엘리스팟

ELISpot

효소연계면역흡수점(ELISpot)은 단일 세포에 대한 사이토카인 분비 빈도를 정량적으로 측정하는 데 초점을 맞춘 일종의 분석법이다.또한 ELISpot Assay는 항체를 사용하여 단백질 분석물질을 검출하는 기술로 분류되며, 분석물질이라는 단어는 식별되거나 측정되는 모든 생물학적 또는 화학적 물질을 가리킵니다.

FluoroSpot 검사는 ELISpot 검사를 변형한 것입니다.FluoroSpot Assay는 여러 가지 분석 물질을 분석하기 위해 형광을 사용합니다. 즉, 두 가지 이상의 유형의 단백질 분비를 감지할 수 있습니다.

역사

Cecil Czerkinsky는 1983년에 하이브리드 도마 세포에 의한 항원 특이 면역 글로불린의 생산을 정량화하는 새로운 방법으로 ELISpot를 처음 기술했습니다.1988년 Czerkinsky는 T세포에 의한 림포카인의 분비를 정량화하는 ELISA 스폿 어세이(spot assay)를 개발했다.같은 해, 듀얼 컬러의 ELISpot과 컴퓨터 이미징을 처음으로 조합해, 스팟의 열거와 분석을 가능하게 했다.1988년에는 이러한 [1]분석을 수행하기 위해 멤브레인 바닥판을 최초로 사용했다.

ELISpot의 메커니즘

  1. 항체 코팅:ELISpot 검사 기법 전반에 걸쳐 다양한 물질이 웰에 추가되고 웰에서 세척됩니다.검사 대상 물질로 채워질 수 있는 작은 접시/볼이 있는 실험실 접시에 우물이 있습니다. 접시 위의 우물의 양은 다양하지만 보통 16-100개입니다.웰에 첨가된 첫 번째 물질은 사이토카인 특이 모노클로널 항체이다.이 항체들은 미래의 사이토카인 결합을 위해 우물 벽을 코팅한다.모노클로널 항체는 항체가 단일 세포 계통에서 생성되고 하나의 단백질 에피토프에만 결합할 수 있다는 것을 의미합니다.반면에 폴리클론 항체는 동일한 단백질의 여러 에피토프에 결합할 수 있다.
  2. 세포 배양:관찰 및 분석 중인 원하는 셀이 웰에 추가됩니다.각각의 우물에는 세포 내의 사이토카인 분비를 활성화하는 자극의 유무도 있습니다.세포 배양 중에 세포는 현재의 자극에 반응하여 사이토카인을 분비할 수 있다.셀의 적절한 취급을 보증하기 위해서, 많은 순서와 방법이 있습니다.세포가 고품질인지 확인하려면 혈액 샘플의 세포를 3시간 이상 보관할 경우 가볍게 교반하고 혈액 샘플을 저장하기 전에 PBS(인산 완충 식염수)에 희석해야 하며 혈액 샘플에 과립구가 없어야 합니다.냉동 보존되고 해동된 세포는 [2]섭씨 37도에서 1시간 이상 휴식을 취해야 한다.또한 세포를 배양할 때 고려해야 할 많은 사항들이 있는데, 예를 들어 세포가 반점 형성에 영향을 줄 수 있는 갑작스러운 움직임을 경험하지 않도록 하거나 인큐베이터의 습도가 과도한 증발을 방지하고 웰을 [3]건조하게 만드는 것을 방지해야 한다.
  3. 사이토카인 캡처:세포는 우물 벽을 덮는 사이토카인 특이 모노클로널 항체로 둘러싸여 있기 때문에 배양된 세포에 의해 분비된 사이토카인이 특정 에피토프에서 항체에 부착되기 시작할 것이다.
  4. 검출항체:이 때 셀 및 기타 바람직하지 않은 물질을 제거하기 위해 웰을 헹궈야 합니다.남아 있어야 할 것은 사이토카인 특이 모노클로널 항체와 항체에 결합된 사이토카인뿐이다.이어서 비오티닐화 사이토카인 특이 검출 항체를 웰에 첨가한다.이러한 사이토카인 특이적 검출 항체는 사이토카인이 사용된 첫 번째 항체 세트에 여전히 부착되어 있기 때문에 우물 안에 남아 있는 모든 사이토카인에 결합할 것입니다.웰을 코팅하는 첫 번째 항체 세트에 부착된 사이토카인이므로, 웰을 헹궈도 사이토카인은 씻겨 내려가지 않았다.
  5. 스트렙타비딘-효소 결합체:검출 항체와 결합하기 위해 웰에 스트렙타비딘-효소 결합체를 첨가한다.이전 단계에서 웰에 첨가된 사이토카인 특이 검출 항체를 비오티닐화하는 목적은 항체가 새로운 스트렙타비딘-효소 결합체에 결합할 수 있도록 하기 위함이다.바이오티닐화는 기본적으로 사이토카인 특이 항체의 비오틴과 복합체의 [4]스트렙타비딘 사이에 강한 친화력을 생성한다.
  6. 기판 추가:웰에 기판을 첨가하고 전공정에서 첨가된 효소결합체에 의해 촉매된다.이 반응은 우물에서 반점을 형성하는 불용성 침전을 형성한다.이 단계에서 사용하는 기질은 이전 단계에서 사용된 효소의 유형에 따라 달라집니다.스트렙타비딘-ALP(스트렙타비딘과 알칼리성 포스파타아제 결합체)를 사용하면 BCIP/NBT-플러스(5-브로모-4-클로로-3-인도릴인산과 니트로블루테트라졸륨의 [5]혼합물)를 기질로 사용하면 분석하기 쉬운 더 뚜렷한 반점이 생긴다.스트렙타비딘-HRP(스트렙타비딘과 호서라디쉬페옥시다아제복합체)를 사용하면 TMB(테트라메틸벤지딘)[6]를 기질로 사용하면 [7]더 좋은 결과를 얻을 수 있다.
  7. 분석:형성된 스팟은 자동 ELISpot 판독기로 판독하거나 해부 현미경으로 셀 수 있으며 사이토카인 분비 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

Fluoro Spot의 메커니즘

FluoroSpot 검사는 ELISpot 검사와 매우 유사합니다.주된 차이점은 FluoroSpot 검사는 한 장의 웰에 여러 개의 분석 물질이 있는지 분석할 수 있는 반면, ELISpot 검사는 한 번에 하나의 분석 물질만 분석할 수 있다는 것입니다.FluoroSpot 검사는 검출을 위한 효소 반응이 아닌 형광을 사용하여 이를 달성합니다.FluoroSpot 검사를 위한 단계도 유사하지만 몇 가지 [8]차이가 있습니다.

  1. 항체 코팅:ELISpot과 마찬가지로 사이토카인 특이 모노클로널 포획 항체를 웰이 있는 플레이트에 첨가한다.두 검사 모두 오염 및 왜곡된 데이터 수집을 방지하기 위해 플레이트를 에탄올 처리했습니다.FluoroSpot 검사의 경우 여러 유형의 분석 물질을 검출하기 위해 여러 유형의 캡처 항체가 웰에 부착됩니다.ELISpot 및 FluoroSpot 검사를 통해 최적의 결과를 얻으려면 적절한 플레이트 코팅 기법을 따라야 합니다.플레이트는 에탄올 처리 후 세척한 후 항체로 코팅해야 합니다.에탄올 처리 방법도 사용되는 플레이트의 종류에 따라 달라집니다.MSIP 및 IPFL 플레이트의 경우 모든 웰에 35% 에탄올 15마이크로리터를 추가해야 합니다.에탄올을 웰에 1분간 방치한 후 쏟아냅니다.MAIPSWU 플레이트의 경우 대신 모든 웰에 70% 에탄올 50마이크로리터를 추가해야 합니다.에탄올을 웰에 2분간 방치한 후 쏟아냅니다.유정을 에탄올로 처리한 후에는 모든 유정을 200마이크로리터의 멸균수로 세척해야 합니다.이 세척 과정을 총 5회 반복해야 합니다.웰을 에탄올로 처리하고 세척한 후 사이토카인 특이 모노클로널 포획 항체를 각 [9]웰에 추가할 수 있습니다.
  2. 세포 배양:세포는 웰에 추가되며 단백질 분비에 영향을 미치는 자극의 유무에 따라 배양된다.
  3. 사이토카인 포획: 배양된 세포에서 분비되는 단백질/분석 물질은 첫 번째 단계에서 웰에 부착된 포획 항체에 결합할 것입니다.
  4. 검출항체:ELISpot과 마찬가지로 식별 또는 측정에 관심이 없는 세포 및 기타 물질을 제거하기 위해 웰을 헹구면 바이오티닐화 검출 항체가 추가되며(이것은 정량화하고자 하는 한 유형의 분석물에 특정됨) 태그 부착 검출 항체가 두 번째 및 세 번째 유형의 검출 항체가 추가됨연구 중인 분석 물질.
  5. 불소포자 결합체:스트렙타비딘-효소 결합체를 추가하는 대신 불소포자 항태그 항체 및 스트렙타비딘-불소포자 결합체를 사용하여 FluoroSpot에서 다중 분석물의 검출을 증폭한다.이 공정에서는 나중에 웰 내의 형광색을 분석할 때 사용되는 신호를 강화하기 위해 형광증강제 용액도 첨가된다.이러한 형광을 통해 ELISpot과 달리 FluoroSpot은 여러 분석 물질을 분석하고 비교할 수 있습니다.
  6. 분석:FluoroSpot은 효소 반응이 아닌 형광을 사용하기 때문에 효소와 반응하기 위해 기질을 추가하는 단계가 필요하지 않습니다(엘리소스팟에 필요한 경우).FluoroSpot 검사의 마지막 단계는 분석 중인 다양한 형광구에 대해 별도의 필터가 있는 자동 형광 판독기에서 형광구를 분석하는 것입니다.정확한 [8]측정을 원하는 경우 형광체의 특정 파장에 대해 이러한 필터를 선택해야 합니다.

FluoroSpot 검사는 여러 분석물의 존재를 식별하고 정량화하기 때문에 한 분석물의 흡수가 다른 분석물의 분비에 영향을 미칠 수 있습니다. 이를 포획 [8]효과라고 합니다.분석 물질이 다른 분석 물질에 미치는 영향은 긍정적일 수도 있고 부정적일 수도 있습니다(두 번째 분석 물질의 생산은 증가하거나 감소할 수 있습니다).포착 효과를 상쇄하기 위해 분석물의 [8]생산 감소를 우회하기 위해 공동 자극을 사용할 수 있습니다.이것은 같은 분석물의 생산을 자극하는 두 번째 항체가 웰에 첨가되는 경우이다.

ELISpot 및 FluoroSpot 응용 프로그램

ELISpot 및 FluoroSpot 검사는 백신 개발,[10] 암,[11] 알레르기,[12] 단세포/대식세포/치드라이트 세포 특성 평가, 아폴리포단백질 분석 및 수의학 연구 등 다양한 연구 분야에서 사용될 수 있습니다.그 ELISpot 사용하면antigen-specific 억제 작용을, T세포에 의해 항체 특정을 분비 cells,[13]종양 antigens,[11]granzyme B와 퍼포린 방출되면 백신 efficacy,[14]항원 결정 인자 mapping,[15]세포 독성 T세포 활동, IL-4, IL-5의 탐지 및 IL-13,[12]vaccine-induced 항체 반응,antigen-specific 기억 B세포 공부할 수 있다.[10]그리고 훨씬 더 많은 것.

구체적으로는 T세포 서브셋의 특성화에 T세포 엘리스팟 어세이(ELISpot assay)를 사용한다.이는 분석 결과 사이토카인 IFN-y, IL-2, TNF-alpha, IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성을 검출할 수 있기 때문입니다.처음 세 개의 사이토카인은 Th1 세포에 의해 생산되고, 마지막 세 개는 Th2 세포에 의해 생산된다.사이토카인 생산을 통한 T세포 반응 측정도 백신 [16]효과를 연구할 수 있다.

T세포 Fluoro Spot으로 종양 투과 림프구를 관찰할 수 있습니다.IFN-y 사이토카인과 과립자임 B 분비를 분석하여 세포독성 T세포 반응을 평가할 수도 있습니다.둘 다 암 [17]연구에 사용됩니다.

B세포 FluoroSpot은 백신 접종 전후에 IgG, IgA, IgM의 분비를 정량화하여 백신 효과를 관찰할 수 있다.이러한 다중 면역 글로불린의 분석은 [17]FluoroSpot에서 사용되는 형광 방법 때문에 가능합니다.

레퍼런스

  1. ^ Ranieri, Elena; Popescu, Iulia; Gigante, Margherita (2014). "CTL ELISPOT Assay". Cytotoxic T-Cells. Methods in Molecular Biology. Vol. 1186. pp. 75–86. doi:10.1007/978-1-4939-1158-5_6. ISBN 978-1-4939-1157-8. PMID 25149304.
  2. ^ "Cells for ELISpot and FluoroSpot". MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  3. ^ "Cell Incubation". MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  4. ^ "Biotinylation". ThermoFisher Scientific. Retrieved 6 December 2018.
  5. ^ "BCIP/NBT-plus SDS Summary" (PDF). MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  6. ^ "TMB Datasheet/Protocol" (PDF). MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  7. ^ "ELISpot Substrates". MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  8. ^ a b c d "FluoroSpot Assay Principle". MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  9. ^ "Plate Coating Guide". MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  10. ^ a b "Vaccine Development". MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  11. ^ a b "Cancer". MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  12. ^ a b "Allergy". MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  13. ^ Czerkinsky, CC (16 December 1983). "A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells". Journal of Immunological Methods. 65 (1–2): 109–121. doi:10.1016/0022-1759(83)90308-3. PMID 6361139.
  14. ^ Saletti, Giulietta (9 May 2013). "Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood". Nature Protocols. 8 (6): 1073–1087. doi:10.1038/nprot.2013.058. PMID 23660756. S2CID 38317207.
  15. ^ "T cell ELISpot Assays". PROIMMUNE. Retrieved 6 December 2018.
  16. ^ Strand, Nacka. "Find 1 cell in 100,000 with ELISpot" (PDF). MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
  17. ^ a b Strand, Nacka. "Discover more with FluoroSpot" (PDF). MABTECH. Retrieved 6 December 2018.