Футпринтинг ДНК
Футпринтинг ДНК (англ. DNA footprinting) — метод поиска в структуре ДНК последовательностей связывания ДНК-связывающих белков. Данный метод используют для изучения взаимодействия белков с ДНК как in vitro (с выделенными из клеток ДНК-белковыми комплексами), так и in vivo (в физиологических условиях, внутри клетки).
Например, факторы транскрипции связываются с промоторами, энхансерами или сайленсерами и регулируют экспрессию отдельных генов в геноме. Метод футпринтинга ДНК позволяет установить последовательности ДНК, с которыми связываются данные регуляторные белки. Метод также пригоден и для быстрого поиска (скрининга) специфических белков, связывающихся с определённой последовательностью ДНК.
Своё название метод получил от английского слова «footprint», обозначающего отпечаток ноги или след.[1].
История
[править | править код]В 1978 году Дэвид Галас и Альберт Шмитц разработали метод футпринтинга ДНК для изучения специфичности связывания белка-репрессора с лактозным опероном. Метод футпринтинга был основан на методе секвенирования Максама-Гилберта.[2]
Метод
[править | править код]
Наиболее простым применением данного метода является установление того, связывается ли белок с тем или иным районом ДНК.[3]
- При помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицируют и метят необходимую последовательность ДНК, которая является вероятным сайтом связывания белков. Идеальный размер ампликона в таком случае составляет от 50 до 200 оснований.
- Добавляют исследуемый белок, при этом часть ДНК оставляют интактной для последующего сравнения
- Добавляют разрезающий агент — химической или ферментативной природы. Разрезающий агент случайным образом вносит разрывы в ДНК. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы каждая цепочка ДНК была разрезана лишь в одном месте. Белок, который специфически связывается с последовательностью нуклеотидов ДНК, защищает участок связывания от разрезания.
- Продукты деградации ДНК разделяют при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Фрагменты ДНК, с которыми не был связан белок, будут разрезаны в случайных местах и в геле будут распределяться в виде «лестницы». Фрагменты ДНК, с которыми связывается белок, будут защищены от разрезания и будут образовывать отпечаток, след (англ. footprint) на такой «лестнице». Одновременно с футпринтингом может быть произведено секвенирование ДНК методом Максама-Гилберта, при этом будет установлена последовательность нуклеотидов, с которыми связывается соответствующий белок.
Мечение
[править | править код]Анализируемые молекулы ДНК для определения расположения сайта связывания белка могут быть помечены отдельно с 3'- и с 5'-конца. Используют метки:
- Радиоактивные метки традиционно используют для мечения фрагментов ДНК для футпринтинга, данный способ мечения был разработан на методики секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту. Данный вариант является очень чувствительным, при помощи радиоактивной метки можно визуализировать малые количества ДНК.
- Флюоресцентные метки являются заменой опасным радиоактивным. Однако, флюоресцентное мечение является менее чувствительным методом визуализации ДНК, и низкие концентрации продуктов футпринтинга не могут быть детектированы. Для визуализации продуктов, меченных флюорофорами используют секвенирующие гели и методы капиллярного электрофореза.[3]
Разрезающий агент
[править | править код]В качестве разрезающего агента для деградации исследуемой ДНК применяют ДНКазу I типа[3][4], реактив Фентона[5], ультрафиолетовое облучение[6].
Примечания
[править | править код]- ↑ Молекулярная биология клетки. М.: «Мир», 1994.
- ↑ Galas D and Schmitz A. (1978) DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5(9):3157-70.
- ↑ 1 2 3 Hampshire A, Rusling D, Broughton-Head V, and Fox K. (2007) Footprinting: A method for determining the sequence selectivity, affinity and kinetics of DNA-binding ligands. Methods. 42:128-140.
- ↑ LeBlanc B and Moss T. (2001) DNase I Footprinting. Methods in Molecular Biology. 148: 31-8.
- ↑ Zaychikov E, Schickor P, Denissova L, and Heumann H. (2001) Hydroxyl radical footprinting. Methods in Molecular Biology. 148: 49-61.
- ↑ Geiselmann J and Boccard F. (2001) Ultraviolet-laser footprinting. Methods in Molecular Biology. 148:161-73.