170 175 Thr Ala Val Ala Ala Ala Val Pro Arg Ala Ala Gln Ala Gln Thr Gly 180 185 190 Asn Gln Ser Pro Leu Arg Ala Ala His Lys Asp Pro Thr Arg Gly Pro 195 200 205 Cys Lys Pro Met Pro Thr Val Gly Pro Arg Gln Trp Leu Phe Pro Glu 210 215 220 Arg Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ser Gly Asp Trp Ala Met Glu Phe 225 230 235 240 Leu Ala Ala Lys Ile Phe Asp Arg Pro Val Arg Ser Asn Leu Lys Asp 245 250 255 Thr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Val Lys Asn Gln Tyr Asn Val Tyr Phe Asp 260 265 270 Leu Lys Phe Glu 275 <210> 20 <211> 167 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 20 Met Ser Phe Trp Lys Pro Pro Val His Asn Val Thr Gly Ile Gln Arg 1 5 10 15 Met Trp Pro Lys Lys Ala Ser Gly Arg His Pro Lys Thr Arg Asn Pro 20 25 30 Arg Arg Lys Leu Thr Phe Thr Pro Lys Arg Ile Glu Thr Val Gly Asp 35 40 45 Arg Gly Arg Lys Arg Asp Arg Ser Pro Leu Ala Arg Glu Pro Arg Gly 50 55 60 Pro Leu Pro Thr Ala Val Ala Ala Ala Val Pro Arg Ala Ala Gln Ala 65 70 75 80 Gln Thr Gly Asn Gln Ser Pro Leu Arg Ala Ala His Lys Asp Pro Thr 85 90 95 Arg Gly Pro Cys Lys Pro Met Pro Thr Val Gly Pro Arg Gln Trp Leu 100 105 110 Phe Pro Glu Arg Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ser Ser Gly Asp Trp Ala 115 120 125 Met Glu Phe Leu Ala Ala Lys Ile Phe Asp Arg Pro Val Arg Ser Asn 130 135 140 Leu Lys Asp Thr Pro Tyr Tyr Pro Tyr Val Lys Asn Gln Tyr Asn Val 145 150 155 160 Tyr Phe Asp Leu Lys Phe Glu 165 <210> 21 <211> 743 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 21 Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 1 5 10 15 Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 20 25 30 Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 35 40 45 Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 50 55 60 Arg Gly Arg Lys Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val 65 70 75 80 Ile Lys Arg Cys Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly 85 90 95 Asn Gly Thr Phe Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile 100 105 110 Met Lys Gly Pro Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu 115 120 125 Tyr Ile Leu Phe Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg 130 135 140 Ser Asn Asp Asn Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys 145 150 155 160 Ile Tyr Arg His Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg 165 170 175 Thr Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ile Leu Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr 195 200 205 Arg Pro Lys Gly Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr 210 215 220 Leu Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr 225 230 235 240 Leu Phe Asn Ile Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys 245 250 255 Ser Pro Gln Thr Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser 260 265 270 Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Ile Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser 275 280 285 Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly 290 295 300 Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly 305 310 315 320 Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys 325 330 335 Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp 340 345 350 Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile 355 360 365 Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu 370 375 380 Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu 385 390 395 400 Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr Leu Asn Gln Gly Arg Ile Ser Pro 405 410 415 Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro Tyr Thr Asp 420 425 430 Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr Lys Glu Asn 435 440 445 Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr Asp Met Pro 450 455 460 Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys Lys Asp Thr 465 470 475 480 Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu Ile Cys Pro 485 490 495 Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp Tyr Gly Tyr 500 505 510 Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro Asp Gly Ser 515 520 525 Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro Thr Val Leu 530 535 540 His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly Pro Phe Ala 545 550 555 560 Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe 565 570 575 Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp 580 585 590 Pro Ser Phe Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro 595 600 605 Arg Arg Ile Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser 610 615 620 Phe Arg Ser Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile 625 630 635 640 Lys Arg Val Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly 645 650 655 Pro Lys Lys Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu 660 665 670 Ser Ser His Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu 675 680 685 Glu Ser Glu Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe 690 695 700 Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln 705 710 715 720 Gly Ile Lys Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val 725 730 735 His Val Asn Pro Cys Leu Arg 740 <210> 22 <211> 194 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 22 Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 1 5 10 15 Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 20 25 30 Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Ile Val Lys Asp Pro Ser Phe Gln Pro 35 40 45 Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro Arg Arg Ile Gln Val 50 55 60 Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser Phe Arg Ser Trp Asp 65 70 75 80 Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile Lys Arg Val Ser Glu 85 90 95 Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly Pro Lys Lys Pro Arg 100 105 110 Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu Ser Ser His Ser Leu 115 120 125 Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu Glu Ser Glu Thr Glu 130 135 140 Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe Gln Gln Gln Leu Gln 145 150 155 160 Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln Gly Ile Lys Val Leu 165 170 175 Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val His Val Asn Pro Cys 180 185 190 Leu Arg <210> 23 <211> 113 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 23 Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 1 5 10 15 Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 20 25 30 Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Ala Gln Lys Ser Leu Gly Ser Thr Ser 35 40 45 Gln Asn Lys Lys Pro Lys Lys Lys Ala His Ile His Ser Lys Glu Asn 50 55 60 Arg Asp Arg Gly Arg Pro Arg Lys Lys Ala Arg Gln Lys Pro Ser Arg 65 70 75 80 Lys Arg Ala Lys Arg Ser Pro Ser Asn Ser Ser Cys Ser Ser Ser Thr 85 90 95 Lys Ser Ser Ser Ser Ser Asp Arg Glu Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser 100 105 110 Ser <210> 24 <400> 24 000 <210> 25 <400> 25 000 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <400> 27 000 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <400> 38 000 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <400> 40 000 <210> 41 <400> 41 000 <210> 42 <400> 42 000 <210> 43 <400> 43 000 <210> 44 <400> 44 000 <210> 45 <400> 45 000 <210> 46 <400> 46 000 <210> 47 <400> 47 000 <210> 48 <400> 48 000 <210> 49 <400> 49 000 <210> 50 <400> 50 000 <210> 51 <400> 51 000 <210> 52 <400> 52 000 <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <211> 2979 <212> DNA <213> Betatorquevirus sp. <400> 54 taataaatat tcaacaggaa aaccacctaa tttaaattgc cgaccacaaa ccgtcactta 60 gttccccttt ttgcaacaac ttctgctttt ttccaactgc cggaaaacca cataatttgc 120 atggctaacc acaaactgat atgctaatta acttccacaa aacaacttcc ccttttaaaa 180 ccacacctac aaattaatta ttaaacacag tcacatcctg ggaggtacta ccacactata 240 ataccaagtg cacttccgaa tggctgagtt tatgccgcta gacggagaac gcatcagtta 300 ctgactgcgg actgaacttg ggcgggtgcc gaaggtgagt gaaaccaccg aagtcaaggg 360 gcaattcggg ctagttcagt ctagcggaac gggcaagaaa cttaaaatta ttttattttt 420 cagatgagcg actgctttaa accaacatgc tacaacaaca aaacaaagca aactcactgg 480 attaataacc tgcatttaac ccacgacctg atctgcttct gcccaacacc aactagacac 540 ttattactag ctttagcaga acaacaagaa acaattgaag tgtctaaaca agaaaaagaa 600 aaaataacaa gatgccttat tactacagaa gaagacggta caactacaga cgtcctagat 660 ggtatggacg aggttggatt agacgccctt ttcgcagaag atttcgaaga aaaagaaggg 720 taagacctac ttatactact attcctctaa agcaatggca accgccatat aaaagaacat 780 gctatataaa aggacaagac tgtttaatat actatagcaa cttaagactg ggaatgaata 840 gtacaatgta tgaaaaaagt attgtacctg tacattggcc gggagggggt tctttttctg 900 taagcatgtt aactttagat gccttgtatg atatacataa actttgtaga aactggtgga 960 catccacaaa ccaagactta ccactagtaa gatataaagg atgcaaaata acattttatc 1020 aaagcacatt tacagactac atagtaagaa tacatacaga actaccagct aacagtaaca 1080 aactaacata cccaaacaca catccactaa tgatgatgat gtctaagtac aaacacatta 1140 tacctagtag acaaacaaga agaaaaaaga aaccatacac aaaaatattt gtaaaaccac 1200 ctccgcaatt tgaaaacaaa tggtactttg ctacagacct ctacaaaatt ccattactac 1260 aaatacactg cacagcatgc aacttacaaa acccatttgt aaaaccagac aaattatcaa 1320 acaatgttac attatggtca ctaaacacca taagcataca aaatagaaac atgtcagtgg 1380 atcaaggaca atcatggcca tttaaaatac taggaacaca aagcttttat ttttactttt 1440 acaccggagc aaacctacca ggtgacacaa cacaaatacc agtagcagac ctattaccac 1500 taacaaaccc aagaataaac agaccaggac aatcactaaa tgaggcaaaa attacagacc 1560 atattacttt cacagaatac aaaaacaaat ttacaaatta ttggggtaac ccatttaata 1620 aacacattca agaacaccta gatatgatac tatactcact aaaaagtcca gaagcaataa 1680 aaaacgaatg gacaacagaa aacatgaaat ggaaccaatt aaacaatgca ggaacaatgg 1740 cattaacacc atttaacgag ccaatattca cacaaataca atataaccca gatagagaca 1800 caggagaaga cactcaatta tacctactct ctaacgctac aggaacagga tgggacccac 1860 caggaattcc agaattaata ctagaaggat ttccactatg gttaatatat tggggatttg 1920 cagactttca aaaaaaccta aaaaaagtaa caaacataga cacaaattac atgttagtag 1980 caaaaacaaa atttacacaa aaacctggca cattctactt agtaatacta aatgacacct 2040 ttgtagaagg caatagccca tatgaaaaac aacctttacc tgaagacaac attaaatggt 2100 acccacaagt acaataccaa ttagaagcac aaaacaaact actacaaact gggccattta 2160 caccaaacat acaaggacaa ctatcagaca atatatcaat gttttataaa ttttacttta 2220 aatggggagg aagcccacca aaagcaatta atgttgaaaa tcctgcccac cagattcaat 2280 atcccatacc ccgtaacgag catgaaacaa cttcgttaca gagtccaggg gaagccccag 2340 aatccatctt atactccttc gactatagac acgggaacta cacaacaaca gctttgtcac 2400 gaattagcca agactgggca cttaaagaca ctgtttctaa aattacagag ccagatcgac 2460 agcaactgct caaacaagcc ctcgaatgcc tgcaaatctc ggaagaaacg caggagaaaa 2520 aagaaaaaga agtacagcag ctcatcagca acctcagaca gcagcagcag ctgtacagag 2580 agcgaataat atcattatta aaggaccaat aacttttaac tgtgtaaaaa aggtgaaatt 2640 gtttgatgat aaaccaaaaa accgtagatt tacacctgag gaatttgaaa ctgagttaca 2700 aatagcaaaa tggttaaaga gacccccaag atcctttgta aatgatcctc ccttttaccc 2760 atggttacca cctgaacctg ttgtaaactt taagcttaat tttactgaat aaaggccagc 2820 attaattcac ttaaggagtc tgtttattta agttaaacct taataaacgg tcaccgcctc 2880 cctaatacgc aggcgcagaa agggggctcc gcccccttta acccccaggg ggctccgccc 2940 cctgaaaccc ccaagggggc tacgccccct tacaccccc 2979 <210> 55 <211> 99 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 55 Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 1 5 10 15 Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 20 25 30 Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 35 40 45 Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 50 55 60 Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 65 70 75 80 Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Gly <210> 56 <211> 203 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 56 Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 1 5 10 15 Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 20 25 30 Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 35 40 45 Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 50 55 60 Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 65 70 75 80 Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Gly Phe Asn Ile Pro Tyr Pro Val Thr Ser Met Lys Gln Leu 100 105 110 Arg Tyr Arg Val Gln Gly Lys Pro Gln Asn Pro Ser Tyr Thr Pro Ser 115 120 125 Thr Ile Asp Thr Gly Thr Thr Gln Gln Gln Leu Cys His Glu Leu Ala 130 135 140 Lys Thr Gly His Leu Lys Thr Leu Phe Leu Lys Leu Gln Ser Gln Ile 145 150 155 160 Asp Ser Asn Cys Ser Asn Lys Pro Ser Asn Ala Cys Lys Ser Arg Lys 165 170 175 Lys Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Ser Ala Thr 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Ser Ser Cys Thr Glu Ser Glu 195 200 <210> 57 <211> 219 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 57 Met Ser Asp Cys Phe Lys Pro Thr Cys Tyr Asn Asn Lys Thr Lys Gln 1 5 10 15 Thr His Trp Ile Asn Asn Leu His Leu Thr His Asp Leu Ile Cys Phe 20 25 30 Cys Pro Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Gln Gln 35 40 45 Glu Thr Ile Glu Val Ser Lys Gln Glu Lys Glu Lys Ile Thr Arg Cys 50 55 60 Leu Ile Thr Thr Glu Glu Asp Gly Thr Thr Thr Asp Val Leu Asp Gly 65 70 75 80 Met Asp Glu Val Gly Leu Asp Ala Leu Phe Ala Glu Asp Phe Glu Glu 85 90 95 Lys Glu Gly Ala Arg Ser Thr Ala Thr Ala Gln Thr Ser Pro Arg Met 100 105 110 Pro Ala Asn Leu Gly Arg Asn Ala Gly Glu Lys Arg Lys Arg Ser Thr 115 120 125 Ala Ala His Gln Gln Pro Gln Thr Ala Ala Ala Ala Val Gln Arg Ala 130 135 140 Asn Asn Ile Ile Ile Lys Gly Pro Ile Thr Phe Asn Cys Val Lys Lys 145 150 155 160 Val Lys Leu Phe Asp Asp Lys Pro Lys Asn Arg Arg Phe Thr Pro Glu 165 170 175 Glu Phe Glu Thr Glu Leu Gln Ile Ala Lys Trp Leu Lys Arg Pro Pro 180 185 190 Arg Ser Phe Val Asn Asp Pro Pro Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Pro Glu 195 200 205 Pro Val Val Asn Phe Lys Leu Asn Phe Thr Glu 210 215 <210> 58 <211> 666 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 58 Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 1 5 10 15 Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln 35 40 45 Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys 50 55 60 Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr 65 70 75 80 Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser 85 90 95 Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys 100 105 110 Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr 115 120 125 Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 130 135 140 Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr 145 150 155 160 Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile 165 170 175 Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile 180 185 190 Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr 195 200 205 Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn 210 215 220 Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr 225 230 235 240 Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val 245 250 255 Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe 260 265 270 Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln 275 280 285 Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg 290 295 300 Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe 305 310 315 320 Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn 325 330 335 Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser 340 345 350 Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn 355 360 365 Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro 370 375 380 Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp 385 390 395 400 Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro 405 410 415 Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile 420 425 430 Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn 435 440 445 Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys 450 455 460 Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly 465 470 475 480 Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp 485 490 495 Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln 500 505 510 Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile 515 520 525 Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys 530 535 540 Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro 545 550 555 560 Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro 565 570 575 Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr 580 585 590 Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val 595 600 605 Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu 610 615 620 Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu 625 630 635 640 Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg 645 650 655 Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 660 665 <210> 59 <211> 148 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 59 Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 1 5 10 15 Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Ile Gln Tyr Pro Ile Pro Arg Asn Glu His Glu Thr 35 40 45 Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser 50 55 60 Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile 65 70 75 80 Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro 85 90 95 Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser 100 105 110 Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser 115 120 125 Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu 130 135 140 Leu Lys Asp Gln 145 <210> 60 <211> 82 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 60 Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 1 5 10 15 Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Ser Gln Ile Asp Ser Asn Cys Ser Asn Lys Pro Ser 35 40 45 Asn Ala Cys Lys Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Lys 50 55 60 Tyr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ser Asp Ser Ser Ser Ser Cys Thr Glu 65 70 75 80 Ser Glu <210> 61 <400> 61 000 <210> 62 <400> 62 000 <210> 63 <400> 63 000 <210> 64 <400> 64 000 <210> 65 <400> 65 000 <210> 66 <400> 66 000 <210> 67 <400> 67 000 <210> 68 <400> 68 000 <210> 69 <400> 69 000 <210> 70 <400> 70 000 <210> 71 <400> 71 000 <210> 72 <400> 72 000 <210> 73 <400> 73 000 <210> 74 <400> 74 000 <210> 75 <400> 75 000 <210> 76 <400> 76 000 <210> 77 <400> 77 000 <210> 78 <400> 78 000 <210> 79 <400> 79 000 <210> 80 <400> 80 000 <210> 81 <400> 81 000 <210> 82 <400> 82 000 <210> 83 <400> 83 000 <210> 84 <400> 84 000 <210> 85 <400> 85 000 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <400> 87 000 <210> 88 <400> 88 000 <210> 89 <400> 89 000 <210> 90 <400> 90 000 <210> 91 <400> 91 000 <210> 92 <400> 92 000 <210> 93 <400> 93 000 <210> 94 <400> 94 000 <210> 95 <400> 95 000 <210> 96 <400> 96 000 <210> 97 <400> 97 000 <210> 98 <400> 98 000 <210> 99 <400> 99 000 <210> 100 <400> 100 000 <210> 101 <400> 101 000 <210> 102 <400> 102 000 <210> 103 <400> 103 000 <210> 104 <400> 104 000 <210> 105 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 cgggtgccgk aggtgagttt acacaccgma gtcaaggggc aattcgggct crggactggc 60 cgggcyhtgg g 71 <210> 106 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctwtgg g 71 <210> 107 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 cgggtgccgt aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctatgg g 71 <210> 108 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggccctgg g 71 <210> 109 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctttgg g 71 <210> 110 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctatgg g 71 <210> 111 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgaa gtcaaggggc aattcgggct caggactggc 60 cgggctttgg g 71 <210> 112 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggcyhtgg g 71 <210> 113 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 cgggtgccgt aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctatgg g 71 <210> 114 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggcccggg 70 <210> 115 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgaa gtcaaggggc aattcgggct caggactggc 60 cgggctttgg g 71 <210> 116 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggaggccg 60 ggccatggg 69 <210> 117 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggccccgg g 71 <210> 118 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 cgggtgccgg aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctatgg g 71 <210> 119 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 cgggtgccga aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 60 cgggctatgg g 71 <210> 120 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> May or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> May or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (30)..(32) <223> May or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> May or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (43)..(46) <223> May or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (52)..(54) <223> May or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (70)..(71) <223> May or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (89)..(90) <223> May or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> May or may not be present <400> 120 cggcggsggs gcsscgcgct dcgcgcgcsg cccrsyrggg grdssmmwgc skcscccccc 60 cscgcgcatg cgcrcgggkc ccccccccyv sggggggctc cgcccccccg gcccccc 117 <210> 121 <211> 169 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (40)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (53)..(56) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (62)..(62) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (64)..(64) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (97)..(98) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 121 gccgccgcgg cggcggsggn gnsgcgcgct dcgcgcgcsn nncrccrggg ggnnnncwgc 60 sncncccccc cccgcgcatg cgcgggkccc ccccccnncg gggggctccg ccccccggcc 120 cccccccgtg ctaaacccac cgcgcatgcg cgaccacgcc cccgccgcc 169 <210> 122 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (40)..(42) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (53)..(56) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (62)..(62) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (64)..(64) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 122 gccgccgcgg cggcggsggn gnsgcgcgct dcgcgcgcsn nncrccrggg ggnnnncwgc 60 sncncccccc cccgcgcat 79 <210> 123 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (18)..(19) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 123 gcgcgggkcc cccccccnnc ggggggctcc g 31 <210> 124 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 ccccccggcc cccccccgtg ctaaacccac cgcgcatgcg cgaccacgcc cccgccgcc 59 <210> 125 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 125 gcggcggggg ggcggccgcg ttcgcgcgcc gcccaccagg gggtgctgcg cgcccccccc 60 cgcgcatgcg cggggccccc ccccgggggg gctccgcccc cccggccccc ccccgtgcta 120 aacccaccgc gcatgcgcga ccacgccccc gccgcc 156 <210> 126 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gcggcgg 7 <210> 127 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gggggcg 7 <210> 128 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gccgcg 6 <210> 129 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 ttcgcgcgcc gcccaccagg gggtg 25 <210> 130 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 ctgcg 5 <210> 131 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 cgcccccccc cgcgcat 17 <210> 132 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 gcgcggggcc ccccccc 17 <210> 133 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gggggggctc cgcccccccg gccccccccc gtgctaaacc caccgcgcat gcgcgaccac 60 gcccccgccg cc 72 <210> 134 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 134 cggcggcggc ggcgcgcgcg ctgcgcgcgc gcgccggggg ggcgccagcg cccccccccc 60 cgcgcatgca cgggtccccc cccccacggg gggctccgcc ccccggcccc ccccc 115 <210> 135 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 cggcggcggc ggcg 14 <210> 136 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 cgcgcgctgc gcgcgcg 17 <210> 137 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 cgccgggggg gcgccagcg 19 <210> 138 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 cccccccccc cgcgcat 17 <210> 139 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 gcacgggtcc ccccccccac ggggggctcc g 31 <210> 140 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 ccccccggcc ccccccc 17 <210> 141 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 141 ccgtcggcgg gggggccgcg cgctgcgcgc gcggcccccg ggggaggcac agcctccccc 60 ccccgcgcgc atgcgcgcgg gtcccccccc ctccgggggg ctccgccccc cggccccccc 120 c 121 <210> 142 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 ccgtcggcgg gggggccgcg cgctgcgcgc gcggccc 37 <210> 143 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 ccgggggagg cacagcctcc cccccccgcg cgcatgcgcg cgggtccccc cccctccggg 60 gggctccgcc ccccggcccc cccc 84 <210> 144 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 144 cggcggcggc gcgcgcgcta cgcgcgcgcg ccggggggct gccgcccccc ccccgcgcat 60 gcgcggggcc cccccccgcg gggggctccg ccccccggcc cccc 104 <210> 145 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 cggcggcggc g 11 <210> 146 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 cgcgcgctac gcgcgcg 17 <210> 147 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 cgccgggggg 10 <210> 148 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 ctgccgc 7 <210> 149 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 cccccccccg cgcat 15 <210> 150 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 gcgcggggcc ccccccc 17 <210> 151 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 gcggggggct ccg 13 <210> 152 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ccccccggcc cccc 14 <210> 153 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 153 gccgccgcgg cggcgggggg cggcgcgctg cgcgcgccgc ccagtagggg gagccatgcg 60 cccccccccg cgcatgcgcg gggccccccc ccgcgggggg ctccgccccc cggccccccc 120 cg 122 <210> 154 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 gccgccgcgg cggcggggg 19 <210> 155 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 gcggcgcgct gcgcgcgccg cccagtaggg ggagccatgc g 41 <210> 156 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 cccccccccg cgcat 15 <210> 157 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 gcgcggggcc ccccccc 17 <210> 158 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 gcggggggct ccg 13 <210> 159 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 ccccccggcc ccccccg 17 <210> 160 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 cgcgctgcgc gcgccgccca gtagggggag ccatgc 36 <210> 161 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 ccgccatctt aagtagttga ggcggacggt ggcgtgagtt caaaggtcac catcagccac 60 acctactcaa aatggtgg 78 <210> 162 <211> 172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 162 cttaagtagt tgaggcggac ggtggcgtga gttcaaaggt caccatcagc cacacctact 60 caaaatggtg gacaatttct tccgggtcaa aggttacagc cgccatgtta aaacacgtga 120 cgtatgacgt cacggccgcc attttgtgac acaagatggc cgacttcctt cc 172 <210> 163 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 cgcgctgcgc gcgccgccca gtagggggag ccatgc 36 <210> 164 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 gcgctdcgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc 36 <210> 165 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 gcgcttcgcg cgccgcccac tagggggcgt tgcgcg 36 <210> 166 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 gcgctgcgcg cgccgcccag tagggggcgc aatgcg 36 <210> 167 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 gcgctgcgcg cgcggccccc gggggaggca ttgcct 36 <210> 168 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 gcgctgcgcg cgcgcgccgg gggggcgcca gcgccc 36 <210> 169 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 gcgcttcgcg cgcgcgccgg ggggctccgc cccccc 36 <210> 170 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 gcgcttcgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc 36 <210> 171 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 gcgctacgcg cgcgcgccgg ggggctgcgc cccccc 36 <210> 172 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 gcgctacgcg cgcgcgccgg ggggctctgc cccccc 36 <210> 173 <400> 173 000 <210> 174 <400> 174 000 <210> 175 <400> 175 000 <210> 176 <400> 176 000 <210> 177 <400> 177 000 <210> 178 <400> 178 000 <210> 179 <400> 179 000 <210> 180 <400> 180 000 <210> 181 <400> 181 000 <210> 182 <400> 182 000 <210> 183 <400> 183 000 <210> 184 <400> 184 000 <210> 185 <211> 743 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 185 Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 1 5 10 15 Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 20 25 30 Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 35 40 45 Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 50 55 60 Arg Gly Arg Lys Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val 65 70 75 80 Ile Lys Arg Cys Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly 85 90 95 Asn Gly Thr Phe Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile 100 105 110 Met Lys Gly Pro Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu 115 120 125 Tyr Ile Leu Phe Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg 130 135 140 Ser Asn Asp Asn Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys 145 150 155 160 Ile Tyr Arg His Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg 165 170 175 Thr Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ile Leu Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr 195 200 205 Arg Pro Lys Gly Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr 210 215 220 Leu Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr 225 230 235 240 Leu Phe Asn Ile Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys 245 250 255 Ser Pro Gln Thr Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser 260 265 270 Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Ile Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser 275 280 285 Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly 290 295 300 Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly 305 310 315 320 Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys 325 330 335 Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp 340 345 350 Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile 355 360 365 Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu 370 375 380 Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu 385 390 395 400 Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr Leu Asn Gln Gly Arg Ile Ser Pro 405 410 415 Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro Tyr Thr Asp 420 425 430 Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr Lys Glu Asn 435 440 445 Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr Asp Met Pro 450 455 460 Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys Lys Asp Thr 465 470 475 480 Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu Ile Cys Pro 485 490 495 Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp Tyr Gly Tyr 500 505 510 Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro Asp Gly Ser 515 520 525 Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro Thr Val Leu 530 535 540 His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly Pro Phe Ala 545 550 555 560 Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe 565 570 575 Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp 580 585 590 Pro Ser Phe Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro 595 600 605 Arg Arg Ile Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser 610 615 620 Phe Arg Ser Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile 625 630 635 640 Lys Arg Val Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly 645 650 655 Pro Lys Lys Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu 660 665 670 Ser Ser His Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu 675 680 685 Glu Ser Glu Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe 690 695 700 Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln 705 710 715 720 Gly Ile Lys Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val 725 730 735 His Val Asn Pro Cys Leu Arg 740 <210> 186 <211> 68 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 186 Met Ala Trp Gly Trp Trp Lys Arg Arg Arg Arg Trp Trp Phe Arg Lys 1 5 10 15 Arg Trp Thr Arg Gly Arg Leu Arg Arg Arg Trp Pro Arg Ser Ala Arg 20 25 30 Arg Arg Pro Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Arg 35 40 45 Gly Arg Arg Lys Thr Arg Thr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg 50 55 60 Arg Gly Arg Lys 65 <210> 187 <211> 212 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 187 Ala Lys Leu Ile Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val Ile Lys Arg Cys 1 5 10 15 Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly Asn Gly Thr Phe 20 25 30 Ala Thr Asn Phe Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile Met Lys Gly Pro 35 40 45 Phe Gly Gly Gly His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu Tyr Ile Leu Phe 50 55 60 Glu Glu His Leu Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg Ser Asn Asp Asn 65 70 75 80 Leu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys Ile Tyr Arg His 85 90 95 Pro Asp Gln Asp Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg Thr Pro Leu Gly 100 105 110 Gly Asn Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly Asn Ala Ile Leu 115 120 125 Ala Lys His Lys Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr Arg Pro Lys Gly 130 135 140 Arg Lys Ala Ile Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr Leu Phe Thr Asp 145 150 155 160 Lys Trp Tyr Phe Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr Leu Phe Asn Ile 165 170 175 Met Ala Val Glu Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys Ser Pro Gln Thr 180 185 190 Asp Asn Thr Cys Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser Val Tyr Asn Asn 195 200 205 Tyr Leu Ser Ile 210 <210> 188 <211> 133 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 188 Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser Asp Ser Lys Leu Lys Glu Phe Leu 1 5 10 15 Asn Lys Ala Phe Pro Thr Thr Gly Thr Lys Gly Thr Ser Leu Asn Ala 20 25 30 Leu Asn Thr Phe Arg Thr Glu Gly Cys Ile Ser His Pro Gln Leu Lys 35 40 45 Lys Pro Asn Pro Gln Ile Asn Lys Pro Leu Glu Ser Gln Tyr Phe Ala 50 55 60 Pro Leu Asp Ala Leu Trp Gly Asp Pro Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Asn 65 70 75 80 Glu Asn Lys Ser Leu Asn Asp Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ile Lys Asn 85 90 95 Met Ile Thr Tyr His Ala Lys Leu Arg Glu Phe Pro Asn Ser Tyr Gln 100 105 110 Gly Asn Lys Ala Phe Cys His Leu Thr Gly Ile Tyr Ser Pro Pro Tyr 115 120 125 Leu Asn Gln Gly Arg 130 <210> 189 <211> 166 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 189 Ile Ser Pro Glu Ile Phe Gly Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Asn Pro 1 5 10 15 Tyr Thr Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Trp Met Asp Pro Leu Thr 20 25 30 Lys Glu Asn Asn Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Ser Lys Cys Leu Leu Thr 35 40 45 Asp Met Pro Leu Trp Thr Leu Leu Phe Gly Tyr Thr Asp Trp Cys Lys 50 55 60 Lys Asp Thr Asn Asn Trp Asp Leu Pro Leu Asn Tyr Arg Leu Val Leu 65 70 75 80 Ile Cys Pro Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Glu Lys Val Lys Asp 85 90 95 Tyr Gly Tyr Ile Pro Tyr Ser Tyr Lys Phe Gly Ala Gly Gln Met Pro 100 105 110 Asp Gly Ser Asn Tyr Ile Pro Phe Gln Phe Arg Ala Lys Trp Tyr Pro 115 120 125 Thr Val Leu His Gln Gln Gln Val Met Glu Asp Ile Ser Arg Ser Gly 130 135 140 Pro Phe Ala Pro Lys Val Glu Lys Pro Ser Thr Gln Leu Val Met Lys 145 150 155 160 Tyr Cys Phe Asn Phe Asn 165 <210> 190 <211> 164 <212> PRT <213> Alphatorquevirus sp. <400> 190 Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ile Glu Gln Ile Val Lys Asp Pro Ser Phe 1 5 10 15 Gln Pro Thr Tyr Glu Ile Pro Gly Thr Gly Asn Ile Pro Arg Arg Ile 20 25 30 Gln Val Ile Asp Pro Arg Val Leu Gly Pro His Tyr Ser Phe Arg Ser 35 40 45 Trp Asp Met Arg Arg His Thr Phe Ser Arg Ala Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 Ser Glu Gln Gln Glu Thr Ser Asp Leu Val Phe Ser Gly Pro Lys Lys 65 70 75 80 Pro Arg Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Thr Gln Glu Glu Ser Ser His 85 90 95 Ser Leu Gln Arg Glu Ser Arg Pro Trp Glu Thr Glu Glu Glu Ser Glu 100 105 110 Thr Glu Ala Leu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Val Pro Phe Gln Gln Gln 115 120 125 Leu Gln Gln Gln Tyr Gln Glu Gln Leu Lys Leu Arg Gln Gly Ile Lys 130 135 140 Val Leu Phe Glu Gln Leu Ile Arg Thr Gln Gln Gly Val His Val Asn 145 150 155 160 Pro Cys Leu Arg <210> 191 <400> 191 000 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <400> 193 000 <210> 194 <400> 194 000 <210> 195 <400> 195 000 <210> 196 <400> 196 000 <210> 197 <400> 197 000 <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <400> 199 000 <210> 200 <400> 200 000 <210> 201 <400> 201 000 <210> 202 <400> 202 000 <210> 203 <400> 203 000 <210> 204 <400> 204 000 <210> 205 <400> 205 000 <210> 206 <400> 206 000 <210> 207 <400> 207 000 <210> 208 <400> 208 000 <210> 209 <400> 209 000 <210> 210 <400> 210 000 <210> 211 <400> 211 000 <210> 212 <400> 212 000 <210> 213 <400> 213 000 <210> 214 <400> 214 000 <210> 215 <211> 666 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 215 Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 1 5 10 15 Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln 35 40 45 Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys 50 55 60 Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr 65 70 75 80 Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser 85 90 95 Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys 100 105 110 Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr 115 120 125 Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 130 135 140 Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr 145 150 155 160 Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile 165 170 175 Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile 180 185 190 Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr 195 200 205 Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn 210 215 220 Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr 225 230 235 240 Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val 245 250 255 Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe 260 265 270 Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln 275 280 285 Ile Pro Val Ala Asp Leu Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg 290 295 300 Pro Gly Gln Ser Leu Asn Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe 305 310 315 320 Thr Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn 325 330 335 Lys His Ile Gln Glu His Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser 340 345 350 Pro Glu Ala Ile Lys Asn Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn 355 360 365 Gln Leu Asn Asn Ala Gly Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro 370 375 380 Ile Phe Thr Gln Ile Gln Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp 385 390 395 400 Thr Gln Leu Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro 405 410 415 Pro Gly Ile Pro Glu Leu Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile 420 425 430 Tyr Trp Gly Phe Ala Asp Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn 435 440 445 Ile Asp Thr Asn Tyr Met Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys 450 455 460 Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly 465 470 475 480 Asn Ser Pro Tyr Glu Lys Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp 485 490 495 Tyr Pro Gln Val Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln 500 505 510 Thr Gly Pro Phe Thr Pro Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile 515 520 525 Ser Met Phe Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys 530 535 540 Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro 545 550 555 560 Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro 565 570 575 Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr 580 585 590 Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val 595 600 605 Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu 610 615 620 Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu 625 630 635 640 Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg 645 650 655 Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp Gln 660 665 <210> 216 <211> 38 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 216 Met Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Asn Tyr Arg Arg Pro Arg 1 5 10 15 Trp Tyr Gly Arg Gly Trp Ile Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Phe Arg 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Val Arg 35 <210> 217 <211> 208 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 217 Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro 35 40 45 Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Ser Val Ser Met Leu Thr Leu 50 55 60 Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser 65 70 75 80 Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr 85 90 95 Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr Ile Val Arg Ile His Thr Glu 100 105 110 Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu 115 120 125 Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr 130 135 140 Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro 145 150 155 160 Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro 165 170 175 Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val 180 185 190 Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr 195 200 205 <210> 218 <211> 128 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 218 Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp 1 5 10 15 Pro Phe Lys Ile Leu Gly Thr Gln Ser Phe Tyr Phe Tyr Phe Tyr Thr 20 25 30 Gly Ala Asn Leu Pro Gly Asp Thr Thr Gln Ile Pro Val Ala Asp Leu 35 40 45 Leu Pro Leu Thr Asn Pro Arg Ile Asn Arg Pro Gly Gln Ser Leu Asn 50 55 60 Glu Ala Lys Ile Thr Asp His Ile Thr Phe Thr Glu Tyr Lys Asn Lys 65 70 75 80 Phe Thr Asn Tyr Trp Gly Asn Pro Phe Asn Lys His Ile Gln Glu His 85 90 95 Leu Asp Met Ile Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Pro Glu Ala Ile Lys Asn 100 105 110 Glu Trp Thr Thr Glu Asn Met Lys Trp Asn Gln Leu Asn Asn Ala Gly 115 120 125 <210> 219 <211> 163 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 219 Thr Met Ala Leu Thr Pro Phe Asn Glu Pro Ile Phe Thr Gln Ile Gln 1 5 10 15 Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Thr Gly Glu Asp Thr Gln Leu Tyr Leu Leu 20 25 30 Ser Asn Ala Thr Gly Thr Gly Trp Asp Pro Pro Gly Ile Pro Glu Leu 35 40 45 Ile Leu Glu Gly Phe Pro Leu Trp Leu Ile Tyr Trp Gly Phe Ala Asp 50 55 60 Phe Gln Lys Asn Leu Lys Lys Val Thr Asn Ile Asp Thr Asn Tyr Met 65 70 75 80 Leu Val Ala Lys Thr Lys Phe Thr Gln Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Leu 85 90 95 Val Ile Leu Asn Asp Thr Phe Val Glu Gly Asn Ser Pro Tyr Glu Lys 100 105 110 Gln Pro Leu Pro Glu Asp Asn Ile Lys Trp Tyr Pro Gln Val Gln Tyr 115 120 125 Gln Leu Glu Ala Gln Asn Lys Leu Leu Gln Thr Gly Pro Phe Thr Pro 130 135 140 Asn Ile Gln Gly Gln Leu Ser Asp Asn Ile Ser Met Phe Tyr Lys Phe 145 150 155 160 Tyr Phe Lys <210> 220 <211> 129 <212> PRT <213> Betatorquevirus sp. <400> 220 Trp Gly Gly Ser Pro Pro Lys Ala Ile Asn Val Glu Asn Pro Ala His 1 5 10 15 Gln Ile Gln Tyr Pro Ile Pro Arg Asn Glu His Glu Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Gln Ser Pro Gly Glu Ala Pro Glu Ser Ile Leu Tyr Ser Phe Asp Tyr 35 40 45 Arg His Gly Asn Tyr Thr Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ile Ser Gln Asp 50 55 60 Trp Ala Leu Lys Asp Thr Val Ser Lys Ile Thr Glu Pro Asp Arg Gln 65 70 75 80 Gln Leu Leu Lys Gln Ala Leu Glu Cys Leu Gln Ile Ser Glu Glu Thr 85 90 95 Gln Glu Lys Lys Glu Lys Glu Val Gln Gln Leu Ile Ser Asn Leu Arg 100 105 110 Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Arg Glu Arg Ile Ile Ser Leu Leu Lys Asp 115 120 125 Gln <210> 221 <400> 221 000 <210> 222 <400> 222 000 <210> 223 <400> 223 000 <210> 224 <400> 224 000 <210> 225 <400> 225 000 <210> 226 <400> 226 000 <210> 227 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(31) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (29)..(31) <223> This region may encompass 0-3 residues <220> <221> MOD_RES <222> (100)..(100) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (125)..(129) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (125)..(129) <223> This region may encompass 1-5 residues <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(181) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (211)..(211) <223> Any amino acid <400> 227 Leu Val Leu Thr Gln Trp Gln Pro Asn Thr Val Arg Arg Cys Tyr Ile 1 5 10 15 Arg Gly Tyr Leu Pro Leu Ile Ile Cys Gly Glu Asn Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Thr Ser Arg Asn Tyr Ala Thr His Ser Asp Asp Thr Ile Gln Lys Gly 35 40 45 Pro Phe Gly Gly Gly Met Ser Thr Thr Thr Phe Ser Leu Arg Val Leu 50 55 60 Tyr Asp Glu Tyr Gln Arg Phe Met Asn Arg Trp Thr Tyr Ser Asn Glu 65 70 75 80 Asp Leu Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Gly Cys Lys Phe Thr Phe Tyr Arg 85 90 95 His Pro Asp Xaa Asp Phe Ile Val Gln Tyr Asn Thr Asn Pro Pro Phe 100 105 110 Lys Asp Thr Lys Leu Thr Ala Pro Ser Ile His Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Gly Met Leu Met Leu Ser Lys Arg Lys Ile Leu Ile Pro Ser Leu 130 135 140 Lys Thr Arg Pro Lys Gly Lys His Tyr Val Lys Val Arg Ile Gly Pro 145 150 155 160 Pro Lys Leu Phe Glu Asp Lys Trp Tyr Thr Gln Ser Asp Leu Cys Asp 165 170 175 Val Pro Leu Val Xaa Leu Tyr Ala Thr Ala Ala Asp Leu Gln His Pro 180 185 190 Phe Gly Ser Pro Gln Thr Asp Asn Pro Cys Val Thr Phe Gln Val Leu 195 200 205 Gly Ser Xaa Tyr Asn Lys His Leu Ser Ile Ser Pro 210 215 220 <210> 228 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (44)..(46) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (44)..(46) <223> This region may encompass 0-3 residues <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (98)..(101) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (98)..(101) <223> This region may encompass 0-4 residues <400> 228 Ser Asn Phe Glu Phe Pro Gly Ala Tyr Thr Asp Ile Thr Tyr Asn Pro 1 5 10 15 Leu Thr Asp Lys Gly Val Gly Asn Met Val Trp Ile Gln Tyr Leu Thr 20 25 30 Lys Pro Asp Thr Ile Xaa Asp Lys Thr Gln Ser Xaa Xaa Xaa Lys Cys 35 40 45 Leu Ile Glu Asp Leu Pro Leu Trp Ala Ala Leu Tyr Gly Tyr Val Asp 50 55 60 Phe Cys Glu Lys Glu Thr Gly Asp Ser Ala Ile Ile Xaa Asn Xaa Gly 65 70 75 80 Arg Val Leu Ile Arg Cys Pro Tyr Thr Lys Pro Pro Leu Tyr Asp Lys 85 90 95 Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Lys Gly Phe Val Pro Tyr Ser Thr Asn Phe 100 105 110 Gly Asn Gly Lys Met Pro Gly Gly Ser Gly Tyr Val Pro Ile Tyr Trp 115 120 125 Arg Ala Arg Trp Tyr Pro Thr Leu Phe His Gln Lys Glu Val Leu Glu 130 135 140 Asp Ile Val Gln Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Lys Asp Glu Lys Pro Ser 145 150 155 160 Thr Gln Leu Val Met Lys Tyr Cys Phe Asn Phe Asn 165 170 <210> 229 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(22) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (20)..(22) <223> This region may encompass 0-3 residues <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (89)..(89) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(91) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (95)..(98) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (95)..(98) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> MOD_RES <222> (107)..(120) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (107)..(120) <223> This region may encompass 2-14 residues <220> <221> MOD_RES <222> (129)..(129) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (139)..(168) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (139)..(168) <223> This region may encompass 0-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (201)..(204) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (201)..(204) <223> This region may encompass 0-4 residues <220> <221> MOD_RES <222> (219)..(258) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (219)..(258) <223> This region may encompass 0-40 residues <400> 229 Trp Gly Gly Asn Pro Ile Ser Gln Gln Val Val Arg Asn Pro Cys Lys 1 5 10 15 Asp Ser Gly Xaa Xaa Xaa Ser Gly Xaa Gly Arg Gln Pro Arg Ser Val 20 25 30 Gln Val Val Asp Pro Lys Tyr Met Gly Pro Glu Tyr Thr Phe His Ser 35 40 45 Trp Asp Trp Arg Arg Gly Leu Phe Gly Glu Lys Ala Ile Lys Arg Met 50 55 60 Ser Glu Gln Pro Thr Asp Asp Glu Ile Phe Thr Gly Gly Xaa Pro Lys 65 70 75 80 Arg Pro Arg Arg Asp Pro Pro Thr Xaa Gln Xaa Pro Glu Glu Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Gln Lys Glu Ser Ser Ser Phe Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Trp Glu Ser Ser Ser Gln Glu 115 120 125 Xaa Glu Ser Glu Ser Gln Glu Glu Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gln Thr Val Gln Gln Gln Leu 165 170 175 Arg Gln Gln Leu Arg Glu Gln Arg Arg Leu Arg Val Gln Leu Gln Leu 180 185 190 Leu Phe Gln Gln Leu Leu Lys Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Ala Gly Leu 195 200 205 His Ile Asn Pro Leu Leu Leu Ser Gln Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 250 255 Xaa Xaa <210> 230 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (136)..(136) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (138)..(141) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (138)..(141) <223> This region may encompass 1-4 residues <220> <221> MOD_RES <222> (179)..(179) <223> Any amino acid <400> 230 Leu Lys Gln Trp Gln Pro Ser Thr Ile Arg Lys Cys Lys Ile Lys Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Pro Leu Phe Gln Cys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Asn Asn Tyr 20 25 30 Thr Gln Tyr Lys Glu Ser Ile Val Pro His His Glu Pro Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Trp Ser Ile Gln Gln Phe Thr Leu Gly Ala Leu Tyr Glu Glu His 50 55 60 Leu Lys Leu Arg Asn Trp Trp Thr Lys Ser Asn Asp Gly Leu Pro Leu 65 70 75 80 Val Arg Tyr Leu Gly Cys Thr Ile Lys Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Thr 85 90 95 Asp Tyr Ile Val Thr Tyr Gln Arg Cys Tyr Pro Met Thr Ala Thr Lys 100 105 110 Leu Thr Tyr Leu Ser Thr Gln Pro Ser Arg Met Leu Met Asn Lys His 115 120 125 Lys Ile Ile Val Pro Ser Lys Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Lys Lys 130 135 140 Lys Lys Pro Tyr Lys Lys Ile Phe Ile Lys Pro Pro Ser Gln Met Gln 145 150 155 160 Asn Lys Trp Tyr Phe Gln Gln Asp Ile Ala Asn Thr Pro Leu Leu Gln 165 170 175 Leu Thr Xaa Thr Ala Cys Ser Leu Asp Arg Met Tyr Leu Ser Ser Asp 180 185 190 Ser Ile Ser Asn Asn Ile Thr Phe Thr Ser Leu Asn Thr Asn Phe Phe 195 200 205 Gln Asn Pro Asn Phe Gln 210 <210> 231 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(10) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> This region may encompass 4-10 residues <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(45) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (38)..(45) <223> This region may encompass 1-8 residues <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (100)..(102) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (100)..(102) <223> This region may encompass 1-3 residues <220> <221> MOD_RES <222> (112)..(112) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(115) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (114)..(115) <223> This region may encompass 0-2 residues <220> <221> MOD_RES <222> (124)..(139) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (124)..(139) <223> This region may encompass 3-16 residues <220> <221> MOD_RES <222> (154)..(154) <223> Any amino acid <400> 231 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Leu Tyr Phe Glu 1 5 10 15 Cys Arg Tyr Asn Pro Phe Lys Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Val Tyr 20 25 30 Leu Val Ser Asn Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Gly Trp 35 40 45 Asp Pro Pro Thr Asp Pro Asp Leu Ile Ile Glu Gly Phe Pro Leu Trp 50 55 60 Leu Leu Leu Trp Gly Trp Leu Asp Trp Gln Lys Lys Leu Gly Lys Ile 65 70 75 80 Gln Asn Ile Asp Thr Asp Tyr Ile Leu Val Ile Gln Ser Xaa Tyr Tyr 85 90 95 Ile Pro Pro Xaa Xaa Xaa Lys Leu Pro Tyr Tyr Val Pro Leu Asp Xaa 100 105 110 Asp Xaa Xaa Phe Leu His Gly Arg Ser Pro Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ser Asp Lys Gln 130 135 140 His Trp His Pro Lys Val Arg Phe Gln Xaa Glu Thr Ile Asn Asn Ile 145 150 155 160 Ala Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Lys Leu Pro Asn Gln Lys Ser Ile 165 170 175 Gln Ala His Met Lys Tyr Lys Phe Tyr Phe Lys 180 185 <210> 232 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (65)..(65) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(78) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(87) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (96)..(96) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (102)..(106) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (102)..(106) <223> This region may encompass 0-5 residues <220> <221> MOD_RES <222> (125)..(125) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (135)..(135) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (138)..(163) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (138)..(163) <223> This region may encompass 0-26 residues <400> 232 Trp Gly Gly Cys Pro Ala Pro Met Glu Thr Ile Thr Asp Pro Cys Lys 1 5 10 15 Gln Pro Lys Tyr Pro Ile Pro Asn Asn Leu Leu Gln Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Gln Xaa Pro Thr Thr Pro Ile Glu Thr Tyr Leu Tyr Lys Phe Asp Glu 35 40 45 Arg Arg Gly Leu Leu Thr Lys Lys Ala Ala Lys Arg Ile Lys Lys Asp 50 55 60 Xaa Thr Thr Glu Thr Thr Leu Phe Thr Asp Thr Gly Xaa Xaa Thr Ser 65 70 75 80 Thr Thr Leu Pro Thr Xaa Xaa Gln Thr Glu Thr Thr Gln Glu Glu Xaa 85 90 95 Thr Ser Glu Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Thr Leu Leu Gln Gln 100 105 110 Leu Gln Gln Leu Arg Arg Lys Gln Lys Gln Leu Arg Xaa Arg Ile Leu 115 120 125 Gln Leu Leu Gln Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa <210> 233 <211> 203 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(116) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (120)..(121) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (125)..(125) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (170)..(170) <223> Any amino acid <400> 233 Thr Ile Pro Leu Lys Gln Trp Gln Pro Glu Ser Ile Arg Lys Cys Lys 1 5 10 15 Ile Lys Gly Tyr Gly Thr Leu Val Leu Gly Ala Glu Gly Arg Gln Phe 20 25 30 Tyr Cys Tyr Thr Asn Glu Lys Asp Glu Tyr Thr Pro Pro Lys Ala Pro 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Phe Gly Val Glu Leu Phe Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr 50 55 60 Glu Gln Trp Lys Ala Arg Asn Asn Ile Trp Thr Lys Ser Asn Xaa Tyr 65 70 75 80 Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Thr Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Arg His 85 90 95 Pro Thr Thr Asp Phe Ile Val Xaa Tyr Ser Arg Gln Pro Pro Phe Glu 100 105 110 Ile Asp Lys Xaa Thr Tyr Met Xaa Xaa His Pro Gln Xaa Leu Leu Leu 115 120 125 Arg Lys His Lys Lys Ile Ile Leu Ser Lys Ala Thr Asn Pro Lys Gly 130 135 140 Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Asn 145 150 155 160 Lys Trp Phe Phe Gln Lys Gln Phe Ala Xaa Tyr Gly Leu Val Gln Leu 165 170 175 Gln Ala Ala Ala Cys Asx Leu Arg Tyr Pro Arg Leu Gly Cys Cys Asn 180 185 190 Glu Asn Arg Leu Ile Thr Leu Tyr Tyr Leu Asn 195 200 <210> 234 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (58)..(58) <223> I or L <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (90)..(90) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (95)..(95) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (105)..(105) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (111)..(111) <223> I or L <220> <221> MOD_RES <222> (113)..(113) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (154)..(154) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (156)..(156) <223> Any amino acid <400> 234 Leu Pro Ile Val Val Ala Arg Tyr Asn Pro Ala Xaa Asp Thr Gly Lys 1 5 10 15 Gly Asn Lys Xaa Trp Leu Xaa Ser Thr Leu Asn Gly Ser Xaa Trp Ala 20 25 30 Pro Pro Thr Thr Asp Lys Asp Leu Ile Ile Glu Gly Leu Pro Leu Trp 35 40 45 Leu Ala Leu Tyr Gly Tyr Trp Ser Tyr Xaa Lys Lys Val Lys Lys Asp 50 55 60 Lys Gly Ile Leu Gln Ser His Met Phe Val Val Lys Ser Pro Ala Ile 65 70 75 80 Gln Pro Leu Xaa Thr Ala Thr Thr Gln Xaa Thr Phe Tyr Pro Xaa Ile 85 90 95 Asp Asn Ser Phe Ile Gln Gly Lys Xaa Pro Tyr Asp Glu Pro Xaa Thr 100 105 110 Xaa Asn Gln Lys Lys Leu Trp Tyr Pro Thr Leu Glu His Gln Gln Glu 115 120 125 Thr Ile Asn Ala Ile Val Glu Ser Gly Pro Tyr Val Pro Lys Leu Asp 130 135 140 Asn Gln Lys Asn Ser Thr Trp Glu Leu Xaa Tyr Xaa Tyr Thr Phe Tyr 145 150 155 160 Phe Lys <210> 235 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(73) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(82) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (81)..(82) <223> This region may encompass 0-2 residues <220> <221> MOD_RES <222> (90)..(90) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (119)..(124) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (119)..(124) <223> This region may encompass 1-6 residues <220> <221> MOD_RES <222> (168)..(177) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (168)..(177) <223> This region may encompass 1-10 residues <400> 235 Trp Gly Gly Pro Gln Ile Pro Asp Gln Pro Val Glu Asp Pro Lys Xaa 1 5 10 15 Gln Gly Thr Tyr Pro Val Pro Asp Thr Xaa Gln Gln Thr Ile Gln Ile 20 25 30 Xaa Asn Pro Leu Lys Gln Lys Pro Glu Thr Met Phe His Asp Trp Asp 35 40 45 Tyr Arg Arg Gly Ile Ile Thr Ser Thr Ala Leu Lys Arg Met Gln Glu 50 55 60 Asn Leu Glu Thr Asp Ser Ser Phe Xaa Ser Asp Ser Glu Glu Thr Pro 65 70 75 80 Xaa Xaa Lys Lys Lys Lys Arg Leu Thr Xaa Glu Leu Pro Xaa Pro Gln 85 90 95 Glu Glu Thr Glu Glu Ile Gln Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys Glu Glu 100 105 110 Ser Thr Cys Gln Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asn Leu Gln 115 120 125 Gln Leu Ile His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Lys His Asn 130 135 140 Ile Leu Lys Leu Leu Ser Asp Leu Lys Glx Lys Gln Arg Leu Leu Gln 145 150 155 160 Leu Gln Thr Gly Ile Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa <210> 236 <400> 236 000 <210> 237 <400> 237 000 <210> 238 <400> 238 000 <210> 239 <400> 239 000 <210> 240 <400> 240 000 <210> 241 <400> 241 000 <210> 242 <400> 242 000 <210> 243 <400> 243 000 <210> 244 <400> 244 000 <210> 245 <400> 245 000 <210> 246 <400> 246 000 <210> 247 <400> 247 000 <210> 248 <400> 248 000 <210> 249 <400> 249 000 <210> 250 <400> 250 000 <210> 251 <400> 251 000 <210> 252 <400> 252 000 <210> 253 <400> 253 000 <210> 254 <400> 254 000 <210> 255 <400> 255 000 <210> 256 <400> 256 000 <210> 257 <400> 257 000 <210> 258 <400> 258 000 <210> 259 <400> 259 000 <210> 260 <400> 260 000 <210> 261 <400> 261 000 <210> 262 <400> 262 000 <210> 263 <400> 263 000 <210> 264 <400> 264 000 <210> 265 <400> 265 000 <210> 266 <400> 266 000 <210> 267 <400> 267 000 <210> 268 <400> 268 000 <210> 269 <400> 269 000 <210> 270 <400> 270 000 <210> 271 <400> 271 000 <210> 272 <400> 272 000 <210> 273 <400> 273 000 <210> 274 <400> 274 000 <210> 275 <400> 275 000 <210> 276 <400> 276 000 <210> 277 <400> 277 000 <210> 278 <400> 278 000 <210> 279 <400> 279 000 <210> 280 <400> 280 000 <210> 281 <400> 281 000 <210> 282 <400> 282 000 <210> 283 <400> 283 000 <210> 284 <400> 284 000 <210> 285 <400> 285 000 <210> 286 <400> 286 000 <210> 287 <400> 287 000 <210> 288 <400> 288 000 <210> 289 <400> 289 000 <210> 290 <400> 290 000 <210> 291 <400> 291 000 <210> 292 <400> 292 000 <210> 293 <400> 293 000 <210> 294 <400> 294 000 <210> 295 <400> 295 000 <210> 296 <400> 296 000 <210> 297 <400> 297 000 <210> 298 <400> 298 000 <210> 299 <400> 299 000 <210> 300 <400> 300 000 <210> 301 <400> 301 000 <210> 302 <400> 302 000 <210> 303 <400> 303 000 <210> 304 <400> 304 000 <210> 305 <400> 305 000 <210> 306 <400> 306 000 <210> 307 <400> 307 000 <210> 308 <400> 308 000 <210> 309 <400> 309 000 <210> 310 <400> 310 000 <210> 311 <400> 311 000 <210> 312 <400> 312 000 <210> 313 <400> 313 000 <210> 314 <400> 314 000 <210> 315 <400> 315 000 <210> 316 <400> 316 000 <210> 317 <400> 317 000 <210> 318 <400> 318 000 <210> 319 <400> 319 000 <210> 320 <400> 320 000 <210> 321 <400> 321 000 <210> 322 <400> 322 000 <210> 323 <400> 323 000 <210> 324 <400> 324 000 <210> 325 <400> 325 000 <210> 326 <400> 326 000 <210> 327 <400> 327 000 <210> 328 <400> 328 000 <210> 329 <400> 329 000 <210> 330 <400> 330 000 <210> 331 <400> 331 000 <210> 332 <400> 332 000 <210> 333 <400> 333 000 <210> 334 <400> 334 000 <210> 335 <400> 335 000 <210> 336 <400> 336 000 <210> 337 <400> 337 000 <210> 338 <400> 338 000 <210> 339 <400> 339 000 <210> 340 <400> 340 000 <210> 341 <400> 341 000 <210> 342 <400> 342 000 <210> 343 <400> 343 000 <210> 344 <400> 344 000 <210> 345 <400> 345 000 <210> 346 <400> 346 000 <210> 347 <400> 347 000 <210> 348 <400> 348 000 <210> 349 <400> 349 000 <210> 350 <400> 350 000 <210> 351 <400> 351 000 <210> 352 <400> 352 000 <210> 353 <400> 353 000 <210> 354 <400> 354 000 <210> 355 <400> 355 000 <210> 356 <400> 356 000 <210> 357 <400> 357 000 <210> 358 <400> 358 000 <210> 359 <400> 359 000 <210> 360 <400> 360 000 <210> 361 <400> 361 000 <210> 362 <400> 362 000 <210> 363 <400> 363 000 <210> 364 <400> 364 000 <210> 365 <400> 365 000 <210> 366 <400> 366 000 <210> 367 <400> 367 000 <210> 368 <400> 368 000 <210> 369 <400> 369 000 <210> 370 <400> 370 000 <210> 371 <400> 371 000 <210> 372 <400> 372 000 <210> 373 <400> 373 000 <210> 374 <400> 374 000 <210> 375 <400> 375 000 <210> 376 <400> 376 000 <210> 377 <400> 377 000 <210> 378 <400> 378 000 <210> 379 <400> 379 000 <210> 380 <400> 380 000 <210> 381 <400> 381 000 <210> 382 <400> 382 000 <210> 383 <400> 383 000 <210> 384 <400> 384 000 <210> 385 <400> 385 000 <210> 386 <400> 386 000 <210> 387 <400> 387 000 <210> 388 <400> 388 000 <210> 389 <400> 389 000 <210> 390 <400> 390 000 <210> 391 <400> 391 000 <210> 392 <400> 392 000 <210> 393 <400> 393 000 <210> 394 <400> 394 000 <210> 395 <400> 395 000 <210> 396 <400> 396 000 <210> 397 <400> 397 000 <210> 398 <400> 398 000 <210> 399 <400> 399 000 <210> 400 <400> 400 000 <210> 401 <400> 401 000 <210> 402 <400> 402 000 <210> 403 <400> 403 000 <210> 404 <400> 404 000 <210> 405 <400> 405 000 <210> 406 <400> 406 000 <210> 407 <400> 407 000 <210> 408 <400> 408 000 <210> 409 <400> 409 000 <210> 410 <400> 410 000 <210> 411 <400> 411 000 <210> 412 <400> 412 000 <210> 413 <400> 413 000 <210> 414 <400> 414 000 <210> 415 <400> 415 000 <210> 416 <400> 416 000 <210> 417 <400> 417 000 <210> 418 <400> 418 000 <210> 419 <400> 419 000 <210> 420 <400> 420 000 <210> 421 <400> 421 000 <210> 422 <400> 422 000 <210> 423 <400> 423 000 <210> 424 <400> 424 000 <210> 425 <400> 425 000 <210> 426 <400> 426 000 <210> 427 <400> 427 000 <210> 428 <400> 428 000 <210> 429 <400> 429 000 <210> 430 <400> 430 000 <210> 431 <400> 431 000 <210> 432 <400> 432 000 <210> 433 <400> 433 000 <210> 434 <400> 434 000 <210> 435 <400> 435 000 <210> 436 <400> 436 000 <210> 437 <400> 437 000 <210> 438 <400> 438 000 <210> 439 <400> 439 000 <210> 440 <400> 440 000 <210> 441 <400> 441 000 <210> 442 <400> 442 000 <210> 443 <400> 443 000 <210> 444 <400> 444 000 <210> 445 <400> 445 000 <210> 446 <400> 446 000 <210> 447 <400> 447 000 <210> 448 <400> 448 000 <210> 449 <400> 449 000 <210> 450 <400> 450 000 <210> 451 <400> 451 000 <210> 452 <400> 452 000 <210> 453 <400> 453 000 <210> 454 <400> 454 000 <210> 455 <400> 455 000 <210> 456 <400> 456 000 <210> 457 <400> 457 000 <210> 458 <400> 458 000 <210> 459 <400> 459 000 <210> 460 <400> 460 000 <210> 461 <400> 461 000 <210> 462 <400> 462 000 <210> 463 <400> 463 000 <210> 464 <400> 464 000 <210> 465 <400> 465 000 <210> 466 <400> 466 000 <210> 467 <400> 467 000 <210> 468 <400> 468 000 <210> 469 <400> 469 000 <210> 470 <400> 470 000 <210> 471 <400> 471 000 <210> 472 <400> 472 000 <210> 473 <400> 473 000 <210> 474 <400> 474 000 <210> 475 <400> 475 000 <210> 476 <400> 476 000 <210> 477 <400> 477 000 <210> 478 <400> 478 000 <210> 479 <400> 479 000 <210> 480 <400> 480 000 <210> 481 <400> 481 000 <210> 482 <400> 482 000 <210> 483 <400> 483 000 <210> 484 <400> 484 000 <210> 485 <400> 485 000 <210> 486 <400> 486 000 <210> 487 <400> 487 000 <210> 488 <400> 488 000 <210> 489 <400> 489 000 <210> 490 <400> 490 000 <210> 491 <400> 491 000 <210> 492 <400> 492 000 <210> 493 <400> 493 000 <210> 494 <400> 494 000 <210> 495 <400> 495 000 <210> 496 <400> 496 000 <210> 497 <400> 497 000 <210> 498 <400> 498 000 <210> 499 <400> 499 000 <210> 500 <400> 500 000 <210> 501 <400> 501 000 <210> 502 <400> 502 000 <210> 503 <400> 503 000 <210> 504 <400> 504 000 <210> 505 <400> 505 000 <210> 506 <400> 506 000 <210> 507 <400> 507 000 <210> 508 <400> 508 000 <210> 509 <400> 509 000 <210> 510 <400> 510 000 <210> 511 <400> 511 000 <210> 512 <400> 512 000 <210> 513 <400> 513 000 <210> 514 <400> 514 000 <210> 515 <400> 515 000 <210> 516 <400> 516 000 <210> 517 <400> 517 000 <210> 518 <400> 518 000 <210> 519 <400> 519 000 <210> 520 <400> 520 000 <210> 521 <400> 521 000 <210> 522 <400> 522 000 <210> 523 <400> 523 000 <210> 524 <400> 524 000 <210> 525 <400> 525 000 <210> 526 <400> 526 000 <210> 527 <400> 527 000 <210> 528 <400> 528 000 <210> 529 <400> 529 000 <210> 530 <400> 530 000 <210> 531 <400> 531 000 <210> 532 <400> 532 000 <210> 533 <400> 533 000 <210> 534 <400> 534 000 <210> 535 <400> 535 000 <210> 536 <400> 536 000 <210> 537 <400> 537 000 <210> 538 <400> 538 000 <210> 539 <400> 539 000 <210> 540 <400> 540 000 <210> 541 <400> 541 000 <210> 542 <400> 542 000 <210> 543 <400> 543 000 <210> 544 <400> 544 000 <210> 545 <400> 545 000 <210> 546 <400> 546 000 <210> 547 <400> 547 000 <210> 548 <400> 548 000 <210> 549 <400> 549 000 <210> 550 <400> 550 000 <210> 551 <400> 551 000 <210> 552 <400> 552 000 <210> 553 <400> 553 000 <210> 554 <400> 554 000 <210> 555 <400> 555 000 <210> 556 <400> 556 000 <210> 557 <400> 557 000 <210> 558 <400> 558 000 <210> 559 <400> 559 000 <210> 560 <400> 560 000 <210> 561 <400> 561 000 <210> 562 <400> 562 000 <210> 563 <400> 563 000 <210> 564 <400> 564 000 <210> 565 <400> 565 000 <210> 566 <400> 566 000 <210> 567 <400> 567 000 <210> 568 <400> 568 000 <210> 569 <400> 569 000 <210> 570 <400> 570 000 <210> 571 <400> 571 000 <210> 572 <400> 572 000 <210> 573 <400> 573 000 <210> 574 <400> 574 000 <210> 575 <400> 575 000 <210> 576 <400> 576 000 <210> 577 <400> 577 000 <210> 578 <400> 578 000 <210> 579 <400> 579 000 <210> 580 <400> 580 000 <210> 581 <400> 581 000 <210> 582 <400> 582 000 <210> 583 <400> 583 000 <210> 584 <400> 584 000 <210> 585 <400> 585 000 <210> 586 <400> 586 000 <210> 587 <400> 587 000 <210> 588 <400> 588 000 <210> 589 <400> 589 000 <210> 590 <400> 590 000 <210> 591 <400> 591 000 <210> 592 <400> 592 000 <210> 593 <400> 593 000 <210> 594 <400> 594 000 <210> 595 <400> 595 000 <210> 596 <400> 596 000 <210> 597 <400> 597 000 <210> 598 <400> 598 000 <210> 599 <400> 599 000 <210> 600 <400> 600 000 <210> 601 <400> 601 000 <210> 602 <400> 602 000 <210> 603 <400> 603 000 <210> 604 <400> 604 000 <210> 605 <400> 605 000 <210> 606 <400> 606 000 <210> 607 <400> 607 000 <210> 608 <400> 608 000 <210> 609 <400> 609 000 <210> 610 <400> 610 000 <210> 611 <400> 611 000 <210> 612 <400> 612 000 <210> 613 <400> 613 000 <210> 614 <400> 614 000 <210> 615 <400> 615 000 <210> 616 <400> 616 000 <210> 617 <400> 617 000 <210> 618 <400> 618 000 <210> 619 <400> 619 000 <210> 620 <400> 620 000 <210> 621 <400> 621 000 <210> 622 <400> 622 000 <210> 623 <400> 623 000 <210> 624 <400> 624 000 <210> 625 <400> 625 000 <210> 626 <400> 626 000 <210> 627 <400> 627 000 <210> 628 <400> 628 000 <210> 629 <400> 629 000 <210> 630 <400> 630 000 <210> 631 <400> 631 000 <210> 632 <400> 632 000 <210> 633 <400> 633 000 <210> 634 <400> 634 000 <210> 635 <400> 635 000 <210> 636 <400> 636 000 <210> 637 <400> 637 000 <210> 638 <400> 638 000 <210> 639 <400> 639 000 <210> 640 <400> 640 000 <210> 641 <400> 641 000 <210> 642 <400> 642 000 <210> 643 <400> 643 000 <210> 644 <400> 644 000 <210> 645 <400> 645 000 <210> 646 <400> 646 000 <210> 647 <400> 647 000 <210> 648 <400> 648 000 <210> 649 <400> 649 000 <210> 650 <400> 650 000 <210> 651 <400> 651 000 <210> 652 <400> 652 000 <210> 653 <400> 653 000 <210> 654 <400> 654 000 <210> 655 <400> 655 000 <210> 656 <400> 656 000 <210> 657 <400> 657 000 <210> 658 <400> 658 000 <210> 659 <400> 659 000 <210> 660 <400> 660 000 <210> 661 <400> 661 000 <210> 662 <400> 662 000 <210> 663 <400> 663 000 <210> 664 <400> 664 000 <210> 665 <400> 665 000 <210> 666 <400> 666 000 <210> 667 <400> 667 000 <210> 668 <400> 668 000 <210> 669 <400> 669 000 <210> 670 <400> 670 000 <210> 671 <400> 671 000 <210> 672 <400> 672 000 <210> 673 <400> 673 000 <210> 674 <400> 674 000 <210> 675 <400> 675 000 <210> 676 <400> 676 000 <210> 677 <400> 677 000 <210> 678 <400> 678 000 <210> 679 <400> 679 000 <210> 680 <400> 680 000 <210> 681 <400> 681 000 <210> 682 <400> 682 000 <210> 683 <400> 683 000 <210> 684 <400> 684 000 <210> 685 <400> 685 000 <210> 686 <400> 686 000 <210> 687 <400> 687 000 <210> 688 <400> 688 000 <210> 689 <400> 689 000 <210> 690 <400> 690 000 <210> 691 <400> 691 000 <210> 692 <400> 692 000 <210> 693 <400> 693 000 <210> 694 <400> 694 000 <210> 695 <400> 695 000 <210> 696 <400> 696 000 <210> 697 <400> 697 000 <210> 698 <400> 698 000 <210> 699 <400> 699 000 <210> 700 <400> 700 000 <210> 701 <400> 701 000 <210> 702 <400> 702 000 <210> 703 <400> 703 000 <210> 704 <400> 704 000 <210> 705 <400> 705 000 <210> 706 <400> 706 000 <210> 707 <400> 707 000 <210> 708 <400> 708 000 <210> 709 <400> 709 000 <210> 710 <400> 710 000 <210> 711 <400> 711 000 <210> 712 <400> 712 000 <210> 713 <400> 713 000 <210> 714 <400> 714 000 <210> 715 <400> 715 000 <210> 716 <400> 716 000 <210> 717 <400> 717 000 <210> 718 <400> 718 000 <210> 719 <400> 719 000 <210> 720 <400> 720 000 <210> 721 <400> 721 000 <210> 722 <400> 722 000 <210> 723 <400> 723 000 <210> 724 <400> 724 000 <210> 725 <400> 725 000 <210> 726 <400> 726 000 <210> 727 <400> 727 000 <210> 728 <400> 728 000 <210> 729 <400> 729 000 <210> 730 <400> 730 000 <210> 731 <400> 731 000 <210> 732 <400> 732 000 <210> 733 <400> 733 000 <210> 734 <400> 734 000 <210> 735 <400> 735 000 <210> 736 <400> 736 000 <210> 737 <400> 737 000 <210> 738 <400> 738 000 <210> 739 <400> 739 000 <210> 740 <400> 740 000 <210> 741 <400> 741 000 <210> 742 <400> 742 000 <210> 743 <400> 743 000 <210> 744 <400> 744 000 <210> 745 <400> 745 000 <210> 746 <400> 746 000 <210> 747 <400> 747 000 <210> 748 <400> 748 000 <210> 749 <400> 749 000 <210> 750 <400> 750 000 <210> 751 <400> 751 000 <210> 752 <400> 752 000 <210> 753 <400> 753 000 <210> 754 <400> 754 000 <210> 755 <400> 755 000 <210> 756 <400> 756 000 <210> 757 <400> 757 000 <210> 758 <400> 758 000 <210> 759 <400> 759 000 <210> 760 <400> 760 000 <210> 761 <400> 761 000 <210> 762 <400> 762 000 <210> 763 <400> 763 000 <210> 764 <400> 764 000 <210> 765 <400> 765 000 <210> 766 <400> 766 000 <210> 767 <400> 767 000 <210> 768 <400> 768 000 <210> 769 <400> 769 000 <210> 770 <400> 770 000 <210> 771 <400> 771 000 <210> 772 <400> 772 000 <210> 773 <400> 773 000 <210> 774 <400> 774 000 <210> 775 <400> 775 000 <210> 776 <400> 776 000 <210> 777 <400> 777 000 <210> 778 <400> 778 000 <210> 779 <400> 779 000 <210> 780 <400> 780 000 <210> 781 <400> 781 000 <210> 782 <400> 782 000 <210> 783 <400> 783 000 <210> 784 <400> 784 000 <210> 785 <400> 785 000 <210> 786 <400> 786 000 <210> 787 <400> 787 000 <210> 788 <400> 788 000 <210> 789 <400> 789 000 <210> 790 <400> 790 000 <210> 791 <400> 791 000 <210> 792 <400> 792 000 <210> 793 <400> 793 000 <210> 794 <400> 794 000 <210> 795 <400> 795 000 <210> 796 <400> 796 000 <210> 797 <400> 797 000 <210> 798 <400> 798 000 <210> 799 <400> 799 000 <210> 800 <400> 800 000 <210> 801 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 801 gcggcggggg ggcggccgcg ttcgcgcgcc gcccaccagg gggtgctgcg cgcccccccc 60 cgcgcatgcg cggggccccc ccccgggggg gctccgcccc cccggccccc ccccgtgcta 120 aacccaccgc gcatgcgcga ccacgccccc gccgcc 156 <210> 802 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 802 ccgagcgtta gcgaggagtg cgaccctacc ccctgggccc acttcttcgg agccgcgcgc 60 tacgccttcg gctgcgcgcg gcacctcaga cccccgctcg tgctgacacg cttgcgcgtg 120 tcagaccact tcgggctcgc gggggtcggg 150 <210> 803 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 803 gccgccgcgg cggcgggggg cggcgcgctg cgcgcgccgc ccagtagggg gagccatgcg 60 cccccccccg cgcatgcgcg gggccccccc ccgcgggggg ctccgccccc cggccccccc 120 cg 122 <210> 804 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 804 cggcccagcg gcggcgcgcg cgcttcgcgc gcgcgccggg gggctccgcc cccccccgcg 60 catgcgcggg gccccccccc gcggggggct ccgccccccg gtcccccccc g 111 <210> 805 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 805 cggccgtgcg gcggcgcgcg cgcttcgcgc gcgcgccggg ggctgccgcc cccccccgcg 60 catgcgcgcg gggccccccc ccgcgggggg ctccgccccc cggccccccc ccccg 115 <210> 806 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 806 cggcggcggc gcgcgcgcta cgcgcgcgcg ccggggggct gccgcccccc ccccgcgcat 60 gcgcggggcc cccccccgcg gggggctccg ccccccggcc cccc 104 <210> 807 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 807 ggcggcggcg cgcgcgctac gcgcgcgcgc cggggagctc tgcccccccc cgcgcatgcg 60 cgcgggtccc ccccccgcgg ggggctccgc cccccggtcc cccccccg 108 <210> 808 <400> 808 000 <210> 809 <400> 809 000 <210> 810 <400> 810 000 <210> 811 <400> 811 000 <210> 812 <400> 812 000 <210> 813 <400> 813 000 <210> 814 <400> 814 000 <210> 815 <400> 815 000 <210> 816 <400> 816 000 <210> 817 <400> 817 000 <210> 818 <400> 818 000 <210> 819 <400> 819 000 <210> 820 <400> 820 000 <210> 821 <400> 821 000 <210> 822 <400> 822 000 <210> 823 <400> 823 000 <210> 824 <400> 824 000 <210> 825 <400> 825 000 <210> 826 <400> 826 000 <210> 827 <400> 827 000 <210> 828 <400> 828 000 <210> 829 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(10) <223> Any amino acid <400> 829 Tyr Asn Pro Xaa Xaa Asp Xaa Gly Xaa Xaa Asn 1 5 10 <210> 830 <400> 830 000 <210> 831 <400> 831 000 <210> 832 <400> 832 000 <210> 833 <400> 833 000 <210> 834 <400> 834 000 <210> 835 <400> 835 000 <210> 836 <400> 836 000 <210> 837 <400> 837 000 <210> 838 <400> 838 000 <210> 839 <400> 839 000 <210> 840 <400> 840 000 <210> 841 <400> 841 000 <210> 842 <400> 842 000 <210> 843 <400> 843 000 <210> 844 <400> 844 000 <210> 845 <400> 845 000 <210> 846 <400> 846 000 <210> 847 <400> 847 000 <210> 848 <400> 848 000 <210> 849 <400> 849 000 <210> 850 <400> 850 000 <210> 851 <400> 851 000 <210> 852 <400> 852 000 <210> 853 <400> 853 000 <210> 854 <400> 854 000 <210> 855 <400> 855 000 <210> 856 <400> 856 000 <210> 857 <400> 857 000 <210> 858 <400> 858 000 <210> 859 <400> 859 000 <210> 860 <400> 860 000 <210> 861 <400> 861 000 <210> 862 <400> 862 000 <210> 863 <400> 863 000 <210> 864 <400> 864 000 <210> 865 <400> 865 000 <210> 866 <400> 866 000 <210> 867 <400> 867 000 <210> 868 <400> 868 000 <210> 869 <400> 869 000 <210> 870 <400> 870 000 <210> 871 <400> 871 000 <210> 872 <400> 872 000 <210> 873 <400> 873 000 <210> 874 <400> 874 000 <210> 875 <400> 875 000 <210> 876 <400> 876 000 <210> 877 <400> 877 000 <210> 878 <400> 878 000 <210> 879 <400> 879 000 <210> 880 <400> 880 000 <210> 881 <400> 881 000 <210> 882 <400> 882 000 <210> 883 <400> 883 000 <210> 884 <400> 884 000 <210> 885 <400> 885 000 <210> 886 <211> 3176 <212> DNA <213> Gammatorquevirus sp. <400> 886 taaaatggcg ggagccaatc attttatact ttcactttcc aattaaaaat ggccacgtca 60 caaacaaggg gtggagccat ttaaactata taactaagtg gggtggcgaa tggctgagtt 120 taccccgcta gacggtgcag ggaccggatc gagcgcagcg aggaggtccc cggctgccca 180 tgggcgggag ccgaggtgag tgaaaccacc gaggtctagg ggcaattcgg gctagggcag 240 tctagcggaa cgggcaagaa acttaaaaca atatttgttt tacagatggt tagtatatcc 300 tcaagtgatt tttttaagaa aacgaaattt aatgaggaga cgcagaacca agtatggatg 360 tctcaaattg ctgactctca tgataatatc tgcagttgct ggcatccatt tgctcacctt 420 cttgcttcca tatttcctcc tggccacaaa gatcgtgatc ttactattaa ccaaattctt 480 ctaagagatt ataaagaaaa atgccattct ggtggagaag aaggagaaaa ttctggacca 540 acaacaggtt taattacacc aaaagaagaa gatatagaaa aagatggccc agaaggcgcc 600 gcagaagaag accatacaga cgccctgttc gccgccgccg tagaaaactt cgaaaggtaa 660 agagaaaaaa aaaatcttta attgttagac aatggcaacc agacagtata agaacttgta 720 aaattatagg acagtcagct atagttgttg gggctgaagg aaagcaaatg tactgttata 780 ctgtcaataa gttaattaat gtgcccccaa aaacaccata tgggggaggc tttggagtag 840 accaatacac actgaaatac ttatatgaag aatacagatt tgcacaaaac atttggacac 900 aatctaatgt actgaaagac ttatgcagat acataaatgt taagctaata ttctacagag 960 acaacaaaac agactttgtc ctttcctatg acagaaaccc accttttcaa ctaacaaaat 1020 ttacataccc aggagcacac ccacaacaaa tcatgcttca aaaacaccac aaattcatac 1080 tatcacaaat gacaaagcct aatggaagac taacaaaaaa actcaaaatt aaacctccta 1140 aacaaatgct ttctaaatgg ttcttttcaa aacaattctg taaataccct ttactatctc 1200 ttaaagcttc tgcactagac cttaggcact cttacctagg ctgctgtaat gaaaatccac 1260 aggtattttt ttattattta aaccatggat actacacaat aacaaactgg ggagcacaat 1320 cctcaacagc atacagacct aactccaagg tgacagacac aacatactac agatacaaaa 1380 atgacagaaa aaatattaac attaaaagcc atgaatacga aaaaagtata tcatatgaaa 1440 acggttattt tcaatctagt ttcttacaaa cacagtgcat atataccagt gagcgtggtg 1500 aagcctgtat agcagaaaaa ccactaggaa tagctattta caatccagta aaagacaatg 1560 gagatggtaa tatgatatac cttgtaagca ctctagcaaa cacttgggac cagcctccaa 1620 aagacagtgc tattttaata caaggagtac ccatatggct aggcttattt ggatatttag 1680 actactgtag acaaattaaa gctgacaaaa catggctaga cagtcatgta ctagtaattc 1740 aaagtcctgc tatttttact tacccaaatc caggagcagg caaatggtat tgtccactat 1800 cacaaagttt tataaatggc aatggtccgt ttaatcaacc acctacactg ctacaaaaag 1860 caaagtggtt tccacaaata caataccaac aagaaattat taatagcttt gtagaatcag 1920 gaccatttgt tcccaaatat gcaaatcaaa ctgaaagcaa ctgggaacta aaatataaat 1980 atgtttttac atttaagtgg ggtggaccac aattccatga accagaaatt gctgacccta 2040 gcaaacaaga gcagtatgat gtccccgata ctttctacca aacaatacaa attgaagatc 2100 cagaaggaca agaccccaga tctctcatcc atgattggga ctacagacga ggctttatta 2160 aagaaagatc tcttaaaaga atgtcaactt acttctcaac tcatacagat cagcaagcaa 2220 cttcagagga agacattccc aaaaagaaaa agagaattgg accccaactc acagtcccac 2280 aacaaaaaga agaggagaca ctgtcatgtc tcctctctct ctgcaaaaaa gataccttcc 2340 aagaaacaga gacacaagaa gacctccagc agctcatcaa gcagcagcag gagcagcagc 2400 tcctcctcaa gagaaacatc ctccagctca tccacaaact aaaagagaat caacaaatgc 2460 ttcagcttca cacaggcatg ttaccttaac cagatttaaa cctggatttg aagagcaaac 2520 agagagagaa ttagcaatta tatttcatag gccccctaga acctacaaag aggaccttcc 2580 attctatccc tggctaccac ctgcacccct tgtacaattt aaccttaact tcaaaggcta 2640 ggccaacaat gtacacttag taaagcatgt ttattaaagc acaaccccca aaataaatgt 2700 aaaaataaaa aaaaaaaaaa aaaaataaaa aattgcaaaa attcggcgct cgcgcgcatg 2760 tgcgcctctg gcgcaaatca cgcaacgctc gcgcgcccgc gtatgtctct ttaccacgca 2820 cctagattgg ggtgcgcgcg ctagcgcgcg caccccaatg cgccccgccc tcgttccgac 2880 ccgcttgcgc gggtcggacc acttcgggct cgggggggcg cgcctgcggc gcttttttac 2940 taaacagact ccgagccgcc atttggcccc ctaagctccg cccccctcat gaatattcat 3000 aaaggaaacc acataattag aattgccgac cacaaactgc catatgctaa ttagttcccc 3060 ttttacaaag taaaagggga agtgaacata gccccacacc cgcaggggca aggccccgca 3120 cccctacgtc actaaccacg cccccgccgc catcttgggt gcggcagggc gggggc 3176 <210> 887 <211> 124 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 887 Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 1 5 10 15 Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 20 25 30 Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 50 55 60 Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 65 70 75 80 Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 100 105 110 Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Arg 115 120 <210> 888 <211> 271 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 888 Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 1 5 10 15 Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 20 25 30 Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 50 55 60 Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 65 70 75 80 Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 100 105 110 Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Ser Gly Val Asp His 115 120 125 Asn Ser Met Asn Gln Lys Leu Leu Thr Leu Ala Asn Lys Ser Ser Met 130 135 140 Met Ser Pro Ile Leu Ser Thr Lys Gln Tyr Lys Leu Lys Ile Gln Lys 145 150 155 160 Asp Lys Thr Pro Asp Leu Ser Ser Met Ile Gly Thr Thr Asp Glu Ala 165 170 175 Leu Leu Lys Lys Asp Leu Leu Lys Glu Cys Gln Leu Thr Ser Gln Leu 180 185 190 Ile Gln Ile Ser Lys Gln Leu Gln Arg Lys Thr Phe Pro Lys Arg Lys 195 200 205 Arg Glu Leu Asp Pro Asn Ser Gln Ser His Asn Lys Lys Lys Arg Arg 210 215 220 His Cys His Val Ser Ser Leu Ser Ala Lys Lys Ile Pro Ser Lys Lys 225 230 235 240 Gln Arg His Lys Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ser 245 250 255 Ser Ser Ser Ser Ser Arg Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Asn 260 265 270 <210> 889 <211> 267 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 889 Met Val Ser Ile Ser Ser Ser Asp Phe Phe Lys Lys Thr Lys Phe Asn 1 5 10 15 Glu Glu Thr Gln Asn Gln Val Trp Met Ser Gln Ile Ala Asp Ser His 20 25 30 Asp Asn Ile Cys Ser Cys Trp His Pro Phe Ala His Leu Leu Ala Ser 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Gly His Lys Asp Arg Asp Leu Thr Ile Asn Gln Ile 50 55 60 Leu Leu Arg Asp Tyr Lys Glu Lys Cys His Ser Gly Gly Glu Glu Gly 65 70 75 80 Glu Asn Ser Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Pro Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ile Glu Lys Asp Gly Pro Glu Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Thr Asp 100 105 110 Ala Leu Phe Ala Ala Ala Val Glu Asn Phe Glu Arg Ser Ala Ser Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Arg His Ser Gln Lys Glu Lys Glu Asn Trp Thr Pro Thr 130 135 140 His Ser Pro Thr Thr Lys Arg Arg Gly Asp Thr Val Met Ser Pro Leu 145 150 155 160 Ser Leu Gln Lys Arg Tyr Leu Pro Arg Asn Arg Asp Thr Arg Arg Pro 165 170 175 Pro Ala Ala His Gln Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Pro Pro Gln Glu 180 185 190 Lys His Pro Pro Ala His Pro Gln Thr Lys Arg Glu Ser Thr Asn Ala 195 200 205 Ser Ala Ser His Arg His Val Thr Leu Thr Arg Phe Lys Pro Gly Phe 210 215 220 Glu Glu Gln Thr Glu Arg Glu Leu Ala Ile Ile Phe His Arg Pro Pro 225 230 235 240 Arg Thr Tyr Lys Glu Asp Leu Pro Phe Tyr Pro Trp Leu Pro Pro Ala 245 250 255 Pro Leu Val Gln Phe Asn Leu Asn Phe Lys Gly 260 265 <210> 890 <211> 50 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 890 Met Arg Arg Arg Arg Thr Lys Tyr Gly Cys Leu Lys Leu Leu Thr Leu 1 5 10 15 Met Ile Ile Ser Ala Val Ala Gly Ile His Leu Leu Thr Phe Leu Leu 20 25 30 Pro Tyr Phe Leu Leu Ala Thr Lys Ile Val Ile Leu Leu Leu Thr Lys 35 40 45 Phe Phe 50 <210> 891 <211> 662 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 891 Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 1 5 10 15 Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 45 Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys Ser Leu Ile Val Arg Gln 50 55 60 Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys Ile Ile Gly Gln Ser Ala 65 70 75 80 Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met Tyr Cys Tyr Thr Val Asn 85 90 95 Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro Tyr Gly Gly Gly Phe Gly 100 105 110 Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr Glu Glu Tyr Arg Phe Ala 115 120 125 Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu Lys Asp Leu Cys Arg Tyr 130 135 140 Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Asp Phe Val 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln Leu Thr Lys Phe Thr Tyr 165 170 175 Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu Gln Lys His His Lys Phe 180 185 190 Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly Arg Leu Thr Lys Lys Leu 195 200 205 Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser Lys Trp Phe Phe Ser Lys 210 215 220 Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu Lys Ala Ser Ala Leu Asp 225 230 235 240 Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn Glu Asn Pro Gln Val Phe 245 250 255 Phe Tyr Tyr Leu Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala 260 265 270 Gln Ser Ser Thr Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr 275 280 285 Tyr Tyr Arg Tyr Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His 290 295 300 Glu Tyr Glu Lys Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser 305 310 315 320 Phe Leu Gln Thr Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys 325 330 335 Ile Ala Glu Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp 340 345 350 Asn Gly Asp Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr 355 360 365 Trp Asp Gln Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro 370 375 380 Ile Trp Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys 385 390 395 400 Ala Asp Lys Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro 405 410 415 Ala Ile Phe Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro 420 425 430 Leu Ser Gln Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro 435 440 445 Thr Leu Leu Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln 450 455 460 Glu Ile Ile Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr 465 470 475 480 Ala Asn Gln Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe 485 490 495 Thr Phe Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp 500 505 510 Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr 515 520 525 Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His 530 535 540 Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg 545 550 555 560 Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu 565 570 575 Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val 580 585 590 Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys 595 600 605 Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln 610 615 620 Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile 625 630 635 640 Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu 645 650 655 His Thr Gly Met Leu Pro 660 <210> 892 <211> 215 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 892 Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 1 5 10 15 Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 45 Lys Leu Arg Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala 50 55 60 Asp Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln 65 70 75 80 Thr Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile 85 90 95 His Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys 100 105 110 Arg Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser 115 120 125 Glu Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr 130 135 140 Val Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu 145 150 155 160 Cys Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln 165 170 175 Gln Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn 180 185 190 Ile Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln 195 200 205 Leu His Thr Gly Met Leu Pro 210 215 <210> 893 <211> 129 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 893 Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 1 5 10 15 Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 45 Lys Leu Arg Lys Ile Ser Lys Gln Leu Gln Arg Lys Thr Phe Pro Lys 50 55 60 Arg Lys Arg Glu Leu Asp Pro Asn Ser Gln Ser His Asn Lys Lys Lys 65 70 75 80 Arg Arg His Cys His Val Ser Ser Leu Ser Ala Lys Lys Ile Pro Ser 85 90 95 Lys Lys Gln Arg His Lys Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 100 105 110 Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Thr 115 120 125 Asn <210> 894 <400> 894 000 <210> 895 <400> 895 000 <210> 896 <400> 896 000 <210> 897 <400> 897 000 <210> 898 <400> 898 000 <210> 899 <400> 899 000 <210> 900 <400> 900 000 <210> 901 <400> 901 000 <210> 902 <400> 902 000 <210> 903 <400> 903 000 <210> 904 <400> 904 000 <210> 905 <400> 905 000 <210> 906 <400> 906 000 <210> 907 <400> 907 000 <210> 908 <400> 908 000 <210> 909 <400> 909 000 <210> 910 <400> 910 000 <210> 911 <400> 911 000 <210> 912 <400> 912 000 <210> 913 <400> 913 000 <210> 914 <400> 914 000 <210> 915 <400> 915 000 <210> 916 <400> 916 000 <210> 917 <400> 917 000 <210> 918 <400> 918 000 <210> 919 <400> 919 000 <210> 920 <400> 920 000 <210> 921 <400> 921 000 <210> 922 <400> 922 000 <210> 923 <400> 923 000 <210> 924 <400> 924 000 <210> 925 <211> 662 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 925 Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 1 5 10 15 Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 45 Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys Ser Leu Ile Val Arg Gln 50 55 60 Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys Ile Ile Gly Gln Ser Ala 65 70 75 80 Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met Tyr Cys Tyr Thr Val Asn 85 90 95 Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro Tyr Gly Gly Gly Phe Gly 100 105 110 Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr Glu Glu Tyr Arg Phe Ala 115 120 125 Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu Lys Asp Leu Cys Arg Tyr 130 135 140 Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Asp Phe Val 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln Leu Thr Lys Phe Thr Tyr 165 170 175 Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu Gln Lys His His Lys Phe 180 185 190 Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly Arg Leu Thr Lys Lys Leu 195 200 205 Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser Lys Trp Phe Phe Ser Lys 210 215 220 Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu Lys Ala Ser Ala Leu Asp 225 230 235 240 Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn Glu Asn Pro Gln Val Phe 245 250 255 Phe Tyr Tyr Leu Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala 260 265 270 Gln Ser Ser Thr Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr 275 280 285 Tyr Tyr Arg Tyr Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His 290 295 300 Glu Tyr Glu Lys Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser 305 310 315 320 Phe Leu Gln Thr Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys 325 330 335 Ile Ala Glu Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp 340 345 350 Asn Gly Asp Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr 355 360 365 Trp Asp Gln Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro 370 375 380 Ile Trp Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys 385 390 395 400 Ala Asp Lys Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro 405 410 415 Ala Ile Phe Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro 420 425 430 Leu Ser Gln Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro 435 440 445 Thr Leu Leu Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln 450 455 460 Glu Ile Ile Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr 465 470 475 480 Ala Asn Gln Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe 485 490 495 Thr Phe Lys Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp 500 505 510 Pro Ser Lys Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr 515 520 525 Ile Gln Ile Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His 530 535 540 Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg 545 550 555 560 Met Ser Thr Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu 565 570 575 Glu Asp Ile Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val 580 585 590 Pro Gln Gln Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys 595 600 605 Lys Lys Asp Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln 610 615 620 Leu Ile Lys Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile 625 630 635 640 Leu Gln Leu Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu 645 650 655 His Thr Gly Met Leu Pro 660 <210> 926 <211> 58 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 926 Met Pro Phe Trp Trp Arg Arg Arg Arg Lys Phe Trp Thr Asn Asn Arg 1 5 10 15 Phe Asn Tyr Thr Lys Arg Arg Arg Tyr Arg Lys Arg Trp Pro Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 45 Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys 50 55 <210> 927 <211> 202 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 927 Ser Leu Ile Val Arg Gln Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg Thr Cys Lys 1 5 10 15 Ile Ile Gly Gln Ser Ala Ile Val Val Gly Ala Glu Gly Lys Gln Met 20 25 30 Tyr Cys Tyr Thr Val Asn Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro Lys Thr Pro 35 40 45 Tyr Gly Gly Gly Phe Gly Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys Tyr Leu Tyr 50 55 60 Glu Glu Tyr Arg Phe Ala Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser Asn Val Leu 65 70 75 80 Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe Tyr Arg Asp 85 90 95 Asn Lys Thr Asp Phe Val Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro Pro Phe Gln 100 105 110 Leu Thr Lys Phe Thr Tyr Pro Gly Ala His Pro Gln Gln Ile Met Leu 115 120 125 Gln Lys His His Lys Phe Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys Pro Asn Gly 130 135 140 Arg Leu Thr Lys Lys Leu Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln Met Leu Ser 145 150 155 160 Lys Trp Phe Phe Ser Lys Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu Leu Ser Leu 165 170 175 Lys Ala Ser Ala Leu Asp Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly Cys Cys Asn 180 185 190 Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Tyr Tyr Leu 195 200 <210> 928 <211> 79 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 928 Asn His Gly Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala Gln Ser Ser Thr 1 5 10 15 Ala Tyr Arg Pro Asn Ser Lys Val Thr Asp Thr Thr Tyr Tyr Arg Tyr 20 25 30 Lys Asn Asp Arg Lys Asn Ile Asn Ile Lys Ser His Glu Tyr Glu Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Tyr Glu Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Ser Phe Leu Gln Thr 50 55 60 Gln Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Arg Gly Glu Ala Cys Ile Ala Glu 65 70 75 <210> 929 <211> 160 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 929 Lys Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Asn Pro Val Lys Asp Asn Gly Asp 1 5 10 15 Gly Asn Met Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Ala Asn Thr Trp Asp Gln 20 25 30 Pro Pro Lys Asp Ser Ala Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro Ile Trp Leu 35 40 45 Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Asp Tyr Cys Arg Gln Ile Lys Ala Asp Lys 50 55 60 Thr Trp Leu Asp Ser His Val Leu Val Ile Gln Ser Pro Ala Ile Phe 65 70 75 80 Thr Tyr Pro Asn Pro Gly Ala Gly Lys Trp Tyr Cys Pro Leu Ser Gln 85 90 95 Ser Phe Ile Asn Gly Asn Gly Pro Phe Asn Gln Pro Pro Thr Leu Leu 100 105 110 Gln Lys Ala Lys Trp Phe Pro Gln Ile Gln Tyr Gln Gln Glu Ile Ile 115 120 125 Asn Ser Phe Val Glu Ser Gly Pro Phe Val Pro Lys Tyr Ala Asn Gln 130 135 140 Thr Glu Ser Asn Trp Glu Leu Lys Tyr Lys Tyr Val Phe Thr Phe Lys 145 150 155 160 <210> 930 <211> 163 <212> PRT <213> Gammatorquevirus sp. <400> 930 Trp Gly Gly Pro Gln Phe His Glu Pro Glu Ile Ala Asp Pro Ser Lys 1 5 10 15 Gln Glu Gln Tyr Asp Val Pro Asp Thr Phe Tyr Gln Thr Ile Gln Ile 20 25 30 Glu Asp Pro Glu Gly Gln Asp Pro Arg Ser Leu Ile His Asp Trp Asp 35 40 45 Tyr Arg Arg Gly Phe Ile Lys Glu Arg Ser Leu Lys Arg Met Ser Thr 50 55 60 Tyr Phe Ser Thr His Thr Asp Gln Gln Ala Thr Ser Glu Glu Asp Ile 65 70 75 80 Pro Lys Lys Lys Lys Arg Ile Gly Pro Gln Leu Thr Val Pro Gln Gln 85 90 95 Lys Glu Glu Glu Thr Leu Ser Cys Leu Leu Ser Leu Cys Lys Lys Asp 100 105 110 Thr Phe Gln Glu Thr Glu Thr Gln Glu Asp Leu Gln Gln Leu Ile Lys 115 120 125 Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Leu Leu Lys Arg Asn Ile Leu Gln Leu 130 135 140 Ile His Lys Leu Lys Glu Asn Gln Gln Met Leu Gln Leu His Thr Gly 145 150 155 160 Met Leu Pro <210> 931 <400> 931 000 <210> 932 <400> 932 000 <210> 933 <400> 933 000 <210> 934 <400> 934 000 <210> 935 <400> 935 000 <210> 936 <400> 936 000 <210> 937 <400> 937 000 <210> 938 <400> 938 000 <210> 939 <400> 939 000 <210> 940 <400> 940 000 <210> 941 <400> 941 000 <210> 942 <400> 942 000 <210> 943 <400> 943 000 <210> 944 <400> 944 000 <210> 945 <400> 945 000 <210> 946 <400> 946 000 <210> 947 <400> 947 000 <210> 948 <400> 948 000 <210> 949 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> W or F <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(8) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(20) <223> Any amino acid <400> 949 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 <210> 950 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(7) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(16) <223> Any amino acid <400> 950 Tyr Asn Cys Ser Pro Xaa Xaa Asp Xaa Gly Ala Ser Lys Arg Xaa Xaa 1 5 10 15 Asn Thr Ser Val Ala Lys 20 <210> 951 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (45)..(45) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 951 aggtgagtga aaccaccgaa gtcaaggggc aattcgggct agggncagtc t 51 <210> 952 <211> 50 <212> DNA <213> Alphatorquevirus sp. <400> 952 aggtgagttt acacaccgca gtcaaggggc aattcgggct cgggactggc 50 <210> 953 <211> 50 <212> DNA <213> Betatorquevirus sp. <400> 953 aggtgagtga aaccaccgaa gtcaaggggc aattcgggct agatcagtct 50 <210> 954 <211> 50 <212> DNA <213> Gammatorquevirus sp. <400> 954 aggtgagtga aaccaccgag gtctaggggc aattcgggct agggcagtct 50 <210> 955 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 955 His His His His His His 1 5 <210> 956 <211> 237 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 956 Arg Arg Lys Leu Arg Val Arg Lys Arg Phe Tyr Lys Arg Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Ile Val Leu Lys Gln Phe Gln Pro Lys Ile Ile Arg Arg Cys Thr 20 25 30 Ile Phe Gly Thr Ile Cys Leu Phe Gln Gly Ser Pro Glu Arg Ala Asn 35 40 45 Asn Asn Tyr Ile Gln Thr Ile Tyr Ser Tyr Val Pro Asp Lys Glu Pro 50 55 60 Gly Gly Gly Gly Trp Thr Leu Ile Thr Glu Ser Leu Ser Ser Leu Trp 65 70 75 80 Glu Asp Trp Glu His Leu Lys Asn Val Trp Thr Gln Ser Asn Ala Gly 85 90 95 Leu Pro Leu Val Arg Tyr Gly Gly Val Thr Leu Tyr Phe Tyr Gln Ser 100 105 110 Ala Tyr Thr Asp Tyr Ile Ala Gln Val Phe Asn Cys Tyr Pro Met Thr 115 120 125 Asp Thr Lys Tyr Thr His Ala Asp Ser Ala Pro Asn Arg Met Leu Leu 130 135 140 Lys Lys His Val Ile Arg Val Pro Ser Arg Glu Thr Arg Lys Lys Arg 145 150 155 160 Lys Pro Tyr Lys Arg Val Arg Val Gly Pro Pro Ser Gln Met Gln Asn 165 170 175 Lys Trp Tyr Phe Gln Arg Asp Ile Cys Glu Ile Pro Leu Ile Met Ile 180 185 190 Ala Ala Thr Ala Val Asp Phe Arg Tyr Pro Phe Cys Ala Ser Asp Cys 195 200 205 Ala Ser Asn Asn Leu Thr Leu Thr Cys Leu Asn Pro Leu Leu Phe Gln 210 215 220 Asn Gln Asp Phe Asp His Pro Ser Asp Thr Gln Gly Tyr 225 230 235 <210> 957 <211> 232 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 957 Arg Arg Lys Arg Arg Val Arg Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Pro Leu Lys 1 5 10 15 Gln Trp Gln Pro Pro Tyr Lys Arg Thr Cys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp 20 25 30 Cys Leu Ile Tyr Tyr Ser Asn Leu Arg Leu Gly Met Asn Ser Thr Met 35 40 45 Tyr Glu Lys Ser Ile Val Pro Val His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Phe 50 55 60 Ser Val Ser Met Leu Thr Leu Asp Ala Leu Tyr Asp Ile His Lys Leu 65 70 75 80 Cys Arg Asn Trp Trp Thr Ser Thr Asn Gln Asp Leu Pro Leu Val Arg 85 90 95 Tyr Lys Gly Cys Lys Ile Thr Phe Tyr Gln Ser Thr Phe Thr Asp Tyr 100 105 110 Ile Val Arg Ile His Thr Glu Leu Pro Ala Asn Ser Asn Lys Leu Thr 115 120 125 Tyr Pro Asn Thr His Pro Leu Met Met Met Met Ser Lys Tyr Lys His 130 135 140 Ile Ile Pro Ser Arg Gln Thr Arg Arg Lys Lys Lys Pro Tyr Thr Lys 145 150 155 160 Ile Phe Val Lys Pro Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Trp Tyr Phe Ala 165 170 175 Thr Asp Leu Tyr Lys Ile Pro Leu Leu Gln Ile His Cys Thr Ala Cys 180 185 190 Asn Leu Gln Asn Pro Phe Val Lys Pro Asp Lys Leu Ser Asn Asn Val 195 200 205 Thr Leu Trp Ser Leu Asn Thr Ile Ser Ile Gln Asn Arg Asn Met Ser 210 215 220 Val Asp Gln Gly Gln Ser Trp Pro 225 230 <210> 958 <211> 238 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 958 Arg Arg Arg Arg Arg Trp Arg Lys Arg Pro Thr Val Arg Arg Lys Leu 1 5 10 15 Lys Lys Leu Thr Ile Gln Gln Trp Gln Pro Lys Thr Ile Arg Lys Cys 20 25 30 Cys Ile Gln Gly Leu His Cys Leu Phe Leu Val Thr Glu Asp Thr Ile 35 40 45 Ser Arg Asn Tyr Arg Met Tyr Glu His Ser Tyr Thr Gly Glu Tyr Tyr 50 55 60 Pro Gly Gly Gly Gly Phe Ser Ile Thr Arg Tyr Ser Leu Asp Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Glu Gln His Gln Leu Asp Arg Asn Trp Trp Thr Asn Ser Asn Thr 85 90 95 Asn Leu Pro Leu Val Arg Tyr Thr Gly Cys Lys Ile Lys Phe Tyr Gln 100 105 110 Ser Trp Ser Val Asp Tyr Ile Cys Asn Tyr Ser Leu Thr Trp Pro Met 115 120 125 Val Ala Thr Gln Leu Leu Tyr Gln Ser Cys Gln Pro Ser Phe Met Met 130 135 140 Met Asn Lys Asn Ser Ile Met Ile Pro Ser Lys Leu Thr Lys Pro Ile 145 150 155 160 Lys Lys Gly Tyr Lys Thr Ile Lys Glu Lys Pro Pro His Glu Met Leu 165 170 175 Asn Arg Trp Tyr Phe Ala Lys Asp Leu Ser Lys Val Gly Leu Leu Met 180 185 190 Leu Thr Ala Ala Ser Ala Ser Phe Asp His Tyr Tyr Gln Ala Thr Asp 195 200 205 Ser Leu Ser Asn Asn Cys Thr Phe Glu Ser Leu Asn Pro Tyr Phe Tyr 210 215 220 Met Arg His Asp Phe Ile Leu Phe Pro Val Thr Gly Tyr Val 225 230 235 <210> 959 <211> 238 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 959 Arg Arg Arg Arg Arg Trp Val Arg Arg Lys Pro Phe Tyr Lys Arg Lys 1 5 10 15 Ile Lys Arg Leu Asn Ile Val Glu Trp Gln Pro Lys Ser Ile Arg Lys 20 25 30 Cys Arg Ile Lys Gly Met Leu Cys Leu Phe Gln Thr Thr Glu Asp Arg 35 40 45 Leu Ser Tyr Asn Phe Asp Met Tyr Glu Glu Ser Ile Ile Pro Glu Lys 50 55 60 Leu Pro Gly Gly Gly Gly Phe Ser Ile Lys Asn Ile Ser Leu Tyr Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gln Glu His Ile His Ala His Asn Ile Phe Thr His Thr Asn 85 90 95 Thr Asp Arg Pro Leu Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Ser Leu Lys Phe Tyr 100 105 110 Gln Ser Lys Asp Ile Asp Tyr Val Val Thr Tyr Ser Thr Ser Leu Pro 115 120 125 Leu Arg Ser Ser Met Gly Met Tyr Asn Ser Met Gln Pro Ser Ile His 130 135 140 Leu Met Gln Gln Asn Lys Leu Ile Val Pro Ser Lys Gln Thr Gln Lys 145 150 155 160 Arg Arg Lys Pro Tyr Ile Lys Lys His Ile Ser Pro Pro Thr Gln Met 165 170 175 Lys Ser Gln Trp Tyr Phe Gln His Asn Ile Ala Asn Ile Pro Leu Leu 180 185 190 Met Ile Arg Thr Thr Ala Leu Thr Leu Asp Asn Tyr Tyr Ile Gly Ser 195 200 205 Arg Gln Leu Ser Thr Asn Val Thr Ile His Thr Leu Asn Thr Thr Tyr 210 215 220 Ile Gln Asn Arg Asp Trp Gly Asp Arg Asn Lys Thr Tyr Tyr 225 230 235 <210> 960 <211> 240 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 960 Arg Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg Lys Leu Arg Lys Val Lys Arg 1 5 10 15 Lys Lys Lys Ser Leu Ile Val Arg Gln Trp Gln Pro Asp Ser Ile Arg 20 25 30 Thr Cys Lys Ile Ile Gly Gln Ser Ala Ile Val Val Gly Ala Glu Gly 35 40 45 Lys Gln Met Tyr Cys Tyr Thr Val Asn Lys Leu Ile Asn Val Pro Pro 50 55 60 Lys Thr Pro Tyr Gly Gly Gly Phe Gly Val Asp Gln Tyr Thr Leu Lys 65 70 75 80 Tyr Leu Tyr Glu Glu Tyr Arg Phe Ala Gln Asn Ile Trp Thr Gln Ser 85 90 95 Asn Val Leu Lys Asp Leu Cys Arg Tyr Ile Asn Val Lys Leu Ile Phe 100 105 110 Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Asp Phe Val Leu Ser Tyr Asp Arg Asn Pro 115 120 125 Pro Phe Gln Leu Thr Lys Phe Thr Tyr Pro Gly Ala His Pro Gln Gln 130 135 140 Ile Met Leu Gln Lys His His Lys Phe Ile Leu Ser Gln Met Thr Lys 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu Thr Lys Lys Leu Lys Ile Lys Pro Pro Lys Gln 165 170 175 Met Leu Ser Lys Trp Phe Phe Ser Lys Gln Phe Cys Lys Tyr Pro Leu 180 185 190 Leu Ser Leu Lys Ala Ser Ala Leu Asp Leu Arg His Ser Tyr Leu Gly 195 200 205 Cys Cys Asn Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Tyr Tyr Leu Asn His Gly 210 215 220 Tyr Tyr Thr Ile Thr Asn Trp Gly Ala Gln Ser Ser Thr Ala Tyr Arg 225 230 235 240 <210> 961 <211> 240 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 961 Arg Phe Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Lys Arg Lys Lys Val Arg Arg 1 5 10 15 Lys Leu Lys Lys Ile Thr Ile Lys Gln Trp Gln Pro Asp Ser Val Lys 20 25 30 Lys Cys Lys Ile Lys Gly Tyr Ser Thr Leu Val Met Gly Ala Gln Gly 35 40 45 Lys Gln Tyr Asn Cys Tyr Thr Asn Gln Ala Ser Asp Tyr Val Gln Pro 50 55 60 Lys Ala Pro Gln Gly Gly Gly Phe Gly Cys Glu Val Phe Asn Leu Lys 65 70 75 80 Trp Leu Tyr Gln Glu Tyr Thr Ala His Arg Asn Ile Trp Thr Lys Thr 85 90 95 Asn Glu Tyr Thr Asp Leu Cys Arg Tyr Thr Gly Ala Gln Ile Ile Leu 100 105 110 Tyr Arg His Pro Asp Val Asp Phe Ile Val Ser Trp Asp Asn Gln Pro 115 120 125 Pro Phe Leu Leu Asn Lys Tyr Thr Tyr Pro Glu Leu Gln Pro Gln Asn 130 135 140 Leu Leu Leu Ala Arg Arg Lys Arg Ile Ile Leu Ser Gln Lys Ser Asn 145 150 155 160 Pro Lys Gly Lys Leu Arg Ile Lys Leu Arg Ile Pro Pro Pro Lys Gln 165 170 175 Met Ile Thr Lys Trp Phe Phe Gln Arg Asp Phe Cys Asp Val Asn Leu 180 185 190 Phe Lys Leu Cys Ala Ser Ala Ala Ser Phe Arg Tyr Pro Gly Ile Ser 195 200 205 His Gly Ala Gln Ser Thr Ile Phe Ser Ala Tyr Ala Leu Asn Thr Asp 210 215 220 Phe Tyr Gln Cys Ser Asp Trp Cys Gln Thr Asn Thr Glu Thr Gly Tyr 225 230 235 240 <210> 962 <211> 239 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 962 Gly Arg Arg Thr Tyr Thr Arg Arg Ala Val Arg Arg Arg Arg Arg Pro 1 5 10 15 Arg Lys Arg Leu Val Leu Thr Gln Trp Ser Pro Gln Thr Val Arg Asn 20 25 30 Cys Ser Ile Arg Gly Ile Val Pro Met Val Ile Cys Gly His Thr Lys 35 40 45 Ala Gly Arg Asn Tyr Ala Ile His Ser Glu Asp Phe Thr Thr Gln Ile 50 55 60 Gln Pro Phe Gly Gly Ser Phe Ser Thr Thr Thr Trp Ser Leu Lys Val 65 70 75 80 Leu Trp Asp Glu His Gln Lys Phe Gln Asn Arg Trp Ser Tyr Pro Asn 85 90 95 Thr Gln Leu Asp Leu Ala Arg Tyr Arg Gly Val Thr Phe Trp Phe Tyr 100 105 110 Arg Asp Gln Lys Thr Asp Tyr Ile Val Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro 115 120 125 Phe Lys Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Ala Met Tyr His Pro Gly Met Met 130 135 140 Met Gln Ala Lys Arg Lys Leu Val Val Pro Ser Phe Gln Thr Arg Pro 145 150 155 160 Lys Gly Lys Lys Arg Tyr Arg Val Thr Ile Lys Pro Pro Asn Met Phe 165 170 175 Ala Asp Lys Trp Tyr Thr Gln Glu Asp Leu Cys Pro Val Pro Leu Val 180 185 190 Gln Ile Val Val Ser Ala Ala Ser Leu Leu His Pro Phe Cys Pro Pro 195 200 205 Gln Thr Asn Asn Pro Cys Ile Thr Phe Gln Val Leu Lys Asp Ile Tyr 210 215 220 Asp Glu Cys Ile Gly Val Asn Glu Thr Met Lys Asp Lys Tyr Lys 225 230 235 <210> 963 <211> 240 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 963 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 His Lys Pro Thr Leu Ile Leu Arg Gln Trp Gln Pro Asp Cys Ile Arg 20 25 30 His Cys Lys Ile Thr Gly Trp Met Pro Leu Ile Ile Cys Gly Lys Gly 35 40 45 Ser Thr Gln Phe Asn Tyr Ile Thr His Ala Asp Asp Ile Thr Pro Arg 50 55 60 Gly Ala Ser Tyr Gly Gly Asn Phe Thr Asn Met Thr Phe Ser Leu Glu 65 70 75 80 Ala Ile Tyr Glu Gln Phe Leu Tyr His Arg Asn Arg Trp Ser Ala Ser 85 90 95 Asn His Asp Leu Glu Leu Cys Arg Tyr Lys Gly Thr Thr Leu Lys Leu 100 105 110 Tyr Arg His Pro Glu Val Asp Tyr Ile Val Thr Tyr Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Pro Phe Glu Ile Ser His Met Thr Tyr Leu Ser Thr His Pro Met Leu 130 135 140 Met Leu Leu Asn Lys His His Ile Val Val Pro Ser Leu Lys Thr Lys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Arg Lys Ala Ile Lys Val Arg Ile Arg Pro Pro Lys Leu 165 170 175 Met Asn Asn Lys Trp Tyr Phe Thr Arg Asp Phe Cys Asn Ile Gly Leu 180 185 190 Phe Gln Leu Trp Ala Thr Gly Leu Glu Leu Arg Asn Pro Trp Leu Arg 195 200 205 Met Ser Thr Leu Ser Pro Cys Ile Gly Phe Asn Val Leu Lys Asn Ser 210 215 220 Ile Tyr Thr Asn Leu Ser Asn Leu Pro Gln Tyr Lys Asn Glu Arg Leu 225 230 235 240 <210> 964 <211> 233 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 964 Arg Arg Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Gly Arg Lys Ala Lys Leu Ile 1 5 10 15 Ile Lys Leu Trp Gln Pro Ala Val Ile Lys Arg Cys Arg Ile Lys Gly 20 25 30 Tyr Ile Pro Leu Ile Ile Ser Gly Asn Gly Thr Phe Ala Thr Asn Phe 35 40 45 Thr Ser His Ile Asn Asp Arg Ile Met Lys Gly Pro Phe Gly Gly Gly 50 55 60 His Ser Thr Met Arg Phe Ser Leu Tyr Ile Leu Phe Glu Glu His Leu 65 70 75 80 Arg His Met Asn Phe Trp Thr Arg Ser Asn Asp Asn Leu Glu Leu Thr 85 90 95 Arg Tyr Leu Gly Ala Ser Val Lys Ile Tyr Arg His Pro Asp Gln Asp 100 105 110 Phe Ile Val Ile Tyr Asn Arg Arg Thr Pro Leu Gly Gly Asn Ile Tyr 115 120 125 Thr Ala Pro Ser Leu His Pro Gly Asn Ala Ile Leu Ala Lys His Lys 130 135 140 Ile Leu Val Pro Ser Leu Gln Thr Arg Pro Lys Gly Arg Lys Ala Ile 145 150 155 160 Arg Leu Arg Ile Ala Pro Pro Thr Leu Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Phe 165 170 175 Gln Lys Asp Ile Ala Asp Leu Thr Leu Phe Asn Ile Met Ala Val Glu 180 185 190 Ala Asp Leu Arg Phe Pro Phe Cys Ser Pro Gln Thr Asp Asn Thr Cys 195 200 205 Ile Ser Phe Gln Val Leu Ser Ser Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Ile 210 215 220 Asn Thr Phe Asn Asn Asp Asn Ser Asp 225 230 <210> 965 <211> 233 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 965 Arg Arg Trp Arg Arg Lys Gly Lys Arg Ser Arg Lys Lys Lys Ile Ile 1 5 10 15 Ile Arg Gln Trp Gln Pro Asn Tyr Thr Arg Arg Cys Asn Ile Val Gly 20 25 30 Tyr Met Pro Leu Leu Ile Cys Gly Glu Asn Thr Val Ala Thr Asn Tyr 35 40 45 Ala Thr His Ser Asp Asp Ser Tyr Tyr Pro Gly Pro Phe Gly Gly Gly 50 55 60 Met Thr Thr Asp Lys Phe Thr Leu Arg Ile Leu Tyr Asp Glu Tyr Lys 65 70 75 80 Arg Phe Met Asn Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Glu Asp Leu Asp Leu Cys 85 90 95 Arg Tyr Leu Gly Cys Thr Leu Tyr Val Phe Arg His Pro Glu Val Asp 100 105 110 Phe Ile Ile Ile Ile Asn Thr Ser Pro Pro Phe Leu Asp Thr Glu Ile 115 120 125 Thr Gly Pro Ser Ile His Pro Gly Met Met Ala Leu Asn Lys Arg Ser 130 135 140 Arg Trp Ile Pro Ser Ile Lys Asn Arg Pro Gly Arg Lys His Tyr Ile 145 150 155 160 Lys Ile Lys Val Gly Ala Pro Arg Met Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Pro 165 170 175 Gln Thr Asp Leu Cys Asp Met Thr Leu Leu Thr Ile Phe Ala Ser Ala 180 185 190 Ala Asp Met Gln Tyr Pro Phe Gly Ser Pro Leu Thr Asp Thr Ile Val 195 200 205 Val Ser Phe Gln Val Leu Gln Ser Met Tyr Asn Asp Cys Leu Ser Val 210 215 220 Leu Pro Asp Asn Phe Ala Glu Thr Ser 225 230 <210> 966 <211> 232 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anelloviridae family sequence <400> 966 Arg Arg Trp Lys Arg Lys Gly Arg Arg Arg Arg Lys Ala Lys Ile Ile 1 5 10 15 Ile Arg Gln Trp Gln Pro Asn Tyr Arg Arg Arg Cys Asn Ile Val Gly 20 25 30 Tyr Leu Pro Ile Leu Ile Cys Gly Gly Asn Thr Val Ser Arg Asn Tyr 35 40 45 Ala Thr His Ser Asp Asp Thr Asn Tyr Pro Gly Pro Phe Gly Gly Gly 50 55 60 Met Thr Thr Asp Lys Phe Ser Leu Arg Ile Leu Tyr Asp Glu Tyr Lys 65 70 75 80 Arg Phe Met Asn Tyr Trp Thr Ala Ser Asn Glu Asp Leu Asp Leu Cys 85 90 95 Arg Tyr Leu Gly Cys Thr Phe Tyr Phe Phe Arg His Pro Glu Val Asp 100 105 110 Phe Ile Ile Lys Ile Asn Thr Met Pro Pro Phe Leu Asp Thr Thr Ile 115 120 125 Thr Ala Pro Ser Ile His Pro Gly Leu Met Ala Leu Asp Lys Arg Ala 130 135 140 Arg Trp Ile Pro Ser Leu Lys Asn Arg Pro Gly Lys Lys His Tyr Ile 145 150 155 160 Lys Ile Arg Val Gly Ala Pro Lys Met Phe Thr Asp Lys Trp Tyr Pro 165 170 175 Gln Thr Asp Leu Cys Asp Met Thr Leu Leu Thr Ile Tyr Ala Thr Ala 180 185 190 Ala Asp Met Gln Tyr Pro Phe Gly Ser Pro Leu Thr Asp Thr Val Val 195 200 205 Val Asn Ser Gln Val Leu Gln Ser Met Tyr Asp Glu Thr Ile Ser Ile 210 215 220 Leu Pro Asp Glu Lys Thr Lys Arg 225 230 <210> 967 <211> 170 <212> PRT <213> Beak and feather disease virus <400> 967 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Phe Ser Thr Asn Arg Ile Tyr Thr Leu Arg 1 5 10 15 Leu Thr Arg Gln Phe Gln Phe Lys Ile Asn Lys Gln Leu Ile Phe Asn 20 25 30 Ala Asp Tyr Ile Thr Phe Ala Leu Asp Asp Phe Leu Gln Ala Val Pro 35 40 45 Asn Pro His Thr Leu Asn Phe Glu Asp Tyr Arg Ile Lys Leu Ala Lys 50 55 60 Met Glu Met Arg Pro Thr Gly Gly His Tyr Thr Gly Phe Gly His Thr 65 70 75 80 Ala Val Ile Gln Asp Ser Arg Ile Thr Arg Phe Lys Thr Thr Ala Asp 85 90 95 Pro Leu Ala Pro Phe Asp Gly Ala Lys Lys Trp Phe Val Ser Arg Gly 100 105 110 Phe Lys Arg Leu Leu Arg Pro Lys Pro Gln Ile Thr Ile Glu Gly Pro 115 120 125 Asn Ser Ala Gly Thr Lys Val Arg His Tyr Gly Ile Ala Phe Ser Phe 130 135 140 Pro Gln Pro Glu Gln Thr Val Thr Lys Leu Thr Leu Tyr Val Gln Phe 145 150 155 160 Arg Gln Phe Ala Pro Asn Asn Pro Ser Thr 165 170 <210> 968 <211> 179 <212> PRT <213> Orthohepevirus A <400> 968 Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr 1 5 10 15 Ser Ser Val Ala Ser Gly Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro Leu 20 25 30 Asn Pro Leu Leu Pro Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met Ala 35 40 45 Thr Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Val Arg Ala Thr Ile 50 55 60 Arg Tyr Arg Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Ser Ile Ser Phe Trp Pro 65 70 75 80 Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp Met Asn Ser Ile Thr Ser 85 90 95 Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly Ile Ala Ser Glu Leu Val 100 105 110 Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Thr Arg Thr Gly Val Ala Glu 115 120 125 Glu Glu Ala Thr Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro 130 135 140 Val Asn Ser Ala Leu Gly Leu Leu Asp Phe Ala Leu Glu Leu Glu Phe 145 150 155 160 Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr Asn Thr Arg Val Ser Arg Tyr Thr 165 170 175 Ser Thr Ala

Claims (9)

  1. 아넬로벡터로서,
    a) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부;
    b) RNA를 포함하는 유전 요소를 포함하며,
    유전 요소는 단백질성 외부 내에 봉입되는, 아넬로벡터.
  2. 제1항에 있어서, 유전 요소는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% RNA로 이루어지는, 아넬로벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, RNA는 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는, 아넬로벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전 요소는 RNA로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는, 아넬로벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전 요소는 DNA 영역을 포함하는, 아넬로벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 영역의 적어도 일부는 유전 요소의 RNA의 적어도 일부에 혼성화되는, 아넬로벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유전 요소는 환형인, 아넬로벡터.
  8. 아넬로벡터의 제조 방법으로서,
    (a) 다음을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계:
    (i) RNA를 포함하는 유전 요소, 및
    (ii) ORF1 분자; 그리고
    (b) ORF1 분자를 포함하는 단백질성 외부 내에 유전 요소를 봉입하기에 적합한 조건 하에서 혼합물을 항온처리하며, 이에 따라 아넬로벡터를 제조하는 단계를 포함하며;
    선택적으로 혼합물은 세포에 포함되지 않는, 방법.
  9. 유전 요소를 세포에 운반하는 방법으로서,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 아넬로벡터를 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020237025029A 2020-12-23 2021-12-22 Rna를 봉입하는 아넬로바이러스 캡시드의 시험관 내어셈블리 KR20230124682A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063130360P 2020-12-23 2020-12-23
US63/130,360 2020-12-23
US202163147064P 2021-02-08 2021-02-08
US63/147,064 2021-02-08
PCT/US2021/064887 WO2022140560A1 (en) 2020-12-23 2021-12-22 In vitro assembly of anellovirus capsids enclosing rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230124682A true KR20230124682A (ko) 2023-08-25

Family

ID=82160089

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237025029A KR20230124682A (ko) 2020-12-23 2021-12-22 Rna를 봉입하는 아넬로바이러스 캡시드의 시험관 내어셈블리

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220372519A1 (ko)
EP (1) EP4267157A1 (ko)
JP (1) JP2024501287A (ko)
KR (1) KR20230124682A (ko)
AU (1) AU2021409952A1 (ko)
BR (1) BR112023012460A2 (ko)
CA (1) CA3206361A1 (ko)
IL (1) IL303892A (ko)
MX (1) MX2023007643A (ko)
TW (1) TW202235622A (ko)
WO (1) WO2022140560A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202334423A (zh) * 2021-12-15 2023-09-01 美商旗艦先鋒創新公司 表面經修飾之病毒顆粒及模組化之病毒顆粒

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU722624B2 (en) 1996-09-06 2000-08-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
JP5243789B2 (ja) 2004-03-15 2013-07-24 シティ・オブ・ホープ 二本鎖ｒｎａによる遺伝子発現の特異的阻害のための方法及び組成物
WO2010080129A2 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
US20100249214A1 (en) 2009-02-11 2010-09-30 Dicerna Pharmaceuticals Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
CN107522775A (zh) * 2009-08-21 2017-12-29 弗吉尼亚理工大学知识产权公司 猪细环病毒的疫苗和诊断
EP2653562A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-23 Institut Pasteur Anellovirus genome quantification as a biomarker of immune suppression
EP4289948A3 (en) 2012-05-25 2024-04-17 The Regents of the University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
KR102052286B1 (ko) 2012-10-23 2019-12-06 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
CN105658796B (zh) 2012-12-12 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
ES2536353T3 (es) 2012-12-12 2015-05-22 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
SG10201912327SA (en) 2012-12-12 2020-02-27 Broad Inst Inc Engineering and Optimization of Improved Systems, Methods and Enzyme Compositions for Sequence Manipulation
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
JP2020524993A (ja) * 2017-06-13 2020-08-27 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド クロンを含む組成物及びその使用
CA3084824A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
US11166996B2 (en) * 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
EP4267157A1 (en) 2023-11-01
AU2021409952A1 (en) 2023-07-06
US20220372519A1 (en) 2022-11-24
JP2024501287A (ja) 2024-01-11
CA3206361A1 (en) 2022-06-30
TW202235622A (zh) 2022-09-16
WO2022140560A1 (en) 2022-06-30
BR112023012460A2 (pt) 2023-11-07
IL303892A (en) 2023-08-01
MX2023007643A (es) 2023-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210125990A (ko) 단백질 대체 치료 양식을 운반하기 위한 아넬로좀
KR20210131310A (ko) 아넬로좀 및 사용 방법
KR20210131309A (ko) 분비형 치료 양식을 운반하기 위한 아넬로좀
KR20230124682A (ko) Rna를 봉입하는 아넬로바이러스 캡시드의 시험관 내어셈블리
KR20210131308A (ko) 세포내 치료 양식을 운반하기 위한 아넬로좀
US20230340527A1 (en) Baculovirus expression systems
AU2021372533A9 (en) Chicken anemia virus (cav)-based vectors
CN116887865A (zh) 包封rna的指环病毒衣壳的体外组装
KR20230146560A (ko) 하이브리드 aav-아넬로벡터
US20240254512A1 (en) Anellovectors and methods of use
KR20230041686A (ko) 아넬로바이러스를 확인 및 특징화하는 방법 및 이의 용도
KR20230036110A (ko) 탠덤 아넬로바이러스 구축물