JPWO2008032450A1

JPWO2008032450A1 - 脂肪肝の予防剤および／または治療剤

Info

Publication number: JPWO2008032450A1
Application number: JP2008534244A
Authority: JP
Inventors: 一和中尾; 伊藤　裕; 裕伊藤; 和季宮下; 拓洋園山; 尚久田村
Original assignee: Kyoto University; Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Kyoto University; Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2010-01-21
Also published as: WO2008032450A1; TW200833356A

Abstract

本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する脂肪肝予防剤および／または治療剤に関する。本発明の医薬は、脂肪肝を予防・治療できるだけでなく、肥満や糖尿病などに代表されるメタボリックシンドロームも予防できる。

Description

本発明は、脂肪肝の予防剤および／または治療剤に関する。

健康診断で異常検査所見とされる項目の中で、肝機能障害は高脂血症に次いで多く、その肝機能障害の大部分は脂肪肝となっている。脂肪肝とは、肝細胞内に中性脂肪を主とした脂質が貯留して重量比で５％以上となった状態である。なお、中性脂肪とは、グリセリンの脂肪酸エステル（トリアシルグリセロール）である。脂質が５％以上となると、肝小葉の肝細胞（肝実質細胞）の３分の１以上に脂肪滴が現れる。脂肪肝の原因としては、飲酒、肥満、糖尿病、薬物など様々なものがあるが、その成因によりアルコール性脂肪肝と非アルコール性脂肪肝に大別されている。非アルコール性脂肪肝は、糖尿病、高脂血症、肥満等の生活習慣病の増加に伴い増加している。

アルコール性脂肪肝は、肝炎、肝硬変、肝臓癌へと進行する可能性が高く、その治療法としては禁酒を中心としたものとなる。一方、非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ：ＮＡＦＬＤ）は、従来、食事療法や運動療法で改善され特に重篤な疾患へ移行することのない可逆的なものが多いとされてきたが、近年、治療せず放置すると肝機能が低下し、肝硬変などへ進展する危険性もあることが指摘されている。とりわけ、ＮＡＦＬＤのうち、炎症を伴う非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｌｉｃｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＳＨ）は、肝組織学的にアルコール性肝炎に類似した炎症を認め、肝硬変から肝細胞癌へ進行する危険性が高い疾患であることがわかってきている。したがって、これまでに増して、ＮＡＦＬＤ、特に、ＮＡＳＨを適切に治療することは医療上非常に重要な課題であると考えられている。

一方、メタボリックシンドロームは、内臓脂肪（腹腔内脂肪）の蓄積に加え、インスリン抵抗性、脂質異常、高血圧等の心血管病に対する複数のリスクが合併した症候群であり、過栄養を基礎とした内臓脂肪の蓄積がもたらす種々の生活習慣病につながる病態であると理解されている。メタボリックシンドロームの患者においては、非メタボリックシンドローム患者と比較して高頻度でＮＡＳＨを含むＮＡＦＬＤが観察され、多くの患者がＮＡＳＨを含むＮＡＦＬＤを併発していることが知られている。

すなわち、非アルコール性脂肪肝の患者は、肥満、高血圧、糖尿病や高脂血症などの基礎疾患を併発したメタボリックシンドロームを伴う場合があり、このような患者においては、脂肪肝の治療のみではなく、それらの基礎疾患の治療も必要となる場合がある。したがって、脂肪肝の治療には、このような基礎疾患に悪影響を及ぼすことがない薬物、さらにはこれらの基礎疾患を同時に治療し得る薬物を使用することが望ましい。

脂肪肝の食事療法としては、飲酒制限、カロリー制限および低脂肪・高蛋白食の摂取が中心であり、運動療法としては、有酸素運動などにより脂肪をエネルギーとして消費する方策が取られる。その際、脂肪肝は拒食症などの栄養障害でも引き起こされることが知られているように、極端な食事制限を行うと筋肉を落として逆に脂肪を増やすことから急激な体重減少は好ましくなく、１〜２ｋｇ／月程度の減量が望ましい。このように、脂肪肝の治療はコントロールされた食事とかなりの長時間の有酸素運動による根気の必要なものとなる。

現代人の生活は、ストレスと飽食に満ちたものとなっており、脂肪肝を引き起こしやすい状況となっていることから、上記のような根気の要る脂肪肝の治療法に代わって、あるいはそれと併用することのできる新たな治療法が望まれる。

ところで、肥満や高血圧の患者においては、心臓や腎臓などの循環器系器官に過度な負担がかかっている。そのような状況においては、ナトリウム利尿ペプチドと称されるペプチドの産生・分泌が亢進し、循環器系器官への負担を和らげる代償作用が働いていることはよく知られている。ナトリウム利尿ペプチドと称されるペプチドには、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）が知られている。ＡＮＰは、心房細胞で産生され分泌されるアミノ酸２８個から成る環状構造を有するペプチドであり、腎臓では利尿作用を示し、血管では血管平滑筋を弛緩・拡張する。ＡＮＰは、さらにレニン・バソプレシン・アルドステロン系に対して拮抗的に作用する。これらの作用は、総合的に血圧の低下や体液量の低減などを通じて心臓の負担を軽減する方向に働く。ＢＮＰは、アミノ酸３２個から成る環状構造を有するペプチドであり、主に心室細胞で産生され分泌されてＡＮＰと同様な作用を有する。ＡＮＰとＢＮＰは、ともにグアニレートシクラーゼドメインを有する受容体ＮＰＲ−Ａ（別名、ＧＣ−Ａ）に結合して、ｃＧＭＰの産生を促進して上記の作用を発現する。実際、ＡＮＰはうっ血性心不全などにおいて心房膨満圧の上昇に伴い分泌が促進され、上記の作用によりうっ血性心不全などの症状を軽減する働きをしている。ＢＮＰも心筋梗塞などの際に、分泌が促進され、上記の作用により心筋梗塞などに伴う諸症状を和らげる働きをしている（非特許文献１）。

最近になって、脂肪組織においてもナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａの発現が確認されて、ＡＮＰやＢＮＰは心血管系に作用するばかりではなく、脂肪分解の促進にも関与しているという報告がある（非特許文献２）。ＡＮＰやＢＮＰの脂肪分解促進作用は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａの細胞内部分に存在するグアニレートシクラーゼにより産生されたｃＧＭＰがｃＧＭＰ依存性のプロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）に作用し、ホルモン感受性リパーゼのリン酸化を促進して活性化することによると考えられている。活性化されたホルモン感受性リパーゼは、トリグリセリドを遊離脂肪酸に加水分解する。しかしながら、上記のような脂肪組織に対するナトリウム利尿ペプチドの作用は若年男子における肥満には関与していないことが報告されている（非特許文献３）。また、ＡＮＰやＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドによる脂肪組織における脂肪分解の促進作用が肝細胞にどのような影響を及ぼすかについては知られていない。すなわち、脂肪組織とは本質的に異なる肝細胞においてＡＮＰやＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドが脂肪の蓄積や代謝に直接的にまたは間接的に及ぼす作用については何ら明らかにされていない。実際、最近のナトリウム利尿ペプチドに関する総説においても、心血管系疾患への治療上の応用に関しては詳細に記載されているが、脂肪肝の予防および／または治療への応用については何ら示唆されていない（非特許文献４）。
ＥｕｒｏｐｅａｎＪ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３５巻，２６５頁，１９９６年ＦＡＳＥＢ，１４巻，１３４５頁，２０００年Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，４２巻，５３６頁，２００１年ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗ，２７巻，４７頁，２００６年

本発明においては、脂肪肝の予防および／または治療に有用な薬剤を見出すことが課題である。さらには、心筋梗塞などの心血管系の疾患を引き起こす可能性が高いメタボリックシンドロームの患者において、脂肪肝の予防および／または治療に有用な薬剤を見出すことが課題である。

本発明者等は、脂肪肝を予防および／または治療することができる薬剤について、さらには心筋梗塞などの心血管系の疾患を引き起こす可能性が高いメタボリックシンドロームに伴う脂肪肝（または、メタボリックシンドロームを伴う脂肪肝）を予防および／または治療することができる薬剤について鋭意検討した結果、ナトリウム利尿ペプチドが体重減少、内臓脂肪の減少、耐糖能の改善、および脂肪肝の抑制作用を有することを見出した。さらには、ｃＧＭＰ依存性のプロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の活性化により、ナトリウム利尿ペプチドと同様に、体重減少、内臓脂肪の減少、耐糖能の改善、および脂肪肝の抑制作用を有することを見出して、本発明を完成した。

具体的には、ＢＮＰを連続投与した状況に擬して、肝臓特異的にＢＮＰを過剰発現させたマウス（以下、ＢＮＰ−Ｔｇマウス）を作製し、高脂肪食を与えてＢＮＰの効果を検討した結果、野生型のマウスに比してＢＮＰ−Ｔｇマウスでは体重増加、内臓脂肪の増加、肝重量増加、および肝の中性脂肪増加が有意に抑制されることを見出した。また、高脂肪食を与えたＢＮＰ−Ｔｇマウスにおいて、糖負荷やインスリン投与時に野生型のマウスに比して血糖値の上昇が有意に軽減されることから、ナトリウム利尿ペプチドが耐糖能やインスリン感受性も改善させることを見出した。

さらには、ナトリウム利尿ペプチドがナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａに作用して産生されるｃＧＭＰにより活性化されるｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）を全身性に過剰発現させたマウス（以下、ｃＧＫ−Ｔｇマウス）に高脂肪食を与えた結果、ＢＮＰ−Ｔｇマウスにおけると同様に、野生型のマウスに比して体重増加、内臓脂肪の増加、肝重量増加、および肝の中性脂肪増加が有意に抑制されることを見出した。また、高脂肪食を与えたｃＧＫ−Ｔｇマウスにおいて、糖負荷やインスリン投与時に野生型のマウスに比して血糖値の上昇が有意に軽減されることから、ｃＧＫＩの活性化が耐糖能やインスリン感受性も改善させることを見出した。また、ＧＣ−Ａヘテロノックアウトマウスに高脂肪食を与えた結果、野生型のマウスに比して肥満、脂肪肝形成が大きく、耐糖能障害の程度も大きいことを見出した。

これらの結果は、ＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドを投与することにより、脂肪肝を予防および／または治療できることを示すばかりではなく、肥満や糖尿病などに代表されるメタボリックシンドロームに伴う脂肪肝（または、肥満や糖尿病などに代表されるメタボリックシンドロームを伴う脂肪肝）を予防および／または治療できることを示す。さらに、メタボリックシンドロームや肥満を予防および／または治療できることを示す。さらに、たとえばＡＮＰのようにＢＮＰ同様ＧＣ−Ａのアゴニストとして機能することが知られている化合物に、ＢＮＰと同様の効果があることを示していると考える。同様に、ｃＧＫＩが活性化されることにより脂肪肝を予防および／または治療できることを示すばかりではなく、肥満や糖尿病などに代表されるメタボリックシンドロームに伴う脂肪肝（または、肥満や糖尿病などに代表されるメタボリックシンドロームを伴う脂肪肝）を予防および／または治療できることを示す。さらに、メタボリックシンドロームや肥満を予防できることを示す。

したがって、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを投与することによる脂肪肝の予防および／または治療方法を提供する。
また、本発明は、ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の活性化剤を投与することによる脂肪肝の予防および／または治療方法を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドの遺伝子を含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤を提供する。
また、本発明は、ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の遺伝子を含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤を提供する。
また、本発明は、ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の活性化剤を含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有するメタボリックシンドローム患者の脂肪肝の予防剤および／または治療剤を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する脂肪肝の治療用キットを提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有するメタボリックシンドロームの予防剤および／または治療剤を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する肥満の予防剤および／または治療剤を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドの遺伝子の、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用を提供する。
また、本発明は、ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の遺伝子の、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストの、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用を提供する。
また、本発明は、ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の活性化剤の、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストの、メタボリックシンドローム患者の脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストの、メタボリックシンドロームの予防剤および／または治療剤製造のための使用を提供する。
また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストの、肥満の予防剤および／または治療剤製造のための使用を提供する。

本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する医薬を用いて脂肪肝の予防および／または治療を可能とする。また、本発明は、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する医薬を用いて、メタボリックシンドロームに伴う脂肪肝（または、メタボリックシンドロームを伴う脂肪肝）の予防および／または治療を可能とする。さらに、メタボリックシンドロームや肥満の予防および／または治療を可能とする。

高脂肪食を投与した時のＢＮＰ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの体重推移を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のＢＮＰ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの肝重量を示すグラフである。標準食と高脂肪食を投与した時のＢＮＰ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの肝臓の中性脂肪含量を示すグラフである。標準食と高脂肪食を投与したときのＢＮＰ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの、皮下脂肪組織重量（Ａ）、腸間膜脂肪組織重量（Ｂ）、総脂肪組織重量（Ｃ）ならびに高脂肪食を投与したときのＢＮＰ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの皮下脂肪組織を構成する脂肪細胞の平均面積（Ｄ）を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のＢＮＰ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの耐糖能を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のＢＮＰ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスのインスリン感受性を示すグラフである。標準食と高脂肪食を投与した時のｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの体重推移を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの肝重量を示すグラフである。標準食と高脂肪食を投与した時のｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの肝臓の中性脂肪含量を示すグラフである。標準食と高脂肪食を投与したときのｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの、皮下脂肪組織重量（Ａ）、腸間膜脂肪組織重量（Ｂ）、総脂肪組織重量（Ｃ）ならびに高脂肪食を投与したときのｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの皮下脂肪組織を構成する脂肪細胞の平均面積（Ｄ）を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスの耐糖能を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型（Ｗｔ）マウスのインスリン感受性を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型マウスの肩甲骨間褐色脂肪組織における遺伝子（ＰＧＣ−１αおよびＵＣＰ−１）発現を示すグラフである（夫々の遺伝子発現レベルのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子発現レベルに対する比を、野生型を１００％として表示している。＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ．野生型。）。高脂肪食を投与した時のｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型マウスの大腿四頭筋における遺伝子（ＰＧＣ−１、ＵＣＰ−２、ＵＣＰ−３、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲδ）発現を示すグラフである（夫々の遺伝子発現レベルのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子発現レベルに対する比を、野生型を１００％として表示している。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ．野生型。）。高脂肪食を投与した時のｃＧＫ−Ｔｇマウスと野生型マウスの肝臓における遺伝子（ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲδ）発現を示すグラフである（夫々の遺伝子発現レベルのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子発現レベルに対する比を、野生型を１００％として表示している。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ．野生型。）。高脂肪食を投与した時のＧＣ−Ａ^＋／−マウスと野生型マウスの体重推移を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のＧＣ−Ａ^＋／−マウスと野生型マウスの２０週齢時の体重、肝臓重量体重比および肝臓中性脂肪含量を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のＧＣ−Ａ^＋／−マウスと野生型マウスの総脂肪重量を示すグラフである。高脂肪食を投与したときのＧＣ−Ａ^＋／−マウスと野生型マウスの１８週齢時の摂餌量を示すグラフである。高脂肪食を投与した時のＧＣ−Ａ^＋／−マウスと野生型マウスの１８週齢時の腹腔内投与糖負荷試験結果を示すグラフである。

本発明は、脂肪肝の予防および／または治療を目的とするものであるが、その対象患者は、他の基礎疾患のない脂肪肝の患者であってもよく、また、例えばメタボリックシンドロームに伴う脂肪肝（または、メタボリックシンドロームを伴う脂肪肝）の患者であってもよい。また、本発明は、メタボリックシンドロームの患者や肥満の患者を治療対象としてもよい。

本発明で使用するナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストについては、ＧＣ−Ａに結合し、そのグアニレートシクラーゼを活性化する作用を有する化合物であれば、特に限定はなく用いることができるが、代表的なものとしてナトリウム利尿ペプチドが挙げられる。ナトリウム利尿ペプチドとしては、ＡＮＰやＢＮＰが代表的なものであるが、これらのナトリウム利尿ペプチドに限定されるものではなく、それらのアミノ酸配列の１ないし複数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものでもよく、また、それらのアミノ酸配列の１ないし複数のアミノ酸が欠失したものでもよく、また、アミノ酸配列の１ないし複数のアミノ酸が欠失するとともにアミノ酸配列の１ないし複数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものでもよく、さらには、化学合成的に１ないし複数のアミノ酸が人工的なアミノ酸類似のものに置換されたものでもよい。また、化学合成や天然物由来の低分子の化合物であってもよい。

ＡＮＰとしては、例えばＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１８巻，１３１頁，１９８４年に記載のヒト由来α−ｈＡＮＰを用いることができ、このＡＮＰは、一般名カルペリチド（ｃａｒｐｅｒｉｔｉｄｅ）として販売（商品名：ハンプ、ＨＡＮＰ）されている。α−ｈＡＮＰは、一般的にはＨｕｍａｎｐｒｏ−ＡＮＰ［９９−１２６］としても知られている。また、ＢＮＰとしては、例えばＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５９巻，１４２０頁，１９８９年に記載のヒトＢＮＰを用いることができ、このＢＮＰは一般名ネシリチド（ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）として販売（商品名：ナトレコール、Ｎａｔｒｅｃｏｒ）されている。

ナトリウム利尿ペプチドの１ないし複数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された例としては、例えば、ヒトＡＮＰの１２位のＭｅｔがＩｌｅに置換されたラットα−ｒＡＮＰ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２１巻，５８５頁，１９８４年）が挙げられる。また、１ないし複数のアミノ酸が欠失した例としては、例えば、Ｎ末のＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒが欠失したＡＮＰが挙げられる。この様なＡＮＰまたはＢＮＰ誘導体に関しては、例えば、ＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗ，１０巻，１１５頁，１９９０年に記載されている一連の誘導体が挙げられ、それらは引用されている文献に記載の方法により入手または製造可能である。
また、アミノ酸配列の１ないし複数のアミノ酸が欠失するとともにアミノ酸配列の１ないし複数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された例としては、例えば、１５アミノ酸残基から成るｍｉｎｉ−ＡＮＰ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０巻，１６５７頁，１９９５年）が挙げられる。

上記のＡＮＰ、ＢＮＰ、およびそれらの誘導体は、遺伝子工学的・細胞工学的な手法を用いて生産したものであってもよく、化学合成したものであってもよく、さらにはそれらを酵素処理や化学処理してアミノ酸残基を修飾またはアミノ酸配列の一部を除去したものであってもよい。

ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−ＡのアゴニストとしてのＡＮＰやＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドは、薬学的に許容される塩としてもよく、例えば塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩としてもよく、あるいはギ酸、酢酸、酪酸、コハク酸、クエン酸等の有機酸との塩としてもよい。また、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム等の金属塩としてもよく、トリエチルアミン等の有機塩基との塩としてもよい。また、ＡＮＰやＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドまたはそれらの塩は、薬学的に許容される賦形剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、希釈剤などと混合して静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経鼻投与、経肺投与、舌下投与等の非経口的な投与方法で投与することが好ましい。また、これらのナトリウム利尿ペプチドまたはその塩は、リポソームやマイクロカプセルに封入して非経口的に投与してもよく、徐放製剤として患者の体内に埋め込んでもよい。

ＡＮＰやＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドまたはそれらの塩を投与する場合には、例えば凍結乾燥製剤を注射用水に溶解して微量輸液ポンプ（それがない場合には、小児用微量輸液セット）を用いて連続投与すればよい。ナトリウム利尿ペプチドは、前述のように血管を弛緩・拡張し血圧を低下させる作用を有することから、脂肪肝の予防および／または治療に当たっては、血圧を必要以上に低下させない速度で投与することが好ましく、投与時および投与直後には血圧をモニターすることが推奨される。ＡＮＰやＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドまたはそれらの塩の１日の投与量は、０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、０．５μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇが好ましい。投与方法について詳細に述べるならば、ＡＮＰを投与する場合には、例えば、ＡＮＰの１０００μｇを注射用水１０ｍＬに溶解し、“体重×０．０６ｍＬ／時間”の速度（０．１μｇ／ｋｇ／分の投与速度）で投与することが考えられる。投与速度は、上記の速度に限られることなく、その１／２または１／４の速度でもよい。ＢＮＰを投与する場合には、２μｇ／ｋｇをボーラス投与した後、０．０１μｇ／ｋｇを連続投与することが考えられる。この場合にも、血圧を必要以上に低下させない速度で投与することが好ましく、投与時および投与直後には血圧をモニターすることが推奨される。ＡＮＰやＢＮＰが上記の投与速度で血圧や心拍数等に大きな影響を与えない場合には、さらに投与速度を上げてもよい。なお、その他のＡＮＰ誘導体またはＢＮＰ誘導体に関しては、その活性と持続性を考慮して、投与速度を決定すればよい。

また、上記のいずれの薬剤を使用する場合にも、投与期間は、脂肪肝の治療効果が得られるまでとすることが好ましく、継続的に投与してもよく、また間欠的に投与してもよい。脂肪肝の治療効果は、血液学的な検査で血中の中性脂肪、コレステロール値、ＧＯＴ、ＧＰＴを測定することでもよいが、超音波検査やＣＴ検査により判断することが好ましい。

また、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する脂肪肝の治療用キットとしては、ＡＮＰやＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドまたはそれらの塩を凍結乾燥製剤として封入したバイアルとそれを溶解するための注射用水を組み合わせてキットとしたものが挙げられ、また溶解・投与に使用する注射用シリンジをそれらに組み合わせてもよく、さらには微量輸液ポンプや小児用微量輸液セットを組み合わせてもよい。

ｃＧＫＩの活性化剤としては、ｃＧＭＰそのものを用いることもできるが、安定な８−ブロモｃＧＭＰ等の化学合成されたｃＧＭＰ誘導体を用いてもよく、さらには８−ブロモｃＧＭＰを分解するホスホジエステラーゼに対する安定性を増強させた誘導体（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８７巻，１９９頁，２０００年）を用いてもよい。また、このようなｃＧＭＰ誘導体とは異なる化学構造を有する低分子のｃＧＫＩの活性化剤を用いてもよい。

ＡＮＰの遺伝子としては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６巻，１２０６頁，１９８４年に記載されているものを用いればよい。また、ＢＮＰの遺伝子としては、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５巻，６５０頁，１９８９年に記載されているものを用いればよい。ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の遺伝子としては、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２７巻，５５２頁，１９９６年に記載されているｃＤＮＡを用いればよい。上記の遺伝子を用いて治療を行う場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスあるいは人工ベクターをベクターとして用いて、筋肉注射や局所注射により遺伝子を導入すればよい。また、上記のようなベクターを使用せず、プラスミドの形で遺伝子を導入してもよい。具体的な遺伝子治療の方法については、実験医学，１２巻，３０３頁，１９９４年に記載の方法またはそれに引用されている文献の方法等を用いればよい。

本発明の脂肪肝の予防や治療は、その成因によらず脂肪肝全般について適用できるが、メタボリックシンドロームにより誘発される脂肪肝の予防や治療に好適に用いることができる。また、ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する上記の脂肪肝の予防や治療に関する記載は、メタボリックシンドロームや肥満の予防や治療においても同様である。

以下に試験例を示して本発明を説明する。

［試験例１］
野生型マウスと肝臓特異的にＢＮＰを過剰発現させたマウス（以下、ＢＮＰ−Ｔｇマウス）に標準食と高脂肪食を与えて、脂肪肝の進展抑制作用を検討した。ＢＮＰ−Ｔｇマウスは、Ｊ．ＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔ．，９３巻、１９１１頁，１９９４年に記載の方法で作製した。
標準食と高脂肪食（熱量比で６０％：Ｒｅｓｅａｒｃｈｄｉｅｔ社、カタログ番号：Ｄ１２４９２）を各々１０週齢以降の野生型マウスおよびＢＮＰ−Ｔｇマウス（各１０匹）に１０週間与えた。体重は、６週齢から１週間ごとに測定した。標準食と高脂肪食の投与終了後、肝臓を摘出し、その重量を測定した。また、肝臓をホモジナイズした後、クロロフォルム・メタノール法で脂質を抽出し、中性脂肪測定キット（和光純薬工業、カタログ番号：４３２−４０２０１）を用いて肝臓内の中性脂肪含量を測定した。
さらに、皮下および腸間膜の脂肪組織を分離し、その重量を測定した。さらに採取した皮下脂肪組織から組織切片を作成し、これをＨＥ染色に付し、マウス一匹につき４視野（１００倍視野）観察し、脂肪細胞の平均面積を計測した。

＜結果＞
標準食投与群では、野生型マウス（Ｗｔ）とＢＮＰ−Ｔｇマウスの体重に差はなかったが、高脂肪食投与群では、ＢＮＰ−Ｔｇマウスの体重は野生型マウスに比較して高脂肪食投与開始３週後より有意に低値を示した（図１）。
また、高脂肪食投与群では、ＢＮＰ−Ｔｇマウスの肝重量と肝臓内の中性脂肪含量が野生型マウスに比較して有意に低い値を示した（図２および図３）。
高脂肪食投与群では、ＢＮＰ−Ｔｇマウスの皮下脂肪組織量、腸間膜脂肪組織量はそれぞれ正常マウスと比して少なかった。さらに、皮下脂肪組織と腸間膜脂肪組織を合計した脂肪組織総重量は、標準食、高脂肪食、いずれを給餌した場合においても、ＢＮＰ−Ｔｇマウスの方が少なかった（図４Ａ−Ｃ）。さらに、高脂肪食投与群の腸間膜脂肪組織の脂肪細胞の平均面積は、ＢＮＰ―Ｔｇマウスの方が有意に少なかった。（図４Ｄ）

［試験例２］
１０週齢以降の野生型マウス（１２匹）およびＢＮＰ−Ｔｇマウス（８匹）に熱量比で６０％の高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈｄｉｅｔ社、カタログ番号：Ｄ１２４９２）をそれぞれ１０週間与えた。２４時間絶食後、ブドウ糖１．０ｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、ブドウ糖投与前、投与後１５分、３０分、６０分、１２０分における血糖値を測定した。
また、上記と同様に高脂肪食を与えたマウスを６時間絶食後、インスリン０．７５Ｕ／ｋｇを腹腔内に投与し、インスリン投与前、投与後１５分、３０分、６０分、１２０分における血糖値を測定した。
血液は尾静脈より採取し、デキスターＺＩＩ（バイエル社）を用いて血糖値を測定した。

＜結果＞
ＢＮＰ−Ｔｇマウスの血糖値は、野生型マウスに比較して、ブドウ糖投与後およびインスリン投与後に有意に低い値を示した（図５および図６）。この結果は、ＢＮＰ−Ｔｇマウスにおいて耐糖能およびインスリン感受性が改善されていることを示唆する。

［試験例３］
野生型マウスと全身性にｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩを過剰発現させたマウス（以下、ｃＧＫ−Ｔｇマウス）に標準食と高脂肪食を与えて、脂肪肝の進展抑制作用を検討した。ｃＧＫ−Ｔｇマウスは、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００巻、３４０４頁，２００３年に記載の方法で作製した。
標準食と高脂肪食（熱量比で６０％：Ｒｅｓｅａｒｃｈｄｉｅｔ社、カタログ番号：Ｄ１２４９２）を１０週齢以降の野生型マウスおよびｃＧＫ−Ｔｇマウス（各１２匹）にそれぞれ１０週間与えた。体重は、６週齢から１週間ごとに測定した。高脂肪食投与終了後、肝臓を摘出し、その重量を測定した。また、肝臓をホモジナイズした後、クロロフォルム・メタノール法で脂質を抽出し、中性脂肪測定キット（和光純薬工業、カタログ番号：４３２−４０２０１）を用いて肝臓内の中性脂肪含量を測定した。さらに、試験例１と同様の方法で、各脂肪組織の重量と脂肪細胞の平均面積を計測した。

＜結果＞
標準食投与群および高脂肪食投与群において、ｃＧＫ−Ｔｇマウスの体重は、野生型マウスに比較して有意に低い値を示した（図７）。
また、高脂肪食を投与したｃＧＫ−Ｔｇマウスにおいては、野生型マウスに比較して肝重量と肝臓内の中性脂肪含量が有意に低い値を示した（図８および図９）。皮下脂肪組織重量、腸間膜脂肪組織重量さらにそれらの合計である、総脂肪組織重量いずれについても、食事の内容によらず、ｃＧＫ−Ｔｇマウスの方が低い値を示した（図１０Ａ−Ｄ）。

［試験例４］
１０週齢以降の野生型マウスおよびｃＧＫ−Ｔｇマウス（各８匹）に熱量比で６０％の高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈｄｉｅｔ社、カタログ番号：Ｄ１２４９２）をそれぞれ１０週間与えた。２４時間絶食後、ブドウ糖１．０ｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、ブドウ糖投与前、投与後１５分、３０分、６０分、１２０分における血糖値を測定した。
また、上記と同様に高脂肪食を与えたマウスを６時間絶食後、インスリン０．７５Ｕ／ｋｇを腹腔内に投与し、インスリン投与前、投与後１５分、３０分、６０分、１２０分における血糖値を測定した。
血液は尾静脈より採取し、デキスターＺＩＩ（バイエル社）を用いて血糖値を測定した。

＜結果＞
ｃＧＫ−Ｔｇマウスの血糖値は、野生型マウスに比較して、ブドウ糖投与後およびインスリン投与後に有意に低い値を示した（図１１および図１２）。この結果は、ｃＧＫ−Ｔｇマウスにおいて耐糖能およびインスリン感受性が改善されていることを示唆する。

［試験例５］
野生型マウスおよびｃＧＫ−Ｔｇを１０週齢まで通常食（Ｆ−２，船橋農場）で飼育。１０週齢から２０週齢まで高脂肪食（６０ｋｃａｌ％ｆａｔ，Ｄ１２４９２，ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔ）で飼育した後、明期に自由摂食下で、ペントバルビタール麻酔下に解剖し、肩甲骨間褐色脂肪組織、大腿四頭筋組織、肝臓を摘出。直ちに液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。凍結保存組織からＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔｆｏｒｌｉｐｉｄｔｉｓｓｕｅ（Ｑｉａｇｅｎ）にてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＥｘＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ（ＴａｋａｒａＢＩＯ）にてｃＤＮＡ化した。各遺伝子に特異的なプライマーセット（ＴａｋａｒａＢＩＯ）とＳｙｂｅｒＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＴａｋａｒａＢＩＯ）を用いて、ＡＢＩ７３００Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて遺伝子発現を検討した。
ｃＧＫ−Ｔｇの肩甲骨間褐色脂肪組織では、熱産生を亢進させてエネルギー消費を高めるｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ γ ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＰＧＣ）−１αとｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＵＣＰ）−１の遺伝子発現が、野生型マウスの約３倍に亢進していた（図１３）。ｃＧＫ−Ｔｇの骨格筋では、野生型と比較して、熱産生を亢進させてエネルギー消費を高める遺伝子群（ＰＧＣ−１α、ＵＣＰ−３）の発現亢進に加えて、脂肪酸酸化を活性化させるＰＰＡＲαとＰＰＡＲδの遺伝子発現にも亢進が認められた（図１４）。ｃＧＫ−Ｔｇの肝臓においても、野生型と比較して、ＰＰＡＲδ遺伝子発現の亢進が認められた（図１５）。以上より、ＧＣ−Ａ系のエフェクター分子であるｃＧＫの過剰発現による抗脂肪肝作用のメカニズムの少なくとも一部は、脂肪酸酸化の亢進を中心とした褐色脂肪組織、骨格筋、肝臓でのエネルギー消費の亢進によることが示唆された。

［試験例６］
野生型マウスおよびＧＣ−Ａヘテロノックアウトマウス（ＧＣ−Ａ^＋／−）を８週齢まで通常食（Ｆ−２，船橋農場）で飼育。８週齢から２０週齢まで高脂肪食（４５ｋｃａｌ％ｆａｔ，Ｄ１２４５１，ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔ）で飼育し、２０週齢にて明期に自由摂食下にて解剖した。
１４週齢以降でＧＣ−Ａ^＋／−マウスで野生型よりも有意に体重増加が亢進していた（図１６）。２０週齢ではＧＣ−Ａ^＋／−マウスで、野生型マウスと比較して、体重は有意に大きく、肝臓重量体重比と肝臓中性脂肪含量には大きい傾向が認められた（図１７）。総脂肪重量はＧＣ−Ａ^＋／−マウスで、野生型よりも有意に増加していた（図１８）。摂餌量には野生型マウスとＧＣ−Ａ^＋／−マウスの間に差は認められなかった（図１９）。また、高脂肪食による耐糖能の悪化は、ＧＣ−Ａ^＋／−マウスで野生型よりも増強していた（図２０）。以上より、ＧＣ−Ａ^＋／−マウスでは高脂肪食による肥満、脂肪肝形成が野生型マウスよりも大きく、耐糖能障害の程度も大きいことが示された。

Claims

ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを投与することによる脂肪肝の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項１に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項２に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である、請求項２に記載の予防方法および／または治療方法。
ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の活性化剤を投与することによる脂肪肝の予防方法および／または治療方法。
脂肪肝がメタボリックシンドロームにより誘発される脂肪肝である、請求項１から５のいずれか１項に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを投与することによるメタボリックシンドロームの予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項７に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項８に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である、請求項９に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを投与することによる肥満の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項１１に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項１２に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である、請求項１２に記載の予防方法および／または治療方法。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項１５に記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項１６に記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である、請求項１６に記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチドの遺伝子を含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤。
ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の活性化剤を含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤。
ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の遺伝子を含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤。
ｃＧＭＰを含有する脂肪肝の予防剤および／または治療剤。
脂肪肝がメタボリックシンドロームにより誘発される脂肪肝である、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の予防および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含む脂肪肝の予防用および／または治療用のキット。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項２４に記載のキット。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項２５に記載のキット。
ナトリウム利尿ペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である、請求項２５に記載のキット。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有するメタボリックシンドロームの予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項２８記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項２９に記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である請求項２９に記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストを含有する肥満の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項３２記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項３３に記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である請求項３３に記載の予防剤および／または治療剤。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストの、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項３６に記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項３７に記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である、請求項３７に記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチドの遺伝子の、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用。
ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の活性化剤の、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用。
ｃＧＭＰ依存性プロテインカイネースＩ（ｃＧＫＩ）の遺伝子の、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用。
ｃＧＭＰの、脂肪肝の予防剤および／または治療剤製造のための使用。
脂肪肝がメタボリックシンドロームにより誘発される脂肪肝である、請求項３６から４３のいずれか１項に記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストの、メタボリックシンドロームの予防剤および／または治療剤製造のための使用。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項４５記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項４６に記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である請求項４６に記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストの、肥満の予防剤および／または治療剤製造のための使用。
ナトリウム利尿ペプチド受容体ＧＣ−Ａのアゴニストがナトリウム利尿ペプチドである、請求項４９記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチドが脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項５０に記載の使用。
ナトリウム利尿ペプチドが心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である請求項５０に記載の使用。