JP2975632B2 - グリコサミノグリカン修飾プロテイン - Google Patents

グリコサミノグリカン修飾プロテイン

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はグリコサミノグリカンにより修飾されたプロ
テインに関し、さらに詳しくは、特定の活性化剤により
活性化されたグリコサミノグリカンとプロテインとを反
応させることにより得ることができるグリコサミノグリ
カンにより修飾されたプロテインに関する。
［従来の技術］ 近年、癌をはじめとして各種炎症反応や遺伝的酸素欠
損症など各種の疾患に対して酵素や生理活性蛋白質を医
薬品として用いる試みが盛んに行なわれている。
［発明が解決しようとする課題］ しかし、これらの酵素や生理活性蛋白質は、生体に対
して異種蛋白質であることが多く、そのまま生体内に投
与することは免疫原性の問題や生体内での安定性の問題
を生じ、製剤化にあたつてアナフイラキシー反応の軽減
や薬効の持続性の向上等の改善が必要になつてくる。
また、これらの蛋白質を遺伝子工学の操作により大量
に生産する試みがなされているが、遺伝子工学により生
産される蛋白質は、糖鎖の欠如の問題があり、これも生
体内での安定性に大きな問題がある。
そのために、酵素や生理活性蛋白質の安定性を薬理学
的に改善するために、種々の合成高分子物質、多糖類等
で修飾する提案がなされている。そのために使用される
合成高分子物質としては、例えば、ポリ−Ｌ−アスパラ
ギン酸1)またはその誘導体、ポリ−Ｄ−または−Ｌ−リ
ジン、Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンとの共重合体2)、
ポリビニルアルコールピラン重合体、ポリエチレングリ
コールまたはその誘導体、スチレン−マレイン酸共重合
体3)等が挙げられ、多糖体としては、例えば、アガロー
ス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン6)、プ
ルラン4)5)、リポポリサツカライド等が挙げられる。［
1)M.Okada,A.Matsushima,A.Katuhata,T.Aoyama,T.Ando
and Y.Inada:Int.Archs Allelrgy appl.Immun.76,
79−81（1965）;2)F.T.Liu and D.H.Katz:Proc.Natl.
Acad.Sci.,76,1430−1434（1979）;3)H.Maeda,M.Ueda,
T.Morinaga and T.Matsumoto:J.Med.Chem.,28;455−4
61（1985）;4)M.Usui and T.Matsuhashi:J.Immunol.,
122,1266−1272（1979）;5)松橋直：減感作の実験動物
モデル、小林節雄他編、減感作療法の基礎と臨床、pp.4
−11、中外医学書（1982）;6)T.P.King,L.Kochoumian,
K.Ishizaka,L.Kichtenstein,P.S.Norman:Arch.Biochem.
Biophys.,169,464−473（1975）参照］。
一方、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドの存在下にスーパーオキシドジス
ムターゼやインスリン等の蛋白質とコンドロイチン硫酸
等とを反応させることによつて安定化された該蛋白質が
提案されている（特開昭62−255435号公報参照）が、こ
の方法によつて得られる蛋白質は、これら蛋白質に存在
する複数のアスパラギン酸やグルタミン酸のカルボキシ
ル基が、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドにより夫々活性化される結果、得
られる蛋白質と称される物質は、蛋白質それ自体の重合
体を含む複雑な重合体を形成し、スーパーオキシドジス
ムターゼやインスリン等の単体としての薬理効果におい
て今一歩の改善が望まれている。
今回、還元末端限定酸化法、カルボキシル基活性化法
または還元末端ラクトン法により活性化されたグリコサ
ミノグリカンをプロテインと反応させることにより、構
造の複雑な重合体が生ずることなく、生体内での安定性
に優れ、しかも該プロテインが本来もつている生理活性
を持続して発現しうるグリコサミノグリカン修飾プロテ
インが得られることが見い出され本発明を完成するに至
つた。
［課題を解決するための手段］ かくして、本発明の一態様によれば、グリコサミノグ
リカンの還元性末端糖部分を開裂させ、該糖部分を活性
化してプロテインのアミノ基と反応させて得られること
を特徴とするグリコサミノグリカン修飾プロテインが提
供される。
該グリコサミノグリカン修飾プロテインとして、より
具体的には、 グリコサミノグリカンを還元することによって還元
性末端糖部分を開裂させ、次いで部分酸化することによ
り形成されるアルデヒド基とプロテインのアミノ基とを
結合して得られることを特徴とするグリコサミノグリカ
ン修飾プロテイン、 および グリコサミノグリカンを酸化することによって還元
性末端糖部分を開裂させ、次いで酸処理することにより
形成されるラクトン化合物のカルボニル基とプロテイン
のアミノ基とをアミド結合を介して結合して得られるこ
とを特徴とするグリコサミノグリカン修飾プロテイン が提供される。
本発明のさらに別紙の態様によれば、グリコサミノグ
リカンのウロン酸部分のカルボキシル基を活性化し、次
いで該活性化カルボキシル基を有するグリコサミノグリ
カンとプロテインを反応せしめ、少なくともその一部の
カルボキシル基とプロテインのアミノ基がアミド結合を
介して結合していることを特徴とするグリコサミノグリ
カン修飾プロテインが提供される。
本発明の上記グリコサミノグリカン修飾プロテイン
は、例えば、還元末端限定酸化法、還元末端ラクトン法
又はカルボキシル基活性化法により活性化されたグリコ
サミノグリカンをプロテインと反応させることにより製
造することができる。
以下、本発明のグリコサミノグリカン修飾プロテイン
をその製造法に関連してさらに詳しく説明する。
還元末端限定酸化法 この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端糖部
分を還元及び部分酸化することにより、該末端糖部分を
開裂させ且つアルデヒド基を形成せしめ、このアルデヒ
ド基とプロテインのアミノ基との間の還元アルキル化反
応を利用してグリコサミノグリカンで修飾されたプロテ
インを製造する方法であり、その方法で反応式で示せば
次のとおりである。
上記式中、 R1及びR2はそれぞれグリコサミノグリカンの還元性末
端糖部分の２位及び５位に通常みられる基を表し、具体
的にはR1がOHである場合、R2は例えばCOOM、CH2OSO3M等
であり、R1が例えばNH2、NHCOCH3、NHSO3M等である場
合、R2はCH2OHであり、ここでＭはカチオンを表し、具
体的には水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、
又はトリアルキルアミン（トリエチルアミンなど）もし
くはピリジン等の塩基が例示され、 はグリコサミノグリカンから還元性末端糖部分を除いた
グリコサミノグリカン残基を表し、はプロテインから
ｎ個のアミノ基を除いたプロテイン残基を表し、ｎは１
以上の整数を表す。
また、上記式において、 は、還元性末端糖部分の３位および４位（還元性末端糖
部分の開裂化合物の場合は上記部位に対応する部位）の
一方にグリコシド結合を介して結合しており、他の部位
には水酸基が結合している。
上記反応式の具体的一例を、グリコサミノグリカンと
してヒアルロン酸を使用した場合について、反応式Ａ−
HA−１および反応式Ａ−HA−２に示す。
上記式中、Acはアセチル基、ｎは１以上の整数をそれ
ぞれ示す。
上記式中、Acはアセチル基、ｎは１以上の整数をそれ
ぞれ示す。
本方法においては、先ず、上記式（IV）で示されるグ
リコサミノグリカンを還元して還元性末端糖部分を開裂
させて、式（Ｖ）の化合物とする。この還元に使用しう
る還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、
シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化ホウ素アル
カリ塩等が挙げられる。また、上記還元は適当な液体媒
体中、例えばホウ酸塩緩衝液（pH8.3）、リン酸塩緩衝
液（pH8.6）等の緩衝液；これら緩衝液とジメチルホル
ムアミド、アセトニトリル、ジオキサン、メタノール等
の有機溶媒との混合液中で、通常０〜40℃、好ましくは
15〜20℃の温度で行なうことができる。
上記還元剤の使用量は、その種類等によつても異なる
が、一般には式（IV）の化合物１モルに対して５〜50当
量、好ましくは10〜20当量の範囲内で用いるのが好都合
である。
得られる式（Ｖ）の化合物は次いで部分的に酸化され
る。その際、式（Ｖ）の化合物におけるR1がOHである場
合には式（VI）のアルデヒド化合物が生成し、一方、式
（Ｖ）の化合物におけるR2がCH2OHである場合には式（V
II）のアルデヒド化合物が生成する。この酸化反応に使
用しうる酸化剤としては、例えば、過ヨウ素酸ナトリウ
ム、過ヨウ素酸カリウムなどの過ヨウ素酸アルカリ塩等
が挙げられ、これらは通常、式（Ｖ）の化合物１モルに
対して１〜30当量、好ましくは５〜10当量の範囲内で用
いられる。また、該酸化反応は一般に０〜20℃、好まし
くは０〜５℃の範囲内の温度で行なうことができる。
生成する式（VI）又は（VII）のアルデヒド化合物
は、それ自体既知の還元アルキル化法に従い、プロテイ
ンのアミノ基と反応させることができ、これによつて本
発明が目的とする前記式（Ｉ）又は（II）で示されるグ
リコサミノグリカン修飾プロテインを得ることができ
る。上記還元アルキル化は、例えば、前述した如き液体
媒体中において式（VI）又は（VII）のアルデヒド化合
物とプロテインとを通常15〜60℃程度の温度で反応さ
せ、それと同時に又はその後に、例えばシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウム等の還元剤を用いて還元することにより
行なうことができる。
プロテインに導入しうるグリコサミノグリカンの量
は、プロテイン及び／又はグリコサミノグリカンの種類
やそれらの分子量、最終のグリコサミノグリカン修飾プ
ロテインの用途等によつて異なり一概に決定することが
できないが、個々のプロテインに適するグリコサミノグ
リカンの導入量は当業者であれば簡単な実験により容易
に決定しうるであろう。しかし一応の目安として一般に
言えば、修飾すべきプロテインの重量を基準にして、グ
リコサミノグリカンは１〜99.9重量％、好ましくは90〜
95重量％の範囲内の割合で導入するのが適当であると考
えられる。また、前記式（Ｉ）又は（II）のグリコサミ
ノグリカン修飾プロテインについて言えば、ｎは一般に
１〜100、好ましくは１〜10の範囲内（平均値）にある
ことができる。
還元末端ラクトン化法 この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端糖部
分を酸化することにより、該末端糖部分を開裂させ、更
にラクトンを形成せしめ、このラクトンとプロテインの
アミノ基との反応を利用してグリコサミノグリカンで修
飾されたプロテインを製造する方法であり、その方法を
反応式で示せば次のとおりである。
式中、 Ａはカリウム又はナトリウムを表わし、 、ｎ、 R1及びR2は前記のとおりである。
上記式中、Acはアセチル基、ｎは１以上の整数をそれ
ぞれ示す。
上記式中、Acはアセチル基、ｎは１以上の整数をそれ
ぞれ示す。
なお、上記式において、 は、還元性末端糖部分の３位および４位（還元性末端糖
の開裂化合物の場合は上記部位に対応する部位）の一方
にグリコシド結合を介して結合しており、他の部位には
水酸基が結合している。
上記反応式の具体的一例を、グリコサミノグリカンと
してヒアルロン酸を使用した場合について、反応式Ｂ−
HA−１および反応式Ｂ−HA−２に示す。
本方法において、先ず、式（IV）で示されるグリコサ
ミノグリカンを酸化して還元性末端糖部分を開裂させて
式（VIII）のカルボキシル化合物とする。この酸化に使
用しうる酸化物としては、例えば、ヨウ素、臭素等が挙
げられ、これらは式（IV）の化合物１モルに対して通常
２〜20当量、好ましくは５〜15当量の割合で用いるのが
適当である。該酸化反応は通常、前述した如き液体媒体
中において、０〜40℃、好ましくは15〜20℃の温度で行
なうことができる。
生成する式（VIII）の化合物は次いで酸で処理するこ
とにより式（IX）のラクトン化合物にすることができ
る。ここで用いうる酸としては、強酸性陽イオン交換樹
脂、例えばダウエックス50（商品名；ダウ・ケミカル社
製）、アンバーライトIR120（商品名；オルガノ（株）
製）等を挙げることができる。
得られる式（IX）のラクトン化合物は次いでプロテイ
ンと反応させることにより、前記式（III）で示される
グリコサミノグリカン修飾プロテインを製造することが
できる。式（IX）のラクトン化合物とプロテインとの反
応は、該ラクトン化合物をトリアルキルアミン塩として
反応させるか、プロテインとの混合液を水酸化ナトリウ
ム水溶液でpHを４〜７にした後、０〜70℃、好ましくは
15〜50℃で反応させる。プロテインに導入しうるグリコ
サミノグリカンの量は、プロテイン及び／又はグリコサ
ミノグリカンの種類やそれらの分子量、最終のグリコサ
ミノグリカン修飾プロテインの用途等によつて異なり、
一概に決定することができないが、個々のプロテインに
適するグリコサミノグリカンの導入量は当業者であれば
簡単な実験により容易に決定しうるであろう。しかし一
応の目安として、一般的に言えば、修飾すべきプロテイ
ンの重量を基準にして、グリコサミノグリカンは１〜9
9.9重量％、好ましくは90〜95重量％の範囲内の割合で
導入するのが適当であると考えられる。また、前記式
（III）のグリコサミノグリカン修飾プロテインについ
て言えば、ｎは一般に１〜100、好ましくは１〜10の範
囲内（平均値）にあることができる。
カルボキシル基活性化法 グリコサミノグリカンはごく少数の例外（例えばケラ
ト硫酸及びケラトポリ硫酸）を除いて下記式 で示されるウロン酸部分を含有している。なお、上記式
はグリコサミノグリカンの鎖中のウロン酸部分を表して
おり、１〜４位の置換基はグリコサミノグリカンの種類
が特定されると自ずと特定されるものであるので省略し
た。
本方法は、このウロン酸部分のカルボキシル基を利用
してこれをプロテインのアミノ基と結合させることによ
り、グリコサミノグリカン修飾プロテインを製造する方
法である。
その方法は、先ずグリコサミノグリカンをペプチド化
学の分野でよく知られている方法に従つてグリコサミノ
グリカンのウロン酸部分のカルボキシル基を活性化し、
次いでプロテインと反応させることからなる。
グリコサミノグリカンのウロン酸部分のカルボキシル
基を活性化する方法としては、グリコサミノグリカンを
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフエノー
ル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキ
シピペリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、2,4,5
−トリクロロフエノール等のカルボン酸活性化剤と反応
させ、該カルボキシル基を活性エステル基に変える方式
が挙げられる。
より具体的には、例えば、グリコサミノグリカンを適
当なアミン（例えば、トリ−ｎ−ブチルアミン、トリエ
チルアミン、ピリジン等）との塩に変え、それを適当な
溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジメ
チルスルホキシド等）中において、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド等のカルボン酸活性化剤と適当な縮合剤、例
えば１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の存
在下に０〜50℃の温度において反応させることによつ
て、カルボキシル基が活性化されたグリコサミノグリカ
ンが得られる。
次いで、このカルボキシル基が活性化されたグリコサ
ミノグリカンをプロテインと反応させれば、本発明のグ
リコサミノグリカン修飾プロテインを得ることができ
る。
カルボキシル基活性化グリコサミノグリカンの水溶液
またはpHが６〜９の範囲のリン酸塩緩衝液にプロテイン
の水溶液を加えて０〜50℃、好ましくは15〜25℃で30分
〜20時間反応させる。プロテインに導入しうるグリコサ
ミノグリカンの量は、プロテイン及び／又はグリコサミ
ノグリカンの種類やそれらの分子量、最終のグリコサミ
ノグリカン修飾プロテインの用途等によつて異なり、一
概に決定することができないが、個々のプロテインに適
するグリコサミノグリカンの導入量は当業者であれば簡
単な実験により容易に決定しうるであろう。しかし一応
の目安として、一般的に言えば、修飾すべきプロテイン
の重量を基準にして、グリコサミノグリカンは１〜99.9
重量％、好ましくは90〜95重量％の範囲内の割合で導入
するのが適当であると考えられる。
上記のカルボキシル基活性化法によれば、グリコサミ
ノグリカンのウロン酸部分の少なくとも一部のカルボキ
シル基がアミド結合を介してプロテインに結合している
グリコサミノグリカン修飾プロテインが得られる。
以上に述べた各種の方法で製造されるグリコサミノグ
リカン修飾プロテインの分離、精製は、例えば、反応液
を透析膜や限外濾過膜を用いて脱塩後、陰イオン交換体
または陽イオン交換体で未反応のグリコサミノグリカン
やプロテインと分離精製することは容易である。又、分
子量の差を利用してゲル濾過法で分離精製することも容
易である。更にプロテインによつては酵素阻害剤や基質
及び抗体を固定化した担体を用いて親和性の差で分離精
製することも可能である。
本発明に従いプロテインを修飾するために使用しうる
グリコサミノグリカンは特に制限されるものではなく、
目的とするグリコサミノグリカン修飾プロテインに要求
される特性、修飾の目的等に応じて広い範囲から選ぶこ
とができるが、具体的には、例えば、コロミン酸、ヒア
ルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、テイ
クロン酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、
ケラト硫酸、ケラトポリ硫酸等或いはこれらの誘導体、
例えばコンドロイチンポリ硫酸等から適当に選んで使用
することができる。しかして、例えば抗血栓剤、抗動脈
硬化剤等の如き目的のためには、コンドロイチン硫酸、
コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デ
ルマタン硫酸などが適しており、また、抗リウマチ剤、
抗炎症剤等の如き目的に対しては、ヒアルロン酸、デル
マタン硫酸、コンドロイチン硫酸などが好適に使用され
る。上記グリコサミノグリカンはそれぞれ単独で使用す
ることができ、或いは２種以上を併用してもよい。
一方、かかるグリコサミノグリカンによつて修飾しう
るプロテインもまた、特に制限されるものではないが、
一般には、医薬等の分野で有用な、ヒトを含む各種動物
由来、微生物由来、植物由来或いは化学的に又は遺伝子
工学的に製造された生理活性蛋白質が包含される。具体
的には例えば、サイトカイン［例：各種インターフエロ
ン（インターフエロン−α、インターフエロン−β、イ
ンターフエロン−γ）、インターロイキン−２、インタ
ーロイキン−３など］、ホルモン［例：インスリン、成
長ホルモン放出因子（GRF）、カルシトニン（またはそ
の誘導体（エルカトニンなど）、カルシトニン遺伝子関
連ペプチド（CGRP）、心房性ナトリウム利尿ホルモン
（ANP）、バソプレシン、コルチコトロピン放出因子（C
RF）、バソアクテイブインステイナルペプチド（VI
P）、セクレチン、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α
−MSH）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、コレシスト
キニン（CCK）、グカゴン、副甲状腺ホルモン（PTH）、
副甲状腺ホルモン関連蛋白質（PTHrP）、ソマトスタチ
ン、エンケフアリンなど］、成長因子［例：成長ホルモ
ン（GH）、インスリン様成長因子（IGF−Ｉ、IGF−I
I）、β−神経成長因子（β−NGF）、塩基性繊維芽細胞
成長因子（bFGF）、トランスフオーミング成長因子−β
（TGF−β）、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺
激因子（Ｇ−CSF）、顆粒玉マクロフアージコロニー刺
激因子（GM−CSF）、血小板由来成長因子（PDGF）、上
皮細胞成長因子（EGFなど）］、酵素［例：組織プラス
ミノーゲン活性化因子（TPA）、エラスターゼ、スーパ
ーオキシドジスムターゼ（SOD）、ビリルビンオキシダ
ーゼ、カタラーゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、サーモ
ライシン、トリプシン、キモトリプシン、Vsプロテアー
ゼ、ペプチン、パパイン、ヒアルロニダーゼ、コンドロ
イチンABCリアーゼ、アスパラギナーゼなど］、細胞接
着ドメインペプチド［例:RGD（フィブロネクチンの細胞
接着ドメインペプチド）またはその関連ペプチド、YIGS
R（ラミニンの細胞接着ドメインペプチド）またはその
関連ペプチドなど］、その他の蛋白質［例：ユビキチ
ン、インスリン分泌活性化蛋白（IAP）、血清胸腺因子
（STF）、ペプチド−Ｔ、アルブミン、グロブリン、ト
ランスフエリン、リポ蛋白、リピドＡ誘導体、家ダニ蛋
白、トリプシンインヒビターなど］を挙げることができ
る。
本発明のグリコサミノグリカン修飾プロテインは、前
記式（Ｉ）、（II）又は（III）で示されるように、グ
リコサミノグリカン残基がプロテインに化学的に結合し
ており、グリコサミノグリカンの含有量は、修飾された
プロテインの重量を基準にして一般には１〜99.9重量
％、好ましくは90〜95重量％の範囲内にあることができ
る。
一般的にグリコサミノグリカン修飾プロテインはプロ
テインそれ自身の抗体とは反応しにくいばかりでなく、
抗体産生能（免疫原性）もかなり低下する（後記実施例
参照）。
また、体内に投与されたグリコサミノグリカン修飾プ
ロテインのプロテインのもつ生物活性（生理活性、薬理
活性、酵素活性）が未修飾プロテインの活性よりも持続
性があることから体内での安定性が増加する。
本発明のグリコサミノグリカン修飾プロテインを医薬
品として適用する際には、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠
剤、カプセル剤、シロツプ剤、懸濁剤もしくは液剤等の
剤型に製剤して、または原末のまま経口投与することが
でき、或いは注射剤として静脈内投与、動脈内投与、門
脈内投与、胸腹内投与、筋肉内投与、皮下投与または腫
瘍内投与してもよい。また、注射用の粉末にして用時調
製してもよく、座剤等の剤型にして経腸または非経口投
与してもよい。経口、経腸もしくは非経口投与に適した
医薬用の有機または無機の固体または液体の担体もしく
は希釈剤を本発明のグリコサミノグリカン修飾プロテイ
ンを含む医薬品の調製に用いることができる。さらに、
安定剤、湿潤剤、乳化剤や浸透圧を変えるための物質を
配合したり、配合剤の適切なpHを維持するための塩類を
補助薬剤として適宜用いることができる。本発明のグリ
コサミノグリカン修飾プロテインの臨床投与量は、対象
となる病態、症状、年齢等により異なるが、一般には、
経口投与では１日量１〜5000mgをそして注射剤としては
１回量１〜100mgを連続投与または間欠投与することが
好ましい。
［実施例］ 次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
以下の実施例において、各酵素活性は以下の条件下に
より測定した。
［酵素活性の単位測定］ カタラーゼ活性:pH7.0及び25℃の条件下で、過酸化水素
の濃度が10.3から9.2mMまでの範囲で、１分間に1.0μＭ
の過酸化水素を分解する時、１ユニツト（Ｕ）とする。
リゾチーム活性:pH6.2及び35℃の条件下で、１分間に54
0nmでグラム陽性細菌（ML−Cell）懸濁液の吸光度が0.0
01減少する酵素量を、１ユニツトとする。
ヒアルロニダーゼ:pH6.2及び37℃で、１分間にヒアルロ
ン酸から１μＭの不飽和二糖を遊離する酵素量を、１ユ
ニツトとする。
エラスターゼ:pH8.5及び25℃で、１分間に１μＭのＮ−
アセチル−トリ−Ｌ−アラニン・メチルエステルを加水
分解する酵素量を、１ユニツトとする。
ウリカーゼ:pH8.5及び25℃で、１分間に１μＭの尿酸を
酸化するのに必要な酵素量を、１ユニツトとする。
ウロキナーゼ:pH7.5及び37℃で、プラスミノーゲンに作
用させ、α−カゼインから生成する過塩素酸に溶解する
物を、Δ275で測定し、１分間に1.0変化させる酵素量
を、１ユニツトとする。
アスパラギナーゼ:pH8.6及び37℃で、１分間にＬ−アス
パラギンから1.0μＭのアンモニアを生成する酵素量
を、１ユニツトとする。
スーパーオキシドジスムターゼ:pH7.8及び25℃でキサン
チンオキシダーゼの活性を50％阻害するに必要なSODの
量を１ユニツトとする。
電気泳動：アセチルセルロース膜（Separax JOOKOO C
O.,LTD.）を使用し、0.1M−ピリジン／ギ酸／緩衝液（p
H3.0）、0.5mA/cmの条件で30分泳動し、Coomassie Blu
e及びAlucian Blueで染色した。
HPLCによる分子量測定：東ソー株式会社製造のカラムG6
000PW×２を使用し、0.2M−食塩水溶液で溶出し、HAの
キヤリブレシヨン カーブからHA−Catalaseの分子量を
測定する。
免疫学的活性（免疫原性）:Swiss−Webster系雌のマウ
スを４匹を一群として、腹腔（intraperitoneal、以下
i.p.と称す）に週に一回、蛋白質として1mg分、12時間
にわたって被検物質を投与する。なお、被検物質は0.05
Mリン酸緩衝液（pH7.0;以下PBSと略称する）に溶解して
投与する。０、３、６、９及び12週目に、眼窩後の血管
（retoroorbital plexus）から採血して−20℃に保存
する。それぞれの血清はVollerら8)の方法に従い、HPO
−ELISA（Horseradish peroxidaseを用いるenzyme−li
nked immunosorbent assay法）で感作抗原に対する抗
体の力価（抗体価）を測定した。即ち、抗原を炭酸塩緩
衝液（0.5M、pH9.5）で10μg/mlに希釈し、100μを使
用する。この抗原溶液をプレート（Nunc immuno II mic
rotiter plates）のウエルに注入し、４℃で一晩インキ
ュベートし、ツイーン（Tween）入り生理食塩（0.05％T
ween20）で３回洗浄する。試験に用いられる血清をツイ
ーン入りPBSで希釈し、100μ加える。三つのコントロ
ール即ち、抗原コントロール、抗血清コントロールおよ
び正常マウス血清コントロールが作られたことになる。
室温で１時間静置し、各々に100μのHPO−結合山羊抗
マウスイムノグロブリン（HPO−conjuagated goat an
timouse immunoglobulins,IgG＋IgA＋IgM）を加えて、
室温で１時間30分インキユベートする。100μのオル
ソ−フエニレンジアミン基質（ｏ−phenylenediamine
substrate）を加えて10分間インキユベートし、0.01ml
の4N−硫酸を加えて反応を中止する。力価は光学密度が
コントロールの血清を対称にして0.01となるところの希
釈倍率で表す。
マウス虚血足浮腫に及ぼす影響:8週齢のddy系雄のマウ
スを保定器にて保定し、縫合糸（ブレイン２号）で右下
欄後肢を一周縛り、一方を固定し、もう一方に500gのオ
モリを吊して一定時間虚血を行う。実験は虚血前及び60
分後の足蹠厚をノギスで測定する。その後、足蹠を切断
し足蹠重量を測定する。投与群はコントロール群（生理
食塩水を虚血直前に静注）、カタラーゼ及びHA−カタラ
ーゼを虚血開始30分前及び虚血直前にカタラーゼは1000
0単位/kgそしてHA−カタラーゼは2000単位/kgを投与す
る。一群５匹を用いる。
効果の判定は、コントロールに対する検体の（虚血足
の足蹠厚（mm）−対照足の足蹠厚（mm））で表す。又、
コントロールに対する検体の（虚血足の足蹠重量（mm）
−対照足の足蹠重量（mg））で表す。
実施例1.還元末端限定酸化法によるGAG修飾プロテイン
の調製 還元末端限定酸化グリコサミノグリカンの調製 A.還元末端残基開環ヒアルロン酸の調製（Ｒ−HA） 2000mgのヒアルロン酸（MW10000）を200mlの0.05Mホ
ウ酸塩緩衝液（pH8.3）に溶解し、182mgの水素化ホウ素
ナトリウムを加え、室温で５時間反応した。反応液を酢
酸でpH4.5にして、エタノールを加えて生じた沈殿を濾
取した。沈殿を200mlの水に溶解し、1000mlの陽イオン
交換樹脂（ダウエツクス50（H+））を通過させた。通過
液と水洗浄液を合わせて酢酸ナトリウム飽和のエタノー
ルを加えて生じた沈殿を濾取した。
ロット番号 100 収量:1800mg B.還元末端限定酸化ヒアルロン酸の調製（Ｏ−HA） 上記A.で調製されたＲ−HA1700mgを250mlの40mMイミ
ダゾール塩酸塩（pH6.5）に溶解し、０℃にして139.96m
gの過ヨウ素酸ナトリウムを加えて１時間反応した。反
応液にエタノールを加えて生じた沈殿を濾取し、沈殿を
水に溶解して再度エタノールを加えて沈殿物を得た。こ
の沈殿（Ｏ−HA）は即座にリン酸塩緩衝液または水に溶
解して、プロテインとの反応に用いた。
ロット番号 110−１ 収量:1600mg C.他のグリコサミノグリカンの還元末端限定酸化物の調
製（Ｏ−GAG） ヒアルロン酸（MW100万 HA100）、コンドロイチン硫
酸（牛気管軟骨由来CS（Ｔ）、鮫軟骨由来CS（Ｓ）、鯨
軟骨由来CS（Ｗ））、デルマタン硫酸（豚皮由来DS）、
ヘパリン（豚小腸由来Hep）、ヘパリン硫酸（豚腎由来H
S）を原料として、上記のA.に準じて表−１の条件で還
元末端残基開環グリコサミノグリカン（Ｒ−GAG）を調
製した。ひきつづき、上記のB.の方法に準じて表−２の
条件で還元末端限定酸化グリコサミノグリカン（Ｏ−GA
G）を調製した。
［Ｉ］ ヒアルロン酸修飾カタラーゼの調製 100mgのロツト番号110−２を10mlの0.005Mリン酸塩緩
衝液（pH8.0）に溶解し、2.3mgのカタラーゼ（牛肝臓由
来）を加えて室温で６時間反応し、0.4mgのシアノ水素
化ホウ素ナトリウムを加えて室温で20時間反応した。反
応液を限外濾過装置（分子量30万カツトの膜）で低分子
量の物を除去した。その後、DEAEイオン交換樹脂クロマ
トグラフイーで精製して、透析膜で脱塩後、凍結乾燥し
た。
ロツト番号 120−１ 収量:30.1mg カタラーゼ含量:2.1％ ヒアルロン酸含量:97.9％ 活性：未修飾カタラーゼの74.5％ ［α］D:−78.0（Ｃ＝１、H2O） 電気泳動：第１図参照 アセチルセルロース膜（SEPARAX JOOKOO CO,.LT
D） 0.1M formic acid/pyridine（pH3.0） 0.5mA/cm、30min ［II］ ヒアルロン酸修飾カタラーゼの調製 100mgのロツト番号110−２とカタラーゼ（アスペルギ
ルスニガー）1mgを上記［Ｉ］に準じて調製した。得ら
れたヒアルロン酸修飾カタラーゼは以下の通りであつ
た。
ロツト番号 120−２ 収量:29.0mg カタラーゼ含量:0.92％ ヒアルロン酸含量:99.08％ 活性：未修飾カタラーゼの85.1％ ［α］D:−78.8（Ｃ＝１、H2O） 電気泳動：第２図参照 アセチルセルロース膜（SEPARAX JOOKOO CO,.LT
D） 0.1M formic acid/pyridine（pH3.0） 0.5mA/cm、30min ［III］ ヒアルロン酸修飾ウリカーゼの調製 100mgのロツト番号110−２を10mlのリン酸緩衝撃液
（pH8.0）に溶解し、ウリカーゼ（キヤンジダ由来）2.5
mgを加えて室温で10時間反応し、0.4mgのシアノ水素化
ホウ素ナトリウムを加えて更に、20時間反応した。反応
液にエタノールを加えて生じた沈殿を濾取し、沈殿を水
に溶解して、DEAEイオン交換クロマトグラフイで精製し
た。得られたヒアルロン酸修飾ウリカーゼは以下の通り
であつた。
ロツト番号 120−３ 収量:23.5mg ウリカーゼ含量:1.8％ ヒアルロン酸含量:98.2％ 活性：未修飾ウリカーゼの73.4％ ［α］D:−77.9（Ｃ＝１、H2O） 電気泳動：第３図参照 アセチルセルロース膜（SEPARAX JOOKOO CO,.LT
D） 0.1M formic acid/pyridine（pH3.0） 0.5mA/cm、30min ［IV］ ヒアルロン酸修飾アスパラギナーゼの調製 100mgのロツト番号110−２を10mlの0.05Mリン酸塩緩
衝液（pH8.0）に溶解し、Ｌ−アスパラギナーゼ（大腸
菌由来）5mgを加えて室温で10時間反応し、1mgのシアノ
水素化ホウ素ナトリウムを加えて20時間反応した。反応
液にエタノールを加えて生じた沈殿を濾取し、沈殿を水
に溶解して、DEAEイオン交換クロマトグラフイで精製し
た。得られたヒアルロン酸修飾アスパラギナーゼは以下
の通りであつた。
ロツト番号 120−４ アスパラギナーゼ含量:4.8％ ヒアルロン酸含量:95.2％ 活性：未修飾アスパラギナーゼの84.6％ ［α］D:−76.9（Ｃ＝１、H2O） 電気泳動：第４図参照 アセチルセルロース膜（SEPARAX JOOKOO CO,.LT
D） 0.069M ベロナール緩衝液（pH8.6） 0.5mA/cm、40min ［Ｖ］ その他のグリコサミノグリカン修飾プロテイン
の調製 ロツト番号111−116でカタラーゼ（牛肝臓由来）、ス
ーパーオキシドジスムターゼ（牛赤血球由来）、ヒアル
ロニダーゼ（牛睾丸由来）、ウロキナーゼ（人腎細胞由
来）及びリゾチーム（卵白由来）を表−３に示した条件
で、上記の［Ｉ］の方法に準じて調製した。得られた生
成物の分析値を表−４に示した。
代表でロツト番号121−１について電気泳動を示した
（第５図参照）。条件は［Ｉ］と同じである。
［VI］ 免疫原性（免疫学的活性） アスペルギルス・ニガー由来のカタラーゼ及び［II］
で得た本発明によるヒアルロン酸修飾カタラーゼ（ロッ
ト番号120−２）を、それぞれ感作抗原として免疫し、
免疫動物から採取した血清中の抗体の力価（抗体価）を
測定した。抗体価の測定は、感作抗原と同一の物質をそ
れぞれプレートに吸着させた固相化抗原を使用し、前記
のELISA法によって行った、結果を表−５に示す。表
中、抗体価は血清の希釈倍率で表した。
HA−カタラーゼはカタラーゼと比較して免疫原性（抗
原性）が低下していた。
［VII］ マウス虚血足浮腫に及ぼす影響（後肢虚血再
流による・O- 2産生試験） HA−カタラーゼはロツト番号120−１で製造したHA−
カタラーゼ10mgを5.2mlの生理食塩水に溶解し、0.22μ
ｍの膜（日本ミリポア工業株式会社製マイレクスGV）で
濾過し、1mlずつアンプルに分注して注射用の製剤とし
たものを使用した。
該製剤は、アンプル当り600単位（Ｕ）のカタラーゼ
を含む。
次の被検物質について前記の方法で動物実験を行っ
た。
カタラーゼ：牛肝臓由来 HA−カタラーゼ：ロット番号120−１ （HA＋カタラーゼ）：ヒアルロン酸（MW100万HA100）と
上記カタラーゼの混合物 以上の結果から虚血30分前投与では未修飾カタラーゼ
は効果を示さないのに比較して、HA−カタラーゼは明ら
かに効果を示した。このことは、HA−カタラーゼが血中
で安定であり、持続性を持つているためと判断できた。
［VIII］ コンドロイチン硫酸修飾エルカトニンの調製 ロツト番号111で調製したＯ−SC（Ｔ）100mgを10mlの
0.05Mリン酸塩緩衝液（pH8.0）に溶解し、10mgのエルカ
トニン（合成カルシトニン誘導体）を加えて20時間反応
した。次いで、10mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを
加えて20時間反応した。反応液を限外濾過装置（分子量
10000カツトの膜）で未反応のエルカトニンを除去し、
凍結乾燥した。得られたコンドロイチン硫酸修飾エルカ
トニン（ロツト番号127）は以下の通りであつた。
収量:98.2mg エルカトニン含量:5.50％ コンドロイチン硫酸含量:94.50％ ［α］D:−21.9（Ｃ＝１、H2O） ［IX］ コンドロイチン硫酸修飾エルカトニン（ロツト
番号127）の活性及び血中での安定性 １）エルカトニン及びコンドロイチン硫酸修飾 エルカトニン（ロット番号127）のそれぞれをエルカ
トニン５μg/Kg相当量、ラットの尾静脈から投与して、
この時の血中カルシウム低下量の最大値を100として、
血中カルシウム低下量が50となる時間を測定した。この
結果を示すと、 エルカトニン 48時間 ロツト番号127 72時間 であつた。以上からロツト番号127はゆつくりと効果を
発現するものと判断できた。
２） ［１−14C］アラニン（50mCi/mmol）を原料とし
て調製したエルカトニン（27.6μCi/mg）とこれをロツ
ト番号111で調製したＯ−CS（Ｔ）で上記の［VIII］に
準じて調製したコンドロイチン硫酸修飾エルカトニン
（1.52μCi/mg）をエルカトニン５μg/kg相当量、家兎
に静脈投与して、２分後の血中濃度を100として半減期
を求めた。その結果は、 エルカトニン 10分 コンドロイチン硫酸エルカトニン 50分 実施例2.カルボキシル基活性化法によるGAG修飾プロテ
インの調製 カルボキシル基活性グリコサミノグリカンの調製 A.カルボキシル基活性化ヒアルロン酸の調製 a.2800mgのヒアルロン酸（MW100万）のトリ−ｎ−ブチ
ルアミン塩を280mlのジメチルホルムアミドに溶解し、
水溶性カルボジイミド（WSC;1−エチル−３−（ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド）0.17ml及びＮ−
ヒドロキシスクシニミド0.23gを加えて室温で20時間反
応した。反応液に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え
て生じた沈殿を濾取した。
NS−HA ロツト番号 200 収量:2500mg b.2800mgのヒアルロン酸（MW100万）のトリ−ｎ−ブチ
ルアミン塩を280mlのジメチルフオルムアミドに溶解
し、WSC 0.17ml及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル0.27gを加えて室温で20時間反応した。反応液を上記
ａと同様にして処理した。
NB−HA ロツト番号 2001−１ 収量:2680mg c.2800mgのヒアルロン酸のトリ−ｎ−ブチルアミン塩を
280mlのジメチルフオルムアミドに溶解し、WSC 0.17ml
及びｐ−ニトロフエノール0.28gを加えて室温で20時間
反応した。反応液を上記ａと同様に処理した。
PN−HA ロツト番号 200−２ 収量:2775mg B.カルボキシル基活性化グリコサミノグリカンの調製 コンドロイチン硫酸（牛気管軟骨由来CS（Ｔ）、鮫軟
骨由来CS（Ｓ）、鯨軟骨由来CS（Ｗ）、ヘパリン（豚小
腸由来Hep）、ヘパラン硫酸（豚腎由来HS）、デルマタ
ン硫酸（豚皮由来DS））を表−６の条件で上記Ａに準じ
て調製した。
［Ｉ］ ヒアルロン酸修飾カタラーゼの調製 100mgのロツト番号200を水20mlに溶解し、カタラーゼ
（牛肝臓由来）2.5mgを加えてpH7.0で室温で20時間反応
した。反応液を０℃に冷却し、0.1N水酸化ナトリウムで
pH10.0にしてすぎに酢酸で中和して30万カツトの限外濾
過の装置で処理し、未反応のカタラーゼを除去した。得
られたカルボキシル基活性化ヒアルロン酸修飾カタラー
ゼは以下の通りであつた。
ロツト番号 210 収量:44mg カタラーゼ含量:2.3％ ヒアルロン酸含量:97.7％ 活性：未修飾カタラーゼの84.3％ ［α］D:−77.9（Ｃ＝１、H2O） ［II］ コンドロイチン硫酸修飾スーパーオキシドジス
ムターゼの調製 100mgのロツト番号201とスーパーオキシドジスムター
ゼ（牛赤血球由来）2.5mgを上記［Ｉ］の方法に準じて
反応した。得られたカルボキシル基活性化コンドロイチ
ン硫酸修飾スーパーオキシドジスムターゼは以下の通り
であつた。
ロツト番号 211 収量:41.2mg スーパーオキシドジスムターゼ含量:2.0％ コンドロイチン硫酸含量:98.0％ 活性：未修飾スーパーオキシドジスムターゼの81.4％ ［α］D:−78.0（Ｃ＝１、H2O） 実施例3.還元末端ラクトン法によるGAG修飾プロテイン
の調製 還元末端ラクトンGAGの調製 A.還元末端ラクトンヒアルロン酸の調製 500mgのヒアルロン酸（MW10000）を50mlの水に溶解
し、これに5mlの0.1Mヨウ素のメタノール溶液を加えて
室温で６時間反応した。その後、反応液に0.1N水酸化カ
リウムを約5ml加えて遊離のヨウ素の色を消失させ、こ
の溶液に酢酸カリウム飽和エタノールを加えて生じた沈
殿を濾取した。沈殿を50mlの水に溶解し、50mlの強酸性
イオン交換樹脂（ダウエツクス50（H+））を５℃で20時
間接触させ、得られた濾液にトリ−ｎ−ブチルアミンを
加えて中和後、エーテルで過剰のアミンを除去してから
凍結乾燥した。得られた白色粉末が還元末端ラクトンヒ
アルロン酸のトリ−ｎ−ブチルアミン塩である。
ロツト番号 310 収量:410mg ソモジ−ネルソン法での還元糖の有無：無 ［Ｉ］ ヒアルロン酸修飾ペプチド（Ｈ−Arg−Gly−As
p−Val−NH2;RGDV）の調製 60mgのロツト番号310を20mlのジメチルフオルムアミ
ドに溶解し、2.5mgのRGDV（細胞接着ドメインベプチド
の一種）のジメチルフオルムアミド溶液を加えて60℃で
２時間反応した。反応液に25％の酢酸ナトリウム水溶液
を10ml加えて室温で30分静置し、その後、エタノールを
加えて生じた沈殿を濾取した。沈殿を水に溶解して分子
量5000カツトの膜の限外濾過装置で未反応のRGDVを除去
した後、凍結乾燥した。得られたヒアルロン酸修飾RGDV
は以下の通りであつた。
ロツト番号:320 収量:40.2mg RGDV含量:3.3％ ヒアルロン酸含量:96.7％ 比較例：特開昭62−255435号によるコンドロイチン硫酸
修飾スーパーオキシドジスムターゼと本発明との比較例 １） 水溶性カルボジイミドによるコンドロイチン硫酸
のエステルの生成 コンドロイチン硫酸（牛気管軟骨由来CS（Ｔ））25mg
を水10mlに溶解し、0.1N−塩酸でpHを5.0とした後、水
溶性カルボジイミド（WSC;1−エチル−３−（ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を各0.0436、
0.145、0.436、1.45、4.36、14.5及び43.6mgずつ加えて
室温で６時間反応した。反応液を0.015M−リン酸塩緩衝
液（pH7.0）に対して透析し、セルロースアセテート膜
で（0.1M−ピリジン／ギ酸緩衝液pH3.0、30分、0.5mA/c
m）の条件で電気泳動を行つた。更に、WSCを43.6mgを加
えて反応したものを0.1N−水酸化ナトリウム水溶液を加
えて１時間処理したものも電気泳動した。その結果、明
らかにCS（Ｔ）自身がエステル化されているのが判つた
（第６図参照）。
２） 水溶性カルボジイミドによるスーパーオキシドジ
スムターゼそれ自身の重合とコンドロイチン硫酸修飾SO
Dの重合体の証明 5mgのSODを10mlの水に溶解し、0.1N−塩酸でpHを5.0
とした後、WSCを2.5mg加えて室温で６時間反応した。0.
015M−リン酸塩緩衝液（pH7.0）に対して透析した。こ
の水溶液をロツト番号Ｂとする。
また、特開昭62−255435に従い、CS（Ｔ）25mgを水10
mlに溶解し、pHを5.0とした後、SOD 5mgとWSC 12.5mg
を加えて室温で６時間反応した。反応液を上記の１）に
準じて処理した。この水溶液をロット番号Ｃとする。
３） ゲルクロマトグラフによる溶出パタンの違い セファロースCL4B（フアルマシア社 スエーデン）
（1.2×100cm）のカラムで0.05−Ｍ−リン酸塩の0.3M−
食塩溶液（pH7.0）を展開溶媒として、各チユーブに3.4
5mlずつ溶出し、ゲルクロマトグラフィーを行つた。そ
の結果を第７図及び第８図に示した。第７図のＡは使用
したCS（Ｔ）とSODの混合液を、Ｂはロツト番号Ｂを、
Ｃはロツト番号Ｃを、Ｄは本発明の実施例１のロツト番
号121−２を、そして第８図のＥはロット番号211を示し
た。以上の結果から、分子の中にカルボキシル基とアミ
ノ基を同時に所有している蛋白（この場合はSOD）とカ
ルボキシル基を持つコンドロイチン硫酸をWSCで反応す
ると、複雑な重合体が生成されることが証明される。
４） また、SODの含量が同じ程度であつても、活性はW
SCで修飾すると本発明より低い数値を示した。
WSC法（ロツト番号Ｃ）：未修飾SODの44.4％ 本発明（ロツト番号121−２）：未修飾SODの69.9％ 本発明（ロット番号211）：未修飾SODの81.4％
【図面の簡単な説明】
第１〜５図は実施例で得られるグリコサミノグリカン修
飾プロテイン及びグリコサミノグリカンとプロテインと
の混合物の電気泳動図であり、 第６図は比較例におけるコンドロイチン硫酸エステル電
気泳動図であり、 第７図及び第８図はゲルクロマトグラフである。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−67300（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−142122（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−60380（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−122629（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−146589（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−255435（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−58783（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−215498（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−231078（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−231077（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−170720（ＪＰ，Ａ) 特許2766303（ＪＰ，Ｂ２) 特表 平４−503951（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／1332（ＷＯ，Ａ１) 国際公開89／9624（ＷＯ，Ａ１) 欧州公開344068（ＥＰ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 5/00 - 14/825 C07K 1/02 C12N 9/00 - 9/99 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グリコサミノグリカンを酸化することによ
    って還元性末端糖部分を開裂させ、次いで酸処理するこ
    とにより形成されるラクトン化合物のカルボニル基とプ
    ロテインのアミノ基とをアミド結合を介して結合して得
    られることを特徴とするグリコサミノグリカン修飾プロ
    テイン。
  2. 【請求項２】式 式中、 はプロテインからｎ個のアミノ基を除いたプロテイン
    残基を表わし、 ｎは１〜100の数であり、 はグリコサミノグリカンから還元性末端糖部分を除いた
    グリコサミノグリカン残基を表わす、 で示されるグリコサミノグリカン修飾プロテイン。
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