투하이브리드 스크리닝

Two-hybrid screening
2-하이브리드 검사의 개요, 두 단백질 사이의 상호작용을 확인하는 것, 여기서 Bittle과 Food라고 불린다.
A. Gal4 전사 인자 유전자는 리포터 유전자(LacZ) 전사에 필수적인 2도메인 단백질(BD, AD)을 생성한다.
B,C. 두 가지 핵융합 단백질이 준비된다: Gal4BD+Bait와 Gal4AD+프리. 둘 중 어느 것도 일반적으로 (기자 유전자의) 전사만을 시작하기에 충분하지 않다.
D. 두 핵융합 단백질이 모두 생성되고 첫 번째 핵융합 단백질의 Beating 부분이 두 번째의 Food 부분과 상호작용을 할 때, 리포터 유전자의 전사가 일어난다.

2-하이브리드 스크리닝(원래 효모 2-하이브리드 시스템 또는 Y2H로 알려져 있음)은 단백질-단백질 상호작용(PPI)[1]과 단백질--을 발견하는 데 사용되는 분자생물학 기법이다.두 단백질 또는 단일 단백질과 DNA 분자 사이의 물리적 상호작용(결합 등)을 각각 테스트하여 DNA 상호작용[2][3]

테스트의 전제는 전사 인자를 업스트림 활성화 시퀀스(UAS)에 결합하여 다운스트림 리포터 유전자를 활성화하는 것이다. 2-하이브리드 스크리닝의 경우, 전사 인자는 DNA 결합 도메인(DBD 또는 종종 BD라고도 약칭)과 활성화 도메인(AD)이라고 불리는 두 개의 분리된 조각으로 분할된다. BD는 UAS에 바인딩을 담당하는 도메인이고 AD는 전사 활성화를 담당하는 도메인이다.[1][2] 따라서 Y2H는 단백질-마약 보완 측정이다.

역사

1989년 스탠리 필즈와 옥규 송에 의해 개척된 이 기술은 원래 효모 사카로미스의 Gal4 전사 활성제를 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위해 고안되었다. 갈락토오스 이용에 관여하는 유전자의 Gal4 단백질 활성화가 선택 기반을 형성했다.[4] 그 이후, 단백질을 검출하는 몇몇 방법을 포함한 많은 대안적 방법을 설명하기 위해 같은 원리가 채택되었다.DNA 상호작용 또는 DNA-DNA 상호작용은 물론, 효모 대신 대장균이나 포유류 세포와 같은 다른 숙주 유기체를 사용하는 방법.[3][5]

기본 전제

2-하이브리드 화면의 핵심은 대부분의 진핵전사 요소에서 활성화와 결합 도메인이 모듈화되어 직접적인 결합 없이 서로 근접하게 기능할 수 있다는 점이다.[6] 전사 인자가 두 조각으로 갈라져도 두 조각이 간접적으로 연결되면 여전히 전사를 활성화할 수 있다는 뜻이다.

가장 일반적인 선별 접근법은 효모 2-하이브리드 측정법이다. 이 접근방식에서 연구자는 사용된 매체(agar plate)에서 각 먹이가 어디에 위치하는지 안다. 최근 10년 동안 여러 유기체에서 수백만 건의 잠재적 상호작용이 고투과 선별 시스템(흔히 로봇을 사용함)을 사용하여 선별되었고 수천 건 이상의 상호작용이 탐지되어 데이터베이스에서 BioGRID로 분류되었다.[7][8] 이 시스템은 종종 특정 영양소(보통 아미노산이나 핵산)의 생합성이 결여되어 있는 유전적으로 조작된 효모 균주를 이용한다. 이러한 영양소가 부족한 매체에서 자라면 효모는 살아남지 못한다. 이 돌연변이 효모 변종은 플라스미드의 형태로 외래 DNA를 통합하기 위해 만들어질 수 있다. 효모 2-하이브리드 스크리닝에서는 돌연변이 효모 균주에 별도의 미끼와 먹이 플라스미드를 동시에 도입하거나 짝짓기 전략을 사용하여 두 플라스미드를 하나의 숙주세포에 모두 넣는다.[9]

두 번째 높은 처리량 접근법은 도서관 심사 접근법이다. 이 설정에서 미끼와 먹잇감이 있는 세포는 임의의 순서로 짝지어진다. 과학자는 선택적 매개체에서 생존하는 세포를 짝짓기하고 선택한 후 어떤 먹이(DNA 시퀀스)가 사용되는 미끼와 상호 작용하는지 보기 위해 분리된 플라스미드의 순서를 정할 것이다. 이 접근방식은 재현성이 낮으며 행렬 접근방식에 비해 잘못된 긍정의 양이 더 많은 경향이 있다.[9]

플라스미드는 DNA 결합 영역(BD) 파편이 단백질에 융합되는 단백질 제품을 생산하도록 설계되고, 다른 플라스미드는 활성화 영역(AD) 파편이 다른 단백질에 융합되는 단백질 제품을 생산하도록 설계된다. BD에 융합된 단백질은 미끼 단백질이라고 불릴 수 있으며, 일반적으로 조사자가 새로운 결합 파트너를 식별하기 위해 사용하고 있는 알려진 단백질이다. AD에 융합된 단백질은 먹잇감 단백질로 지칭될 수 있으며 알려진 단일 단백질 또는 알려져 있거나 알려지지 않은 단백질의 라이브러리일 수 있다. 이러한 맥락에서 라이브러리는 특정 유기체나 조직에서 표현된 모든 단백질을 나타내는 단백질 인코딩 시퀀스 모음으로 구성되거나 무작위 DNA 시퀀스를 합성하여 생성될 수 있다.[3] 선원에 관계 없이, 그것들은 이후에 플라스미드의 단백질 인코딩 순서에 통합되고, 이것은 선별 방법으로 선택된 세포로 전염된다.[3] 이 기법은 도서관을 사용할 때 각 세포가 하나의 플라스미드 이하로 전염되고, 따라서 각 세포는 궁극적으로 단백질 도서관에서 한 구성원 이상만 발현한다고 가정한다.

미끼와 먹이 단백질이 상호작용을 하면(즉, 바인딩), 전사 인자의 AD와 BD가 간접적으로 연결되어 AD가 전사 시작 부지에 근접하게 되며 리포터 유전자의 전사(des)가 발생할 수 있다. 두 단백질이 상호작용을 하지 않으면 리포터 유전자의 전사도 없다. 이렇게 해서 융합 단백질 사이의 성공적인 상호작용은 세포 표현형의 변화와 연결된다.[1]

상대 핵융합 단백질과 우연히 상호작용하는 단백질을 표현하는 세포와 그렇지 않은 세포를 분리하는 문제는 다음 절에서 다루어진다.

고정 도메인

어떤 연구에서든, 조사 대상인 단백질 영역 중 일부는 연구의 목표에 따라 달라지는 반면, 다른 영역은 조사 대상이 아닌 영역은 일정하게 유지된다. 예를 들어, DNA 결합 도메인을 선택하기 위한 2-하이브리드 연구에서 DNA 결합 영역인 BD는 변화하고, BD와 AD 사이에 강한 결합을 유지하기 위해 두 개의 상호작용하는 단백질인 BD는 일정하게 유지되어야 한다. BD, 미끼와 먹잇감, AD를 선택할 수 있는 많은 도메인이 있다. 단백질-단백질 상호작용 조사에서 BD는 Zif268과 같은 많은 강력한 DNA 결합 영역 중에서 선택할 수 있다.[2] 미끼와 먹이 영역을 자주 선택하는 것은 N342V 돌연변이가[2] 있는 효모 Gal11P의 잔류물 263–352와 효모 Gal4의 잔류물 58–97이다.[2] 이러한 영역은 효모 및 박테리아 기반 선택 기법 모두에 사용할 수 있으며 강하게 결합되는 것으로 알려져 있다.[1][2]

선택된 AD는 세포 자체의 전사 기계를 사용하여 리포터 유전자의 전사를 활성화할 수 있어야 한다. 따라서 효모 기반 기법에 사용할 수 있는 다양한 AD는 박테리아 기반 유사 물질에 적합하지 않을 수 있다. 단순 포진 바이러스 유래 AD, VP16 및 효모 Gal4 AD는 효모에[1] 성공하여 사용되었고 대장균 RNA 중합효소의 α-단위 일부가 대장균 기반 방법에 사용되었다.[2][3]

도메인을 강력하게 활성화하면 약한 상호작용에 대한 민감도가 높아질 수 있지만 반대로 약한 AD는 더 강력한 엄격성을 제공할 수 있다.

표현 플라스미드의 구성

2-하이브리드 분석 또는 파생 기법 중 하나를 수행하기 위해 다수의 공학적 유전자 시퀀스를 숙주 세포에 통합해야 한다. 이러한 시퀀스의 구성과 전달에 사용되는 고려사항과 방법은 검사 및 실험 배경으로 선택한 유기체의 필요에 따라 다르다.

하이브리드 라이브러리에는 랜덤 라이브러리와 cDNA 기반 라이브러리의 두 가지 범주가 있다. cDNA 라이브러리는 세포 유형의 특정 세포에서 수집된 mRNA의 역전을 통해 생성된 cDNA에 의해 구성된다. 이 라이브러리는 검사에 사용되는 BD 또는 AD에 부착되도록 구조물에 연결할 수 있다.[1] 무작위 라이브러리는 이러한 cDNA 섹션 대신 무작위 시퀀스의 DNA 길이를 사용한다. 카세트 돌연변이 발생을 포함하여 이러한 무작위 시퀀스의 생산을 위한 여러 가지 방법이 존재한다.[2] DNA 라이브러리의 출처에 관계없이 적절한 제한 내핵을 사용하여 관련 플라스미드/페이지미드의 적절한 위치에 연결된다.[2]

대장균 특이 고려사항

복합 단백질을 IPTG 유도 래크 프로모터의 제어 하에 배치함으로써, 그것들은 IPTG로 보완된 매체에서만 표현된다. 또한 각 유전자 구조에 서로 다른 항생제 내성 유전자를 포함시킴으로써 해당 항생제가 함유된 매체에 배양된 배양액을 통해 비전환 세포의 성장을 쉽게 막을 수 있다. 이것은 세포 생존을 위해 상호작용의 부족이 필요한 카운터 선택 방법에서 특히 중요하다.[2]

리포터 유전자는 세포당 약 1개의 복사 번호로 박테리아 세포 게놈에[2] 자신을 통합할 수 있는 능력을 가진 일종의 플라스미드인 성공회에 먼저 삽입함으로써 대장균 게놈에 삽입될 수 있다.[10]

잡종 표현 방법론은 대장균 XL-1 블루 세포로 전기화될 수 있으며, VCS-M13 도우미 페이지로 증폭 및 감염되면 라이브러리 페이징의 재고량이 발생한다. 이 페이지는 각각 페이그미드 도서관의 한 줄로 된 회원 한 명을 포함할 것이다.[2]

단백질 정보 회복

일단 선택을 수행한 후에는 적절한 특성을 보이는 단백질의 1차 구조를 결정해야 한다. 이는 적절한 표현형을 보여주는 세포에서 단백질 인코딩 시퀀스(원래 삽입된 것)를 회수함으로써 달성된다.

대장균

대장균 세포의 변형에 사용되는 페이징은 VCS-M13 도우미 페이징에 감염시켜 선택된 세포에서 "재처리"할 수 있다. 그 결과 생성되는 페이지 입자에는 단일 가닥의 포메이드가 들어 있으며 XL-1 블루 셀을 감염시키는 데 사용된다.[2] 이중 가닥의 책략은 이후 이들 XL-1 블루 셀로부터 수집되어 본질적으로 원래의 도서관 페이지를 생산하는데 사용된 과정을 반대로 한다. 마지막으로, DNA 시퀀스는 디데옥시 시퀀스를 통해 결정된다.[2]

제어 민감도

대장균 유래 테트-R 억제제는 기존 리포터 유전자에 맞춰 사용할 수 있으며 테트라사이클린이나 독시클린(Tet-R 억제제)으로 조절할 수 있다. 따라서 Tet-R의 표현은 표준 2-하이브리드 시스템에 의해 제어되지만 Tet-R은 Tet-R 프로모터를 통해 HIS3와 같은 이전에 언급된 리포터의 표현을 차례로 제어(억제)한다. 테트라사이클린 또는 그 파생상품은 테트-R을 이용하는 시스템의 민감도를 조절하는 데 사용될 수 있다.[1]

감도는 또한 리포터 유전자에 대한 세포의 의존도를 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 이것은 그의 3개 의존 세포에 대한 성장 매체의 히스티딘 농도를 변경하고 aadA 의존 세포에 대한 스트렙토마이신 농도를 변경함으로써 영향을 받을 수 있다.[2][3] 선택-gene 의존성은 또한 적절한 농도에서 선택유전자 억제제를 적용하여 조절할 수 있다. 예를 들어 3-A미노-1,2,4-triazole(3-AT)은 HIS3-gene 제품의 경쟁적 억제제로서 히스티딘 결핍 매체에서의 성장에 필요한 HIS3 표현의 최소 수준을 적정화하는 데 사용될 수 있다.[2]

감도는 또한 리포터 DNA의 연산자 시퀀스 수를 변화시켜 변조될 수 있다.

비융접 단백질

세 번째, 비융접 단백질은 두 개의 융합 단백질과 함께 공동 발현될 수 있다. 조사에 따라 세 번째 단백질은 융합 단백질 중 하나를 변형시키거나 이들의 상호작용을 중재하거나 방해할 수 있다.[1]

세 번째 단백질의 공동 표현은 한 가지 또는 두 가지 융합 단백질의 수정이나 활성화를 위해 필요할 수 있다. 예를 들어, S. 세레비시아에는 내인성 티로신 키나제가 없다. 만약 조사가 티로신 인산화제를 필요로 하는 단백질을 포함하는 경우, 키나아제는 티로신 키나아제 유전자의 형태로 공급되어야 한다.[1]

비융접 단백질은 리간드 의존 수용체 조광화의 경우처럼 두 핵융합 단백질을 동시에 결합시켜 상호작용을 중재할 수 있다.[1]

상호작용하는 파트너와 함께 단백질을 사용하는 경우, 다른 단백질에 대한 기능적 호몰로학은 비융접 형태로 세 번째 단백질을 공급하여 평가할 수 있으며, 그 다음 결합 파트너를 위한 융합 단백질과 경쟁하거나 경쟁하지 않을 수 있다. 세 번째 단백질과 다른 퓨전 단백질의 결합은 리포터 표현 활성화 콤플렉스의 형성을 방해하고, 따라서 리포터 표현을 줄여 표현형의 구별되는 변화를 초래할 것이다.[1]

스플릿-유비퀴틴 효모 2-하이브리드

고전적인 효모 2-하이브리드 스크린의 한 가지 제한은 그것들이 수용성 단백질에 제한된다는 것이다. 따라서 불용성 막 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 연구하는데 그것들을 사용하는 것은 불가능하다. 분할-유비퀴틴 시스템은 이러한 한계를 극복하는 방법을 제공한다.[11] 분할-유비퀴틴 시스템에서 연구해야 할 두 개의 일체형 막 단백질은 두 개의 다른 유비퀴틴 모이에 융합된다. C-terminal ubitin moiety("Cub", 잔류물 35–76)와 N-terminal ubiitin moietyet("Nub", 잔류물 1–34)이다. 이러한 융합 단백질은 각각 미끼와 먹잇감으로 불린다. 큐브 모이티는 일체형 막 단백질에 융합될 뿐만 아니라 유비퀴틴 특정 단백질에 의해 분해될 수 있는 전사 계수(TF)에도 융합된다. 미끼-프리 상호작용에 따라 Nub와 Cub-moieties는 split-ubiquitin을 재구성하면서 모인다. 재구성된 스플릿-유비퀴틴 분자는 전사 인자를 분리하는 유비퀴틴 특정 프로테아제(protein specific protease)에 의해 인식되어 리포터 유전자의 전사를 유도할 수 있다.[12]

형광 투 하이브리드 검사

졸가드르와 동료들은 서로 다른 형광 단백질에 융합된 두 개의 혼합 단백질을 사용하는 형광 투 하이브리드 시스템과 라크 억제제인 LacI를 제시했다. 융합 단백질의 구조는 다음과 같다: FP2-LacI-bait와 FP1-prey는 미끼와 먹이 단백질이 상호 작용하여 호스트 세포 게놈의 LacI 단백질 결합 부위에서 형광 단백질(FP1 = GFP, FP2=mCherry)을 근접하게 가져온다.[13] 이 시스템은 또한 단백질-단백질 상호작용의 억제제를 검사하는 데 사용될 수 있다.[14]

효소 2 하이브리드 시스템: KISS

원래 Y2H 시스템은 재구성된 전사 인자를 사용한 반면, 다른 시스템은 PPI를 검출하는 효소 활동을 생성한다. 예를 들어, KInase 기질 센서("KISS")는 세포 내 PPI를 매핑하도록 설계된 포유류 2-하이브리드 접근방식이다. 여기서 미끼 단백질은 TYK2의 키나제를 함유한 부분에 융합되고 먹잇감은 gp130 사이토카인 수용체 파편과 결합된다. 미끼와 먹이가 상호작용을 할 때 TYK2 인포릴레이가 먹잇감 키메라에 STAT3 도킹 사이트를 만들어 최종적으로는 리포터 유전자의 활성화로 이어진다.[15]

1-형, 3-형, 1-2-형 변종

원하이브리드

이 기법의 단일 하이브리드 변화는 단백질을 조사하기 위해 설계되었다.DNA 상호작용 및 AD가 결합 영역과 직접 연결되는 단일 핵융합 단백질을 사용한다. 그러나 이 경우 결합 영역은 2-하이브리드 단백질-단백질 분석에서와 같이 반드시 고정된 순서의 영역은 아니지만 라이브러리에 의해 구성될 수 있다. 이 라이브러리는 리포터 유전자 구조의 촉진자 영역에 삽입되는 원하는 목표 순서에 따라 선택할 수 있다. 따라서 포지티브 선택 시스템에서는 UAS를 성공적으로 바인딩하고 전사할 수 있는 바인딩 도메인을 선택한다.[1]

DNA 결합 도메인의 선택은 반드시 단일 하이브리드 시스템을 사용하여 수행되는 것이 아니라 결합 도메인이 변화하고 미끼와 먹이 단백질이 일정하게 유지되는 2-하이브리드 시스템을 사용하여 수행될 수도 있다는 점에 유의하십시오.[2][3]

스리하이브리드

3-하이브리드 검사의 개요.

RNA-단백질 상호작용은 2-하이브리드 기법의 3-하이브리드 변동을 통해 연구되었다. 이 경우, 하이브리드 RNA 분자는 서로 상호작용하려는 것이 아니라 (RNA 결합 영역을 통해) 중간 RNA 분자인 두 개의 단백질 융합 영역을 결합하는 역할을 한다.[1] 위의 '비융접 단백질' 섹션에서 설명한 것과 유사한 기능을 수행하는 비융접 단백질을 포함하는 기법은 3-하이브리드 방법이라고도 할 수 있다.

원투하이브리드

1-하이브리드 방법과 2-하이브리드 방법의 동시 사용(즉, 단백질-단백질-단백질-동시 사용)DNA 상호작용)은 1-2-하이브리드 접근법으로 알려져 있으며 화면의 끈적임성을 증가시킬 것으로 예상된다.[1]

숙주 유기체

이론적으로, 살아있는 세포는 2-하이브리드 분석의 배경으로 사용될 수 있지만, 어느 것을 선택하느냐에 따라 결정되는 실질적인 고려사항들이 있다. 선택된 세포 라인은 비교적 값이 싸고 배양하기 쉬워야 하며 조사 방법과 시약의 적용을 견딜 수 있을 만큼 충분히 튼튼해야 한다.[1] 후자는 특히 고투과 연구를 하는데 중요하다. 따라서 효모 S. 세레비시아는 두 개의 하이브리드 연구를 위한 주요 숙주 유기체였다. 그러나 다른 유기체로부터 상호작용하는 단백질을 연구하는 것이 항상 이상적인 시스템은 아니다.[16] 효모세포는 종종 같은 변환 후 수정을 가지거나, 다른 코돈 사용을 가지거나, 단백질의 정확한 발현에 중요한 특정 단백질이 부족하다. 이러한 문제에 대처하기 위해 몇 가지 새로운 2-하이브리드 시스템이 개발되었다. 사용한 시스템에 따라 세포를 배양하고 상호작용을 위해 선택할 수 있도록 하기 위해 특정 배지를 사용한다. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 셀을 선택적 매체에 도금하여 상호작용을 확인하는 한천 도금법이다. 상호작용 단백질이 없는 세포들은 이 선택적 매개체에서 살아남지 말아야 한다.[7][17]

S. 세레비시아과(예스트)

효모 S. 세레비시아아(S. serebisiae)는 이 하이브리드 기법의 창시기에 사용된 모델 유기체였다. 그것은 일반적으로 Y2H 계통으로 알려져 있다. 그것은 3차 단백질 구조를 형성하는 능력, 중성 내부 pH, 이황화 결합을 형성하는 능력 강화 및 기타 세포질 완충 요인 중 글루타티온을 감소시켜 쾌적한 내부 환경을 유지하는 것을 포함하여 상호작용을 호스트하는 강력한 유기체로 만드는 몇 가지 특성을 가지고 있다.[1] 효모 모델은 비분자 기법을 통해 조작할 수 있으며 완전한 게놈 염기서열이 알려져 있다.[1] 효모 체계는 포유류 조직 배양에 적용할 수 없는 다양한 배양 조건과 가혹한 화학 물질에 내성이 있다.[1]

많은 효모 균주가 클론텍에서 생산되는 Y2H 스크린을 위해 특별히 생성되었다.[19] 예를 들어 Y187과[18] AH109와 같은 효모 균주가 있다. 효모균주 R2HMet과 BK100도 사용되었다.[20]

칸디다알비칸스

C. 알비칸은 특정한 특징을 가진 효모인데, 그것은 CUG 코돈을 류신이 아닌 세린으로 번역한다. 이러한 다른 코돈 사용 때문에 모델 시스템 S. 세레비시아를 Y2H로 사용하여 C. 알비칸 유전자를 이용한 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 것은 어렵다. 더 많은 네이티브 환경을 제공하기 위해 C. 알비칸스 2-하이브리드(C2H) 시스템이 개발되었다. 이 시스템으로 단백질-단백질 상호작용은 C.알비칸 자체에서 연구될 수 있다.[21][22] 최근에 추가된 것은 높은 처리량 시스템을 만든 것이다.[23][24][25]

대장균

박테리아 두 가지 혼합법(B2H 또는 BTH)은 보통 대장균에서 수행되며 효모 기반 시스템에 비해 몇 가지 장점이 있다. 예를 들어, 변환 효율성이 높고 성장 속도가 빨라질수록 대장균은 더 큰 도서관(10개8 이상)을 사용할 수 있게 된다.[2] 핵 국소화 신호에 대한 요구사항이 단백질 순서에 포함되지 않고 효모에 독성이 있는 단백질을 연구하는 능력도 실험 배경 유기체를 선택할 때 고려해야 할 주요 요인이 될 수 있다.[2]

특정 대장균 DNA 메틸전달효소 단백질의 메틸화 활성은 일부 DNA 결합 단백질 선택을 방해할 수 있다. 이를 예상할 경우 특정 메틸전달효소에 결함이 있는 대장균 균주의 사용이 명백한 해결책이 될 수 있다.[2] B2H는 진핵 세포에서처럼 단백질이 접히지 않거나 다른 처리가 부족할 수 있기 때문에 진핵 단백질-단백질 상호작용(예: 인간 단백질)을 연구할 때 이상적이지 않을 수 있다.

포유류 세포

최근 몇 년 동안 포유류 두 가지 하이브리드(M2H) 시스템은 고유 단백질 환경을 밀접하게 모방하는 세포 환경에서 포유류 단백질-단백질 상호작용을 연구하도록 설계되었다.[26] 일시적으로 전염된 포유류 세포는 단백질과 단백질의 상호작용을 찾기 위해 이 시스템에서 사용된다.[27][28] 포유류의 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위해 포유류 세포라인을 사용하는 것은 보다 토착적인 맥락에서 일할 수 있는 이점을 준다.[5] 변환 후 수정, 인산화, 아틸화, 글리코실화 등은 유사하다. 단백질의 세포내 국산화 또한 효모 2 하이브리드 시스템을 사용하는 것에 비해 더 정확하다.[29] [30] 또한 포유류 2-하이브리드 시스템으로 신호 입력을 연구하는 것도 가능하다.[31] 전염 후 48시간 이내에 결과를 얻을 수 있는 것도 큰 장점이다.[5]

아라비도피스탈리아나

2005년에 식물에서 두 개의 하이브리드 시스템이 개발되었다. A. 탈리아나 단백질-단백질 상호작용의 원생물을 사용하는 것은 식물에서 연구될 수 있다. 이런 방식으로 상호작용은 그들의 토착적인 맥락에서 연구될 수 있다. 이 시스템에서 GAL4 AD와 BD는 강력한 35S 프로모터의 관리 하에 있다. 교호작용은 GUS 리포터를 사용하여 측정한다. 고투과 스크리닝이 가능하도록 벡터를 게이트웨이에 호환되도록 했다. 이 시스템은 원형극성 2 하이브리드(P2H) 시스템으로 알려져 있다.[32]

압리시아캘리포니아 주

캘리포니아 바다토끼는 장기기억의 분자 메커니즘을 연구하기 위한 신경생물학의 모델 유기체다. 신경학에서 중요한 상호작용을 연구하기 위해, 보다 토착적인 환경에서 캘리포니아 뉴런에서 2-하이브리드 시스템이 개발되었다. 이 시스템에는 GAL4 AD와 BD가 사용된다.[33][34]

봄비x모리

길들여진 비단나방인 봄비x모리(BmN4세포)의 애벌레나 애벌레에서 나온 누에세포 라인에서 곤충 2-하이브리드(I2H) 시스템이 개발됐다. 이 시스템은 GAL4 BD와 마우스 NF-118B P65의 활성화 도메인을 사용한다. 둘 다 작전통제권 하에 있다.IE2 추진자.[35]

적용들

교호작용에 중요한 시퀀스의 결정

사용된 플라스미드의 해당 DNA 베이스 페어를 변이시켜 특정 아미노산을 변경함으로써, 상호작용을 유지하는 데 있어 아미노산 잔류물의 중요성을 결정할 수 있다.[1]

DNA 결합 단백질을 선택하기 위해 박테리아 세포 기반의 방법을 사용한 후, 박테리아 세포 게놈은 다른 염기서열(또는 실제로 DNA에 대한 일반적인 친화력)을 가진 도메인의 싱크대 역할을 할 수 있는 한계가 있으므로 이들 영역의 특수성을 확인할 필요가 있다.[2]

마약 및 독극물 발견

단백질-단백질 신호 전달 상호작용은 그 특수성과 퍼버시티성으로 인해 적절한 치료 목표를 제시한다. 무작위 약물 발견 접근법은 무작위 화학 구조로 구성된 복합 은행을 사용하며, 의도된 목표에서 이러한 구조물을 시험하기 위한 고투과 방법을 요구한다.[1][17]

조사를 위해 선택된 세포는 조사자가 연구하고자 하는 분자적 측면을 반영하도록 특별히 설계되어 새로운 인간 또는 동물적 치료제나 페스트 방지제를 식별하는 데 사용될 수 있다.[1][17]

단백질 함수의 결정

알려지지 않은 단백질의 상호작용 파트너를 결정함으로써, 이러한 새로운 단백질의 가능한 기능을 유추할 수 있다.[1] 이것은 알려지지 않은 단백질의 라이브러리에 대해 알려진 단일 단백질을 사용하거나 반대로, 알려지지 않은 기능의 단일 단백질을 사용하여 알려진 단백질의 라이브러리에서 선택함으로써 이루어질 수 있다.[1]

아연 손가락 단백질 선택

단백질 공학을 위한 아연 핑거 단백질(ZFP)을 선택하기 위해 2-하이브리드 스크리닝 기법을 응용한 방법이 성공적으로 사용됐다.[2][3] ZFP는 그 자체로 원하는 DNA 서열과 결합하는 맞춤형 DNA 결합 도메인의 구축에 사용되는 DNA 결합 단백질이다.[36]

UAS에 포함된 원하는 표적 시퀀스를 가진 선택 유전자를 사용하고 관련 아미노산 시퀀스를 무작위로 만들어 ZFP 라이브러리를 생성함으로써 필요한 특성과 DNA-ZFP 상호작용을 호스트하는 셀을 선택할 수 있다. 각 ZFP는 일반적으로 3~4개의 기본 쌍만 인식하므로, UAS 외부의 사이트 인식을 방지하기 위해 무작위화된 ZFP는 다른 2개의 일정한 순서의 ZFP로 구성된 '스캐폴드'로 설계된다. 따라서 UAS는 ZFP를 선택하는 순서에 추가하여 상시 비계의 목표 시퀀스를 포함하도록 설계되었다.[2][3]

이 시스템을 사용하여 다수의 다른 DNA 결합 도메인도 조사할 수 있다.[2]

힘

  • 2-하이브리드 스크린은 기술 수준이 낮아서 정교한 장비 없이도 어느 연구실에서나 실행할 수 있다.
  • 두 개의 하이브리드 화면은 상호작용 파트너의 식별을 위한 중요한 첫 번째 힌트를 제공할 수 있다.
  • 검사는 확장 가능하며, 이것은 많은 단백질들 사이의 상호작용을 검사하는 것을 가능하게 한다. 게다가, 그것은 자동화될 수 있고, 로봇을 사용함으로써 많은 단백질들이 상대적으로 짧은 시간 안에 잠재적으로 상호작용하는 수천 개의 단백질에 대해 검사될 수 있다. 두 가지 유형의 대형 스크린이 사용된다: 도서관 접근법과 매트릭스 접근법이다.
  • 효모 2-하이브리드 데이터는 질량 분광법(AP/MS)에 따른 공선성 정화의 대안적 접근법에 의해 생성된 데이터와 유사한 품질을 가질 수 있다.[37][9]

약점

  • 단백질-단백질 상호작용의 효모 2-하이브리드 스크린에 적용되는 주요 비판은 많은 수의 거짓 양성(및 거짓 음성) 식별 가능성이다. 정확한 거짓 양성 결과의 비율은 알려지지 않았지만, 이전의 추정치는 70%에 달했다. 이것은 또한 부분적으로 (고처리량) 2-하이브리드 스크리닝을 사용할 때, 특히 다른 실험 시스템을 사용할 때 종종 발견되는 결과의 매우 작은 중복에 대해서도 설명한다.[9][28]

오류율이 높은 이유는 화면 특성에 있다.

  • 특정 검사 변형은 비정상적인 단백질 농도를 유발하여 불특정(허위) 양성으로 이어질 수 있는 핵융합 단백질을 과다하게 압박한다.
  • 혼합 단백질은 핵융합 단백질이다. 즉, 융합된 부분은 특히 시험 단백질의 N-단자(DNA 결합 또는 활성화 영역이 일반적으로 붙어 있는 곳)에서 상호작용이 일어나는 경우 특정 상호작용을 억제할 수 있다.
  • Y2H의 대표적인 숙주 유기체인 효모에서는 교호작용이 일어나지 않을 수 있다. 예를 들어, 박테리아 단백질을 효모에서 검사할 경우 박테리아 숙주에만 존재하는 적절한 접힘을 위한 보호판이 부족할 수 있다. 더욱이 포유류 단백질이 효모에서 올바르게 변형되지 않는 경우도 있다(예: 인산화 누락). 이는 잘못된 결과를 초래할 수도 있다.
  • Y2H는 핵에서 일어난다. 시험단백질이 핵에 국부화되지 않은 경우(다른 국부화 신호가 있기 때문에), 상호작용하는 두 개의 단백질은 비 상호작용을 하는 것으로 밝혀질 수 있다.
  • 어떤 단백질은 효모에서 함께 발현될 때 특히 상호작용을 할 수 있지만, 실제로는 같은 세포에 동시에 존재하지 않는다. 그러나 대부분의 경우 그러한 단백질이 실제로 특정 세포나 특정 상황에서 발현되는 것을 배제할 수 없다.

이런 점 하나하나가 잘못된 결과를 낳을 수 있다. 모든 오류 발생원의 결합 효과 때문에 효모 2-하이브리드는 주의해서 해석되어야 한다. 잘못된 긍정의 발생 확률은 모든 상호작용이 높은 신뢰도 측정에 의해 확인되어야 함을 의미한다. 예를 들어, 대규모 단백질-단백질 상호작용 데이터에 어려운 내인성 단백질의 공동 면역소모화. 또는 복수의 Y2H 변종[38] 또는 생물정보학 기법을 사용하여 Y2H 데이터를 확인할 수 있다. 후자는 상호작용하는 단백질이 동시에 발현되는지, 몇 가지 공통 특성(유전자 온톨로지 주석이나 특정 네트워크 위상 등)을 공유하는지 여부를 시험하며, 다른 종에서 동음이의 상호작용성을 갖는다.[39]

참고 항목

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