【発明の詳細な説明】外来・異種遺伝子を有する繊維芽細胞を含んでなる創傷治癒組成物
本発明は、治療が困難である皮膚損傷を治療するための組成物に係る。表面積が
大きい火傷の場合、損傷によって破壊された皮膚領域を復元することは、特に皮
膚の過半の面積が損傷されている場合は重大な問題である。また、例えば新生物
疾患や慢性皮膚病変などの他の疾病に場合においても損傷皮膚領域を復元するこ
とが重大な問題となる場合が多い。
遺伝子トランスフェクションされた繊維芽細胞それ自体は、当該技術水準に照ら
して既に公知である。国際特許出願第ＷＯ ９５／０７１０５は、免疫応答が遺
伝子トランスフェクションされた腫瘍細胞かまたは未修飾腫瘍細胞の何れかと遺
伝子トランスフェクションされたオートロガス繊維芽細胞とによって免疫化する
ことによって刺激されるものである、患者の中枢神経系における腫瘍細胞の成長
を阻害または防止する方法を記載している。使用するサイトカインは、先ず免疫
系を刺激するサイトカインである。
ＤＥ−ＯＳ ４４ ０６ ０７３は、やはりアルバートルートウィッヒ大学病院
コンプレックス−フライブルクの出願人名で出願されたものであるが、ヒトのク
ローン産生性繊維芽細胞を調製するための一般的な方法および繊維芽細胞を遺伝
子トランスフェクションするための方法に係るものである。しかし、この特許出
願においては、特異的に創傷治癒を促進する遺伝子を用いた局所適用または遺伝
子トランスフェクションについて開示されてはいない。
ＷＯ ９２／１５６７６は、遺伝子トランスフェクションされた繊維芽細胞を体
細胞遺伝子治療に使用する用途を記載している。この場合、かかる遺伝子トラン
スフェクションされた繊維芽細胞は、細胞外コラーゲンマトリックスに固定され
て、皮膚下部に移植されるのである。この出願の目的は、ヒトゲノムの遺伝子欠
陥を治癒・修復することを意図するものである。この意味において、機能的に活
性な”置換”遺伝子を体細胞内に導入し、かかる欠陥遺伝子に由来する損傷を補
償するために使用されるのである。この文献は、創傷治癒またはＴＧＦ−α、Ｅ
ＧＦ又はｂ−ＦＧＦなどの創傷治癒を促進するサイトカインを対象とするもので
はない。この引例文献は、特に別の生物学的性質を有するサイトカイン、例えば
ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦまたはＥＰＯなどについて言及するものである。特許請求
の範囲５項において言及されている繊維芽細胞成長因子は、血管形成物質として
使用されている。
ケラチノサイトに対して効果を有する種々の成長因子もまた公知となっている。
ＷＯ ９０／０８７７１は、上皮細胞に影響を及ぼす成長因子タンパク質を遺伝
子組み換えによって調製することに係る。しかしながら、ヒトケラチノサイト成
長因子は、この特許出願においては実質的に純粋なタンパク質として使用するの
である。
ＵＳ特許明細書第５、３０２、７０１号は、細胞接着性でありかつまた細胞成長
促進活性を有する人工ポリペプチドの開発・調製を記載するものである。この場
合のポリペプチドは、フィブロネクチンと繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）との複
合物である。
ＵＳ特許第５、１９６、１９６号は、支持マトリックスを含んでなる創傷包帯に
係るものであるが、方法が機能する原理および有効成分の双方において本発明と
は重大な差異がある。このUS特許は、当該創傷包帯に精製したプロテアーゼネキ
シンＩ（ＰＮ−Ｉ）を使用するのであるが、このプロテアーゼは、成長因子では
なく一定の性質を有する酵素である。プロテアーゼネキシンＩは、セリンプロテ
アーゼ阻害剤である；即ち、培養中のヒト繊維芽細胞によって合成され、分泌さ
れるセリンプロテアーゼ阻害剤スーパーファミリに属する阻害剤である。このＵ
Ｓ特許は、当該タンパク質を精製された状態で使用するものであり、遺伝子導入
を行った繊維芽細胞によって発現される遺伝子として使用するものではない。更
には、培養したオートロガスケラチノサイトをフィブリン接着剤に懸濁させた状
態で広範な火傷創傷を治療するために使用することは、当該技術水準に照らして
公知である[Ｓｔａｒｋら、Ｊ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．(１９９５)１８、ｐｐ
．２６７−２７１]。ブタモデルにおける創傷治癒において粒子ＤＮＡ移入を用
いることによってインシツでトランスフェクトしたケラチノサイトを使用しよう
とする試みが、これまでに為されている[Ａｎｄｒｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９９４）９１、ｐｐ．１２１８８−１２１９
２]。
Ａｎｄｒｅａｔｔａ−ｖａｎ Ｌｅｙｅｎら（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａ
ｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ.、Ｖｏｌ．２７(１９９３)、ｐｐ．１２０１−１２０
８］は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）を産生する遺伝子トランスフェクションさ
れたケラチノサイトを含んでなる創傷包帯を記載している。現行技術水準に照ら
して公知である解決策のうちの幾つかは、ケラチノサイト製剤（例えば、所謂ケ
ラチノサイトシート）に部分的に依拠するものであるが、この製剤は、取扱いが
困難であり、然も三次元構造物が細胞培養の過程で形成された場合にのみ使用で
きることが多い。同種異系の製剤、特に異なるドナーに由来しかつ特性化されて
いない製剤は、種々のウイルス（ＨＩＶ、ＨＣＶや凝れまでに特性化されていな
いウイルス）で汚染しており、従って治療を受ける患者がこのようなウイルスに
感染し得る、という危険性がある。
本発明は従って、創傷治癒促進作用のサイトカインをコードする外来・異種遺伝
子を少なくとも一種を有する繊維芽細胞および付加的な創傷治癒成分を少なくと
も一種とを含んでなる、創傷を治療するための組成物に係る。このことに加えて
、本発明に従った組成物は更に、かかる組成物に従来から使用されている別の成
分を含んでなっていてもよい。
かかる付加的な創傷治癒促進成分は、所謂フィフリン接着癒着剤であってもよい
。かかるフィブリン接着癒着剤は、市販されており、医学の種々の分野、特に外
科分野において使用されている。
原則として、フィブリン接着癒着は、血液凝固の最終相・段階を利用するもので
ある。フィブリン接着癒着剤は、フィブリノーゲンを含有しているのであるが、
これが、トロンビンによってモノマー性フィブリンに転換される。この現象によ
って次に、ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄまたはｓｉｄｅ−ｔｏ−ｓｉｄｅ付加によるフ
ィブリン凝集物が形成される。
さらには、好ましい一つの実施態様においては、かかるフィブリン接着癒着剤は
、フィブロネクチンを含有している。同時に、トロンビンは、通常フィブリン接
着癒着剤に充分な量を配合させている第ＶＩＩＩ因子を活性化するのである。ま
た別の成分として、かかるフィブリン癒着接着剤は、別の成分として塩化カルシ
ウムと共に添加されている場合が多いトロンビン溶液を含有している。
上記以外に、かかるフィブリン接着癒着剤はまた、充分な量のアルブミンまたは
プラスミノーゲンを含有していてもよい。
好ましい一つの実施態様においては、付加的な創傷治癒促進成分は、支持マトリ
ックスとして機能する固体の構成成分であってもよい。このような性質を有する
”
好ましくはヒアルロン酸エステルからなるマトリックスである。ヒアルロン酸は
、結合組織の内因性成分の一つで、代謝回転速度が以上に高いものである。従っ
て、かかるマトリックスがヒアルロン酸から構成されている場合、内因性のヒア
ルロニダーゼによって創傷内部において極めて迅速に分解される。このような理
由によって、本発明に従えば、生体内で分解速度がいくぶんでも遅いヒアルロン
酸の誘導体を使用するのが好ましい。
支持マトリックスを使用することによって得られる特別の利点は、細胞の癒合性
会合を形成していない細胞を創傷に適用・塗布することができる、ということで
ある。ケラチノサイトを本発明に従った組成物に使用した場合でも、かかるケラ
チノサイト細胞を支持マトリックスを用いることによって半癒合性状態で使用す
ることができるのである。この場合、ケラチノサイト細胞は最適増殖期にあり、
なお頻繁に分裂しており、遺伝子トランスフェクションした繊維芽細胞が産生す
るサイトカイン類に特に良好に反応する。
好ましい一つの実施態様においては、本発明に従った組成物はまた、ケラチノサ
イト、好ましくはオートロガスケラチノサイトを含んでなっていてもよい。かか
るケラチノサイトは、特に皮膚の外層、即ち所謂表皮を形成するのに関与するの
である。ケラチノサイト培養物は、それ自体で公知である[例えば、Ｒｈｅｉｎ
ｗａｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ ２６５（１９７７）ｐｐ．４２１−４２４]、ルー
チンな手法を用いて培養することができる。この手法において、皮膚の細片を通
常はバイオプシーによって摘出し、次いで表皮と真皮とを相互に分離するのであ
る。細胞懸濁液を表皮から調製するが、好ましくは表皮をタンパク質分解酵素で
処理することによって調製される。得られた個別の細胞を、無菌状態で培養容器
（フラスコまたは皿）の内部で拡げ、適当な時点でかかる培養容器から引きはが
す。
本発明に従った組成物は、遺伝子的に変化させた繊維芽細胞を含んでなる。繊維
芽細胞は、巨大な細胞体と若干扁平化した核とを有する間葉由来の細胞である。
このような繊維芽細胞は、特に結合組織の細胞内物質の形成に関与している。本
発明に従えば、何れのオートロガス繊維芽細胞でも使用できるが、それいがでも
好ましいは一つの実施態様においては、治療を受ける患者以外の別の個人から得
られる同種異系の繊維芽細胞を使用することができる。特に好ましくは、クロー
ン的に選択した繊維芽細胞、即ち一つのクローンから由来する繊維芽細胞を利用
する。
特に好ましい実施態様においては、遺伝子トランスフェクションした繊維芽細胞
を一定線量の電離性放射腺で処理して、一定期間後は分裂増殖しかつ死滅する能
力を失うようにするのである。かかる照射の利点は、遺伝子トランスフェクショ
ンされた細胞が比較的短く而も明確な期間（＜３週間）経過後に生体内で死滅す
ることである。照射処理した細胞を使用するもう一つの利点は、このような処理
を受けた細胞は、依然として当該サイトカインを充分に発現することを継続する
、ということである。
特に好ましい一つの実施態様においては、本発明に従えば不死化処理した繊維芽
細胞株を使用するのであるが、かかる細胞と組合せると、ＫＳＭＴ−６と命名さ
れた細胞株が、特に充分に満足するべきものであることが判明している。不死化
処理した繊維芽細胞細胞株は、連続して培養することができまた生物学的観点か
らして正確に特性化された態様で使用することができるので有利である。しかし
ながら、その他の不死化処理した繊維芽細胞細胞株を何等の困難を伴うことなく
使用することも可能である。
適当なサイトカインをコードする外来・異種遺伝子は、本発明に従って使用され
る繊維芽細胞内に導入される。この外来・異種遺伝子は、好ましくは例えばＥＧ
Ｆ、ＴＧＦ−αやＫＧＦなどのサイトカインをコードする遺伝子である。
表皮成長因子は、短縮してＥＧＦと称されるが、この因子は、５３個のアミノ酸
を有するほぼ６．２ＫＤａの球状タンパク質である。本発明に従えば、完全遺伝
子を遺伝子トランスフェクションした繊維芽細胞内に導入することは、絶対的
に必要なことではない；即ち、挿入するべき生物学的活性を有するものであれば
充分である。生物学的に活性なペプチドを分泌させるには、適当なｃＤＮＡの半
分をヒトＧ−ＣＳＦの分泌信号配列にインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合
させることが好ましい。本発明に従えば、例えばＥＧＦと高い相同性を示すトラ
ンスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）などのＥＧＦ様タンパク質を使用す
るのが好ましい。ＥＧＦやＴＧＦ−αの生物活性は同等であり何れのサイトカイ
ンも、表皮成長と細胞分化に影響を及ぼす。
ＮＧＦ（神経成長因子）もまた、好ましい態様で使用できる。このサイトカイン
は、特に末梢神経系における感覚神経と交感神経の生存、分化および機能活性に
関与している。創傷治癒の促進効果は、恐らくは顆粒球、マスト細胞、マクロフ
ァージやリンパ球などの種々の免疫単筒細胞の生存と機能活性を増大させる能力
をＮＧＦが有している事に因るのであろう。
好ましく使用される別のサイトカインは、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）で
あって、このものは、特に分裂能力を有するケラチノサイトの分裂を刺激するの
である。本発明に従えば、この遺伝子の変異体も使用することができる。このよ
うな変異体は、欠失または付加を幾つか有するものであってよく、当該配列を制
御された態様で変化させればよい。また、天然のサイトカインよりも生物学的活
性が高いサイトカイン変異体、例えば特に二種以上のサイトカインを融合させて
得られる構築物な度を使用することも可能である。
本発明に従って使用される繊維芽細胞は、創傷治癒を促進するサイトカインをコ
ードする外来・異種遺伝子を有する。この外来・異種遺伝子は好ましくはヒトか
ら誘導されればよいのであるが、またマウスやウシなどの動物から誘導させても
よい。しかしながら、必須の条件の一つは、当該サイトカインは、外来・異種遺
伝子が別種由来である場合は種特異性を示さない、ということである。
かかる外来・異種遺伝子は、繊維芽細胞内に導入させる必要があるのであるが、
このことは、所望の遺伝子を適当なベクターに導入し、次いで当該繊維芽細胞に
トランスフェクションさせることによって行うことができる。適当なベクターと
しては、ウイルス性ベクターまたはプラスミドベクターがあるが、特に好ましい
のは、プラスミドベクターである、その理油は、ウイルス性ベクターを使用した
場合、複製能を有するウイルス混入の可能性を排除するために幾つか追加の検討
を行わねばならないからである。
本発明に従った組成物は、現行技術水準に照らして公知である解決策と比較して
種々の利点を有する。
遺伝子的に変更した繊維芽細胞は、好ましい一つの実施態様においては致死的に
照射処理されており、所定の時間に所望するサイトカインを発現し、而もかかる
サイトカインを組織内に分泌するのである。このサイトカインは、連続的に産生
させられるので、局所的に外用した場合でもサイトカインの半減期が短いために
起因するいくつかの問題を回避することが可能となる。本発明に従った組成物に
おいて、異なる細胞種（ケラチノサイト／繊維芽細胞）を相互に融合させてもよ
く、また遺伝子トランスフェクションさせた繊維芽細胞が異なるいくつかのサイ
トカインを含有するようにすることも可能である。こうすることによって、異な
るいくつかの成長因子を慎重な態様で創傷領域内に導入することも可能となる。
オートロガスケラチノサイトを使用した場合、組織適合性拒絶反応を回避するこ
とも可能である。
また、創傷領域における内因性免疫防衛をを刺激する目的のために、白血球に作
用を及ぼす成長因子、例えばＧ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦなどの遺伝子をさらに追
加して導入することも考えられる。このことによって、特に火傷の場合に該当す
ることであるが、身体自体の感染に対する防衛・防御が高められる。
また、本発明に従った組成物をケラチノサイトを一切用いることなく使用するこ
とも可能である。この場合、遺伝子的に変更させた繊維芽細胞は、当該サイトカ
インを環境に分泌・放出し、創傷の縁端部領域に位置する治療を受ける患者のケ
ラチノサイが刺激されるのである。
本発明に従った組成物は、薬学的に許容可能な製剤処方の形状とすることが好ま
しい。これらの製剤処方は、フィブリン癒着接着剤または遺伝子トランスフェク
ションされた繊維芽細胞の懸濁液であって、液剤、懸濁液剤若しくは軟膏剤また
はゲルとして創傷に適用と不可能なものあり得る。当該組成物が、支持マトリッ
クスである固体の一成分を含んでなる場合は、これらの成分は、適当な態様で保
存可能な無菌ユニットとして含まれているのが好ましい。かかる製剤は、例えば
急速冷凍処理した、無菌包帯の形状であってもよい。図の説明
図１は、ヒトＥＧＦを発現させるためのプラスミドの構造を示す。Ｐａｒｔ（Ａ
）は、キメラＥＧＦ遺伝子を包含するプラスミド構築物を示す。Ｐａｒｔ（Ｂ）
は、ヒトＧ−ＣＳＦ信号配列（下線部）と成熟したヒトＥＧＦをコードする領域
（Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ ...）との間でのインフレーム融合物の配列を示す
。
図２は、プラスミドでトランスフェクションされた繊維芽細胞ｐＣＭＶ−ＥＧＦ
−ＩＲＥＳ−ＴＫＮｅｏによるＥＧＦの分泌を示す。この繊維芽細胞は、照射処
理された（１００Ｇｙ）ＫＭＳＴ−６細胞株の繊維芽細胞である。実験において
は、２ｘ１０5の照射処理細胞を６−ウエルの培養プレートに播種し、２４時間
後の培養上済み液中のＥＧＦの濃度を測定した。示した数値は、平均値である。
図３は、遺伝子トランスフェクションされたＫＭＳＴ−６繊維芽細胞のクローン
＃３と＃６から得たキメラＥＧＦポリペプチドの生理活性を示す。
Ｐａｒｔ（Ａ）は、ＢＡＬＢ／ＭＫ系統マウスケラチノサイトに及ぼす生理活性
を示す。
Ｐａｒｔ（Ｂ）は、ヒト一次ケラチノサイトを用いて得られた結果を示す。数値
は、八回の測定値から得られた平均値と標準偏差を示す。破線棒グラフは、遺伝
子組み換え型ＥＧＦを用いて得られた補正曲線を表し、またシロ棒グラフは、Ｋ
ＭＳＴ−６細胞株の繊維芽細胞を用いて得られた対照数値を表す。斜線および灰
色棒グラフは、二つのクローン＃３および＃６からそれぞれ得られた培養上済み
液を用いて得た結果を表す。
図４は、遺伝子トランスフェクションされたＫＭＳＴ−６細胞株の細胞を照射処
理したものを用いた培養試験におけるヒト一次ケラチノサイトの増殖を示す。
Ｐａｒｔ（Ａ）は、４日間の共培養後の結果を示す。
Ｐａｒｔ（Ｂ）は、１０日間の共培養後の結果を示す。
本発明を下記する実施例によってさらに詳細に説明する。実施例１
ＥＧＦの遺伝子を含有するプラスミドの構築とトランスフェクション
大抵のヒト細胞においては、ＥＧＦは、１３０ｋＤａの膜貫通グリコプロテイン
前駆体分子として合成されるのであるが、この前駆体分子は、タンパク質分解的
に開裂されて５３個のアミノ酸を含む、生物学的に活性な６．２ｋＤａのＥＧＦ
ペプチドとなるのである。従って本発明に従って、成熟ＥＧＦペプチドとヒトＧ
−ＣＳＦ分泌性シグナル配列とのインフレーム融合物をコードするキメラ構築物
を調製した。この構造物は、図１（Ａ）にその概略を図示している。このトラン
スジーンの発現をネオマイシンホスホトランスフェラーゼセレクションマーカー
の発現に結合させるために、得られたＤＮＡ融合断片をヒトＣＭＶ（サイトメガ
ロウイルス）プロモータの転写制御下におき、ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃベクター
に導入した。
クローニングにおいては、成熟ヒトＥＧＦペプチドをコードする配列をＰＣＲ技
法で増幅し、得られた産生物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）ベクターにサブクローニングし、次いで配列決定を行った。ヒトＧ−ＣＳＦシ
グナル配列も同様にＰＣＲ技法を用いてヒトＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡから増幅し、
５’末端における改良されたＫｏｚａｋ共通配列と単−ＮｈｅＩ制限切断部位を
同時に創製した。該当配列を図１（Ｂ）に示す。
このようにして生成せしめたプラスミドをＫＭＳＴ−６細胞株のヒト繊維芽細胞
にトランスフェクションさせ、ネオマイシン耐性クローンは全て、ヒトＥＧＦを
分泌したが、このことはＥＬＩＳＡ試験によって証明された。比較対照試験の結
果、ＫＭＳＴ−６細胞株のトランスフェクションしなかったヒト繊維芽細胞は、
放射線照射処理の前後とも検出可能な量のｈＥＧＦを分泌しないことが判明した
。クローン＃３および＃６は、それぞれ１０6・２４時間当り３７および８ｎｇ
を分泌したので、それ以降種々の検討に供した。
トランスフェクションした繊維芽細胞によってヒトＥＧＦが上済み液中に分泌さ
れることは、ＥＬＩＳＡ技法（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を用いて決定した。放射線照射処理したまたは照射処理しなかった出発細
胞、即ちＥＧＦの遺伝子トランスフェクションした細胞から得られた上済み液を
２４時間後に除去し、生存細胞数を測定した後でＥＧＦ産生の有無につき検査し
た。
放射線照射処理は、137Ｃｓ照源を線量３Ｇｙ／分として用いて室温で行った。実施例２
遺伝子トランスフェクションした繊維芽細胞によるキメラＥＧＦタンパク質発現
に及ぼす致死放射線照射の影響
創傷治癒結果を実現達成するために、治療開始の最初の数日間においてＥＧＦが
利用可能となることが必要である。一方、遺伝子的に修飾された細胞がインビボ
で制御されない状態で増殖することは、致死放射線照射で防止することができる
。従って、ＥＧＦ発現に及ぼす致死放射線照射の影響をＫＭＳＴ−６繊維芽細胞
(プラスミドｐＣＭＶ−ＥＧＦ−ＩＲＥＳ−ＴＫＮｅｏでトランスフェクション
したクローン＃３)を用いて検討した。ＥＧＦ分泌は１００Ｇｙで放射線照射し
た後徐々に現象したが、ＥＧＦは少なくとも７日間に亙ってインビトロで上済み
液中において検出可能であること力拌リ明した。結果を図２にまとめて示す。実施例３
キメラＥＧＦポリペプチドの生物学的活性
トランスフェクションした繊維芽細胞によって分泌されるＥＧＦタンパク質生物
活性を示すことを証明するために、ＥＧＦ−遺伝子トランスフェクションしたク
ローンから得た培地の上済み液をマウスケラチノサイトの永久細胞株およびヒト
一次ケラチノサイトでのマイトジェン活性の有無について検査した。種々の濃度
の組み換え型ヒトＥＧＦを比較対照として使用した。二種類の細胞を組み換え型
タンパク質およびクローン＃３と＃６の培養上済み液の双方で用量依存的に刺激
した。マウスケラチノサイトの最適刺激は、組み換え型ｈＥＧＦの濃度が２およ
び２０ｎｇ／ｍｌの時に認められた。このことは、培養上済み液の１：５希釈液
で実現可能な刺激に相当するものである。得られた結果を図３（Ａ）に示す。
ヒト一次ケラチノサイトを使用した場合、有効な投与量は、僅かにより低くなり
、最適増殖は、ｅＥＧＦ／ｍｌが０．２の時またｐＣＭＶ−ＥＧＦ−ＩＲＥＳ−
Ｔ
ＫＮｅｏ／ＫＭＳＴ６＃３クローンの培養上済み液の１：５０希釈液においてす
でに認められていた。双方の試験において、細胞増殖が高濃度になるほど阻害さ
れる傾向がある事が認められた。ＫＭＳＴ−６細胞株のうちトランスフェクショ
ンされていない繊維芽細胞の培養上済み液は、成長因子を一切添加しない細胞培
養上済み液と比較した場合増殖刺激作用を一切示さなかった。創傷治癒における
治療効果をさらに詳細に検討するために、致死的に放射線照射処理したＥＧＦ−
遺伝子トランスフェクションした繊維芽細胞をヒト一次ケラチノサイトとともに
インビトロで共培養した。これらの実験において、異なる濃度の放射線照射処理
ＥＧＦ−分泌繊維芽細胞と一緒に４日間培養した場合、ケラチノサイト増殖の用
量依存性刺激を実現することが可能であり、しかもかかる刺激が組み換え型成長
因子によって誘発された刺激と類似していることが明らかとなった。このことは
、図４にしめしてあるが、図４（Ａ）には、４日間の共培養の場合の数値が示し
てあり、また図４（Ｂ）には、１０日間の共培養の場合得られた数値を示してあ
る。実施例４
インビトロでリポソームトランスフェクションされたＫＭＳＴ−６細胞によって
ＥＧＦがインビボで産生されることの証明実験構成
大きさが１．５ｘ１．５ｃｍである全層皮膚創傷を４２匹のヌードマウスの背中
に創出させた。９．４ｘ１０6個のｈＥＧＦトランスフェクションさせかつ致死
的に放射線照射処理したＫＭＳＴ−６細胞を２．８ｍｌのフィブリン癒着接着剤
中に懸濁させ、１４匹のヌードマウスの全層皮膚創傷上に移植した(３００、０
００細胞／ｃｍ2、グループＩ)。
１４個の全層皮膚創傷に、トランスフェクションしていないＫＭＳＴ−６細胞を
移植し(３００、０００細胞／ｃｍ2、グループＩＩ)、また１４個の未処置の全
層皮膚創傷（グループＩＩＩ）を対照として用いた。
１、２、３、４、５、７および１４日目に、各グループから二匹の動物を剖検に
供し、０．８ｇの創傷組織をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳ緩衝液を用いて均質化処
理した。得られたホモジネートを遠心分離し、上済み液中のＥＧＦの濃度を抗ヒ
トＥＧＦＥＬＩＳＡを使用して評価測定した。結果
１日目に、グループＩにおいては４７０ｎｇ／ｍｌがインビボで検出された（本
発明に従った）が、これに対してグループＩＩにおいては１８ｎｇ／ｍｌまたグ
ループＩＩＩにおいては１．３ｎｇ／ｍｌが検出された。グループＩｎｉｏｉｔ
ｅＥＧＦの濃度は２−７日目には減少したが、それでも対照群における場合より
も有意に高かった。１４日目において三つのグループの何れにおいてもＥＧＦを
検出することは、不可能であった。
要約すれば、これら三つの結果から、フィブリン癒着接着剤懸濁液においてイン
ビトロでＥＧＦをトランスフェクションした繊維芽細胞を成功裡に移植すること
が可能であることが明らかとなった。少なくとも７日目までにインビボで形質転
換タンパク質を検出することが可能であった。
この実験において得られた結果を下記する表Ｉにまとめて示す。表Ｉには、キメラｈＥＧＦ遺伝子でトランスフェクションし、放射線照射した繊
維芽細胞が創傷内に放出したｐｇ／ｍｌ単位でのインビボｈＥＧＦ放出量を示す
。実施例５
インビトロでＥＧＦでトランスフェクションしたＫＭＳＴ−６細胞をヒトケラチ
ノサイトと組合せて移植（混合細胞移植）した場合の創傷治癒促進効果実験構成
大きさが１．５ｘ１．５ｃｍである全層皮膚創傷を７２匹のヌードマウスの背中
に創出せしめた。ＥＧＦトランスフェクションさせかつ致死的に放射線照射した
ＫＭＳＴ−６細胞の１．０１２５ｘ１０6個を、２．０２５ｘ１０6個のヒトケラ
チノサイトと組合せて３．６ｍｌのフィブリン癒着接着剤中に懸濁させ、１８匹
のヌードマウスの全層皮膚創傷に移植した(比率１：２、７５、０００細胞／ｃ
ｍ2、グループＩ)。
創傷にＥＧＦトランスフェクションしたＫＭＳＴ−６細胞を移植した１８個の全
層皮膚創傷(２５、０００細胞／ｃｍ、グループＩＩ)，創傷にヒトケラチノサイ
トを移植した18個の全層皮膚創傷（５０、０００細胞／ｃｍ2、グループＩＩＩ
）および未トランスフェクションＫＭＳＴ−６細胞をヒトケラチノサイトと組合
せて移植し、比較対照として用いた１８個の皮膚創傷(比率１：２、７５、００
０細胞／ｃｍ2、グループＩＶ)。表ＩＩに、グループ分けを示す。
１、２、３、４、５、７および１２日目に、各グループから一匹の動物を剖検に
供し、０．８ｇの創傷組織をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳ緩衝液を用いて均質化処
理した。得られたホモジネートを遠心分離し、上済み液中のＥＧＦの濃度を抗ヒ
トＥＧＦ ＥＬＩＳＡを使用して評価測定した。５日目から、生検の残りの半分
を組織学的検査に供した。
手術後７、１０、１２、１４、１７および２１日目に、各グループから選別した
さらに二匹の動物の試験物を組織学的に検査した。結果
ＥＧＦは、グループＩおよびＩＩにおいて検出可能であったがグループＩＩＩお
よびＩＶにおいては検出可能ではなかった。
創傷の閉止に関する限り、グループＩにおける結果は、上皮化が７ないし１４日
目には殆ど完璧でかつ顕著でありまた１４日目以降は上皮化が完璧であることを
示している。グループＩ創傷もまた、表皮の再構築（表皮における細胞配置）に
関して最良の結果を示した。これに対して。対照群は、１４日目までは顕著な上
皮化を示さず、２１日目には高度の上皮化を全く示さなかった。かかる上皮化は
、表ＩＩＩに一覧表として示してある。 実施例６
インビトロでＥＧＦでトランスフェクションしたＫＭＳＴ−６細胞を移植した場
合の大型動物モデルにおける創傷治癒促進効果実験構成
大型動物実験において、３頭のヌタ（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）について各対象毎
に２１個の標準化熱傷創傷（大きさが１５ｃｍ２、２ａ度）を用いて実験を行っ
た。一頭のブタにおいて(Ｐ１)、７個の標準化熱傷創傷にフィブリン癒着接着剤
中のＥＧＦトランスフエクションしたＫＭＳＴ−６細胞を移植した(治療グルー
プ)。この場合、７個の未処置の標準化熱傷創傷（対照グループＩ）およびフィ
ブリン癒着接着剤で処置した７個の標準化熱傷創傷（対照グループＩＩＩ）を比
較対照として用いた。別の二頭のブタにおいて(Ｐ２およびＰ３)、７個の標準化
熱傷創傷に対して同様に各対象毎にフィブリン癒着接着剤中においてＥＧＦトラ
ンスフェクションＫＭＳＴ−６細胞を移植した(治療グループ)。各対象毎に、７
個の未処置標準化熱傷創傷（対照グループＩ）および未トランスフェクションＫ
ＭＳＴ−６細胞を移植した７個の標準化熱傷創傷（対照グループＩＩ）を比較対
照として用いた。表ＩＶにグループ分けを示す。
１、３、５、７、１０、２１および３５日目に、各グループから一つの創傷を剖
検に供し、１０日目までの生検から得た０．８ｇの創傷組織をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ
／ＰＢＳ緩衝液を用いて均質化処理した。得られたホモジネートを遠心分離し、
上済み液中のＥＧＦの濃度を抗ヒトＥＧＦＥＬＩＳＡを使用して評価測定した。
さらに、生検物を組織学的に評価した。結果
表Ｖに、各対象例において一つの創傷におけるＥＧＦ濃度を各グループに分けて
示す。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Wound healing composition comprising a fibroblast having a foreign / heterologous gene The present invention relates to compositions for treating skin damage that is difficult to treat. For large surface area burns, restoring the skin area destroyed by the injury is a significant problem, especially if the majority of the skin area has been damaged. Also, in the case of other diseases such as neoplastic diseases and chronic skin lesions, restoring the damaged skin area is often a serious problem. Gene-transfected fibroblasts themselves are already known in light of the state of the art. International Patent Application WO 95/07105 discloses that the immune response is stimulated by immunization with either gene-transfected or unmodified tumor cells and gene-transfected autologous fibroblasts. Certain methods are described for inhibiting or preventing the growth of tumor cells in the central nervous system of a patient. The cytokines used are those that first stimulate the immune system. DE-OS 44 06 073, also filed under the name of the applicant of the University of Albert Ludwig Hospital Complex-Freiburg, is a general method for preparing human clonogenic fibroblasts and fibroblasts. The present invention relates to a method for gene transfection of a cell. However, this patent application does not disclose topical application or gene transfection using genes that specifically promote wound healing. WO 92/15676 describes the use of gene-transfected fibroblasts for somatic cell gene therapy. In this case, such gene-transfected fibroblasts are fixed to the extracellular collagen matrix and transplanted under the skin. The purpose of this application is to cure and repair genetic defects in the human genome. In this sense, a functionally active "replacement" gene is introduced into somatic cells and used to compensate for damage from such defective genes. This document is not directed to cytokines that promote wound healing or wound healing, such as TGF-α, EGF or b-FGF. This reference specifically refers to cytokines having other biological properties, such as GM-CSF, TNF or EPO. The fibroblast growth factor mentioned in claim 5 has been used as an angiogenic substance. Various growth factors that have an effect on keratinocytes are also known. WO 90/08771 relates to recombinantly preparing growth factor proteins that affect epithelial cells. However, human keratinocyte growth factor is used in this patent application as a substantially pure protein. US Pat. No. 5,302,701 describes the development and preparation of artificial polypeptides that are cell-adhesive and also have cell growth promoting activity. The polypeptide in this case is a complex of fibronectin and fibroblast growth factor (FGF). US Pat. No. 5,196,196 relates to a wound dressing comprising a support matrix, but there are significant differences from the present invention both in the principle on which the method works and in the active ingredients. This patent uses the purified protease Nexin I (PN-I) for the wound dressing, which is not a growth factor but an enzyme with certain properties. Protease nexin I is a serine protease inhibitor; that is, an inhibitor belonging to the serine protease inhibitor superfamily that is synthesized and secreted by human fibroblasts in culture. This US patent uses the protein in a purified state, and does not use the protein as a gene expressed by transfected fibroblasts. Furthermore, the use of cultured autologous keratinocytes suspended in fibrin glue to treat a wide range of burn wounds is known in light of the state of the art [Stark et al. Plast. Surg. (1995) 18, pp. 267-271]. Attempts have been made to use keratinocytes transfected in situ by using particle DNA transfer in wound healing in a pig model [Andree et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1994) 91 pp. 12188-12192]. Andretta-van Leyen et al. (J. Biomedical Materials Res., Vol. 27 (1993), pp. 1201-1208] describe a wound comprising gene-transfected keratinocytes producing bovine growth hormone (bGH). Although some of the solutions known in the light of the state of the art rely in part on keratinocyte preparations (eg so-called keratinocyte sheets), the preparations Allogeneic preparations, especially those derived from different donors and not characterized, can often be used only when the three-dimensional structures are formed during the course of cell culture. Virus (a virus not characterized by HIV, HCV, or clotting) Thus, there is a risk that the treated patient may be infected with such a virus.The present invention therefore provides fibroblasts having at least one foreign / heterologous gene encoding a cytokine that promotes wound healing. A composition for treating a wound, comprising at least one additional wound healing component, In addition to this, the composition according to the invention may further comprise a composition conventionally used in such a composition. Such an additional wound healing promoting component may be a so-called fibrin adhesive, which is commercially available and may be used in various medical applications. In general, fibrin adhesion utilizes the final phase of blood coagulation. Fibrin adhesion is used in principle. The adhesive contains fibrinogen, which is converted to monomeric fibrin by thrombin, which in turn causes the formation of fibrin aggregates by end-to-end or side-to-side addition. Furthermore, in one preferred embodiment, such a fibrin adhesion agent comprises fibronectin, while thrombin is normally present in a sufficient amount of the factor VIII in the fibrin adhesion agent. As another component, such a fibrin adhesion adhesive contains a thrombin solution that is often added together with calcium chloride as another component. The agent also provides a sufficient amount of albumin or plasminogen. It may have. In one preferred embodiment, the additional wound healing promoting component may be a solid component that functions as a support matrix. Has such properties " Preferably, the matrix is composed of a hyaluronic acid ester. Hyaluronic acid is one of the endogenous components of connective tissue and has a higher turnover rate. Thus, if such a matrix is composed of hyaluronic acid, it will be degraded very quickly inside the wound by endogenous hyaluronidase. For this reason, according to the present invention, it is preferred to use a derivative of hyaluronic acid whose degradation rate is somewhat slow in vivo. A particular advantage obtained by using a support matrix is that cells that have not formed a cohesive association of cells can be applied and applied to the wound. Even when keratinocytes are used in the composition according to the present invention, such keratinocyte cells can be used in a semi-union state by using a support matrix. In this case, the keratinocyte cells are in an optimal growth phase, are still dividing frequently, and respond particularly well to cytokines produced by gene-transfected fibroblasts. In one preferred embodiment, the composition according to the invention may also comprise keratinocytes, preferably autologous keratinocytes. Such keratinocytes are particularly involved in forming the outer layer of the skin, the so-called epidermis. Keratinocyte cultures are known per se [see, for example, Rhein wald et al., Nature 265 (1977) pp. 421-424], and can be cultured using routine techniques. In this technique, a strip of skin is removed, usually by biopsy, and then the epidermis and dermis are separated from each other. The cell suspension is prepared from the epidermis, but is preferably prepared by treating the epidermis with a proteolytic enzyme. The individual cells obtained are aseptically spread inside a culture vessel (flask or dish) and detached from the culture vessel at the appropriate time. The composition according to the invention comprises genetically altered fibroblasts. Fibroblasts are mesenchymal-derived cells that have a large cell body and a slightly flattened nucleus. Such fibroblasts are particularly involved in the formation of connective tissue intracellular material. According to the present invention, any autologous fibroblast can be used, but it is preferred that in one embodiment allogeneic fibroblasts obtained from another individual other than the patient to be treated are used. Can be used. Particularly preferably, clonally selected fibroblasts, ie, fibroblasts derived from one clone, are used. In a particularly preferred embodiment, the transfected fibroblasts are treated with a dose of ionizing glands so that after a period of time they lose their ability to proliferate and die. The advantage of such irradiation is that the gene transfected cells die in vivo after a relatively short and well defined period (<3 weeks). Another advantage of using irradiated cells is that cells that have undergone such treatment will still continue to fully express the cytokine. In one particularly preferred embodiment, according to the invention, an immortalized fibroblast cell line is used, but in combination with such cells the cell line designated KSMT-6 is particularly well It has proven to be satisfactory. The immortalized fibroblast cell line is advantageous because it can be cultured continuously and used in a precisely characterized manner from a biological point of view. However, it is also possible to use other immortalized fibroblast cell lines without any difficulty. A foreign / heterologous gene encoding a suitable cytokine is introduced into the fibroblasts used according to the present invention. The foreign / heterologous gene is preferably a gene encoding a cytokine such as EGF, TGF-α or KGF. Epidermal growth factor, shortened to EGF, is a roughly 6.2 KDa globular protein with 53 amino acids. According to the invention, it is not absolutely necessary to introduce the complete gene into the gene-transfected fibroblasts; that is, it is sufficient to have the biological activity to be inserted. . To secrete a biologically active peptide, it is preferable to fuse half of the appropriate cDNA to the secretory signal sequence of human G-CSF in-frame. According to the invention, it is preferred to use EGF-like proteins, such as transforming growth factor α (TGF-α), which exhibit high homology to EGF. The biological activities of EGF and TGF-α are comparable, and both cytokines affect epidermal growth and cell differentiation. NGF (Nerve Growth Factor) can also be used in a preferred embodiment. This cytokine is involved in sensory and sympathetic nerve survival, differentiation and functional activity, especially in the peripheral nervous system. The effect of promoting wound healing is probably due to the ability of NGF to increase the survival and functional activity of various immune monocytic cells such as granulocytes, mast cells, macrophages and lymphocytes. Another cytokine that is preferably used is keratinocyte growth factor (KGF), which stimulates the division of keratinocytes, which are particularly capable of dividing. According to the invention, variants of this gene can also be used. Such variants may have several deletions or additions, as long as the sequence is altered in a controlled manner. It is also possible to use cytokine variants with more biological activity than natural cytokines, for example constructs obtained by fusing two or more cytokines. The fibroblasts used according to the present invention have a foreign, heterologous gene encoding a cytokine that promotes wound healing. The foreign / heterologous gene may preferably be derived from humans, but may also be derived from animals such as mice and cows. However, one of the essential conditions is that the cytokine does not show species specificity when the foreign / heterologous gene is from another species. Such foreign / heterologous genes need to be introduced into fibroblasts. This can be done by introducing a desired gene into an appropriate vector and then transfecting the fibroblasts. it can. Suitable vectors include viral vectors or plasmid vectors, and particularly preferred are plasmid vectors, which eliminate the possibility of contamination by replication-competent viruses when viral vectors are used. Because some additional considerations must be made. The compositions according to the invention have various advantages compared to solutions known in the light of the state of the art. Genetically modified fibroblasts, in one preferred embodiment, have been lethally irradiated to express the desired cytokine at a given time and secrete such cytokines into tissues. Since this cytokine is produced continuously, it is possible to avoid some problems caused by the short half-life of the cytokine even when topically applied topically. In the composition according to the invention, different cell types (keratinocytes / fibroblasts) may be fused to one another and the gene-transfected fibroblasts contain several different cytokines. Is also possible. This also makes it possible to introduce several different growth factors in a conservative manner into the wound area. If autologous keratinocytes are used, it is also possible to avoid histocompatibility rejection. For the purpose of stimulating the endogenous immune defense in the wound area, it is conceivable to further introduce a growth factor that acts on leukocytes, for example, a gene such as G-CSF or GM-CSF. This enhances the defense and defense against infection of the body itself, especially in the case of burns. It is also possible to use the composition according to the invention without using any keratinocytes. In this case, the genetically modified fibroblasts secrete and release the cytokine into the environment, stimulating the keratinous rhinoceros of the treated patient located in the marginal region of the wound. The compositions according to the invention are preferably in the form of a pharmaceutically acceptable formulation. These pharmaceutical formulations may be a suspension of fibrin adhesion adhesive or gene transfected fibroblasts, which may not be applicable to the wound as a solution, suspension or ointment or gel. Where the composition comprises one component of a solid that is a support matrix, these components are preferably included as sterile units that can be stored in any suitable manner. Such formulations may, for example, be in the form of a sterile bandage that has been flash frozen. Figure description FIG. 1 shows the structure of a plasmid for expressing human EGF. Part (A) indicates a plasmid construct containing the chimeric EGF gene. Part (B) shows the sequence of the in-frame fusion between the human G-CSF signal sequence (underlined) and the region encoding mature human EGF (Asn Ser Asp ...). FIG. 2 shows the secretion of EGF by the fibroblasts pCMV-EGF-IRES-TKNeo transfected with the plasmid. These fibroblasts are irradiated (100 Gy) KMST-6 cell line fibroblasts. In the experiment, 2x10 Five Irradiated cells were seeded on a 6-well culture plate, and the concentration of EGF in the culture solution after 24 hours was measured. The numerical values shown are average values. FIG. 3 shows the bioactivity of chimeric EGF polypeptides obtained from clones # 3 and # 6 of gene-transfected KMST-6 fibroblasts. Part (A) shows the biological activity on BALB / MK strain mouse keratinocytes. Part (B) shows the results obtained with primary human keratinocytes. The numerical values indicate the average value and standard deviation obtained from eight measurements. The dashed bar represents the correction curve obtained using the recombinant EGF, and the white bar represents the control value obtained using fibroblasts of the KMST-6 cell line. The hatched and gray bars represent the results obtained using the culture supernatants obtained from the two clones # 3 and # 6, respectively. FIG. 4 shows the proliferation of human primary keratinocytes in a culture test using irradiation-treated cells of the gene-transfected KMST-6 cell line. Part (A) shows the results after 4 days of co-culture. Part (B) shows the results after 10 days of co-culture. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. Example 1 Construction and Transfection of Plasmids Containing the EGF Gene In most human cells, EGF is synthesized as a 130 kDa transmembrane glycoprotein precursor molecule, which is proteolytically cleaved. This results in a biologically active 6.2 kDa EGF peptide containing 53 amino acids. Thus, according to the present invention, a chimeric construct encoding an in-frame fusion of a mature EGF peptide and a human G-CSF secretory signal sequence was prepared. This structure is schematically illustrated in FIG. In order to couple the expression of this transgene to the expression of the neomycin phosphotransferase selection marker, the obtained DNA fusion fragment was placed under transcriptional control of a human CMV (cytomegalovirus) promoter and introduced into a dicistronic vector. For cloning, the sequence encoding the mature human EGF peptide was amplified by PCR technique, and the resulting product was subcloned into a pBluescript (Stratagene) vector and then sequenced. The human G-CSF signal sequence was also amplified from human G-CSF cDNA using PCR techniques to simultaneously create an improved Kozak consensus sequence at the 5 'end and a single-NheI restriction cleavage site. The corresponding sequence is shown in FIG. Plasmids thus generated were transfected into human fibroblasts of the KMST-6 cell line, and all neomycin resistant clones secreted human EGF, as demonstrated by ELISA tests. As a result of the comparative control test, it was found that human fibroblasts not transfected with the KMST-6 cell line did not secrete detectable amounts of hEGF before and after the irradiation treatment. Clone # 3 and # 6 each had 10 6 Since 37 and 8 ng were secreted per 24 hours, they were subjected to various studies thereafter. Secretion of human EGF into the supernatant by transfected fibroblasts was determined using an ELISA technique (Quantikine, R & D Systems). Starting cells from irradiated or unirradiated cells, i.e., cells transfected with the EGF gene, were removed after 24 hours and the number of viable cells was measured before testing for EGF production. . The radiation treatment is 137 Performed at room temperature using a Cs illumination source at a dose of 3 Gy / min. Example 2 Effect of Lethal Irradiation on Chimeric EGF Protein Expression by Gene-Transfected Fibroblasts To achieve and achieve wound healing results, it is necessary that EGF be available in the first few days of treatment initiation. On the other hand, uncontrolled growth of genetically modified cells in vivo can be prevented by lethal irradiation. Therefore, the effect of lethal irradiation on EGF expression was examined using KMST-6 fibroblasts (clone # 3 transfected with plasmid pCMV-EGF-IRES-TKNeo). EGF secretion gradually developed after irradiation at 100 Gy, but EGF was detected to be detectable in the supernatant in vitro for at least 7 days. The results are summarized in FIG. Example 3 Biological activity of chimeric EGF polypeptide To demonstrate that it exhibits EGF protein bioactivity secreted by the transfected fibroblasts, the supernatant of the medium obtained from the EGF-gene transfected clone was used in mouse keratinocytes. Were tested for mitogenic activity in permanent cell lines and primary human keratinocytes. Various concentrations of recombinant human EGF were used as controls. Two types of cells were stimulated in a dose-dependent manner with both the recombinant protein and the culture supernatants of clones # 3 and # 6. Optimal stimulation of mouse keratinocytes was observed at recombinant hEGF concentrations of 2 and 20 ng / ml. This corresponds to a stimulus that can be achieved with a 1: 5 dilution of the cultured solution. The obtained result is shown in FIG. When using human primary keratinocytes, the effective dose is slightly lower and optimal growth is achieved when the eEGF / ml is 0.2 and the culture of the pCMV-EGF-IRES-TKNEo / KMST6 # 3 clone It was already observed at a 1:50 dilution of the liquid. In both tests, it was observed that higher concentrations of cell growth tended to be inhibited. The culture solution of untransfected fibroblasts among the KMST-6 cell lines did not show any growth stimulating effect when compared to the cell culture solution without the addition of any growth factors. To examine the therapeutic effect on wound healing in more detail, lethally irradiated EGF-gene transfected fibroblasts were co-cultured in vitro with human primary keratinocytes. In these experiments, it was possible to achieve a dose-dependent stimulation of keratinocyte proliferation when cultured with different concentrations of irradiated EGF-secreting fibroblasts for 4 days, and such stimulation was achieved with recombinant growth factor Was found to be similar to the stimulus evoked by. This is shown in FIG. 4, where FIG. 4 (A) shows the values in the case of co-culture for 4 days, and FIG. 4 (B) shows the values in the case of co-culture for 10 days. The numerical values obtained are shown. Example 4 Demonstration that EGF is produced in vivo by liposome transfected KMST-6 cells in vitro Experimental configuration A full-thickness skin wound measuring 1.5 × 1.5 cm was created on the back of 42 nude mice. 9.4x10 6 HEGF transfected and lethally irradiated KMST-6 cells were suspended in 2.8 ml of fibrin adhesion adhesive and implanted onto full thickness skin wounds of 14 nude mice (300, 000 cells / cm Two , Group I). Fourteen full thickness skin wounds were implanted with untransfected KMST-6 cells (300,000 cells / cm). Two , Group II) and 14 untreated full thickness skin wounds (Group III) were used as controls. On days 1, 2, 3, 4, 5, 7, and 14, two animals from each group were subjected to necropsy and 0.8 g of wound tissue was homogenized with Triton-X / PBS buffer. . The obtained homogenate was centrifuged, and the concentration of EGF in the supernatant was evaluated and measured using an anti-human EGF ELISA. result On day 1, 470 ng / ml was detected in vivo in group I (according to the invention), whereas 18 ng / ml in group II and 1.3 ng / ml in group III. Was done. The concentration of group Inioit eEGF decreased on days 2-7, but was still significantly higher than in the control group. On day 14, it was not possible to detect EGF in any of the three groups. In summary, these three results demonstrate that it is possible to successfully transplant EGF-transfected fibroblasts in vitro in a fibrin adhesion adhesive suspension. It was possible to detect the transformed protein in vivo by at least 7 days. The results obtained in this experiment are summarized in Table I below. Table I shows in vivo hEGF release in pg / ml released by irradiated fibroblasts transfected with the chimeric hEGF gene into the wound. Example 5 Wound healing promoting effect when KMST-6 cells transfected with EGF in vitro and transplanted in combination with human keratinocytes (mixed cell transplantation) Experimental configuration A full-thickness skin wound measuring 1.5 x 1.5 cm was created on the back of 72 nude mice. 1.0125x10 of EGF transfected and lethally irradiated KMST-6 cells 6 Pcs, 2.025x10 6 Of human keratinocytes, suspended in 3.6 ml of fibrin adhesion adhesive and implanted in full thickness skin wounds of 18 nude mice (ratio 1: 2, 75,000 cells / cm) Two , Group I). Eighteen full thickness skin wounds implanted with EGF-transfected KMST-6 cells in the wound (25,000 cells / cm, Group II), 18 full thickness skin wounds implanted with human keratinocytes in the wound (50,000 Cells / cm Two , Group III) and untransfected KMST-6 cells were implanted in combination with human keratinocytes and used as a control for 18 skin wounds (ratio 1: 2, 75,000 cells / cm2). Two , Group IV). Table II shows the groupings. On days 1, 2, 3, 4, 5, 7, and 12, one animal from each group was subjected to necropsy and 0.8 g of wound tissue was homogenized with Triton-X / PBS buffer. . The obtained homogenate was centrifuged, and the concentration of EGF in the supernatant was evaluated and measured using an anti-human EGF ELISA. From day 5, the other half of the biopsy was submitted for histological examination. On days 7, 10, 12, 14, 17, and 21 post-surgery, two additional animals from each group were examined histologically. result EGF was detectable in Groups I and II but not in Groups III and IV. As far as wound closure is concerned, the results in Group I show that epithelialization is almost perfect and pronounced from day 7-14, and from day 14 onwards. Group I wounds also showed the best results for epidermal remodeling (cell placement in the epidermis). On the contrary. The control group did not show significant epithelialization by day 14 and no high degree of epithelialization by day 21. Such epithelializations are listed in Table III. Example 6 Wound healing promoting effect in large animal model when KMST-6 cells transfected with EGF in vitro are transplanted Experimental configuration In a large animal experiment, three Nuta (P1, P2 and P3) were tested using 21 standardized burn wounds (15 cm2, 2a degrees in size) for each subject. In one pig (P1), seven normalized burn wounds were implanted with EGF-transfected KMST-6 cells in fibrin adhesion adhesive (treatment group). In this case, seven untreated standardized burn wounds (control group I) and seven standardized burn wounds treated with fibrin adhesion adhesive (control group III) were used as comparative controls. In another two pigs (P2 and P3), EGF-transfected KMST-6 cells were implanted in fibrin adhesion glue for each subject as well for seven standardized burn wounds (treatment group). For each subject, seven untreated normalized burn wounds (control group I) and seven normalized burn wounds implanted with untransfected KMST-6 cells (control group II) were used as comparison controls. Table IV shows the groupings. On days 1, 3, 5, 7, 10, 21 and 35, one wound from each group was subjected to necropsy and 0.8 g of wound tissue from the biopsy up to day 10 was loaded with Triton-X / PBS. Homogenization treatment was performed using a buffer. The obtained homogenate was centrifuged, and the concentration of EGF in the supernatant was evaluated and measured using an anti-human EGF ELISA. In addition, biopsies were evaluated histologically. result Table V shows the EGF concentration in one wound in each subject in each group.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】平成１１年７月２日（１９９９．７．２）
【補正内容】特許請求の範囲
１． 創傷治癒促進作用のサイトカインをコードする外来・異種遺伝子を少なく
とも一種を有する繊維芽細胞およびフィブリン接着癒着剤を含んでなる、創傷を
治療するための組成物。
２． 該フィブリン接着癒着剤が、フィブリノーゲンとフィブロネクチンおよび
時宜に応じてアルブミン、第ＸＩＩＩ因子とプラスミノーゲンを含有して成るこ
とを特徴とする、請求項１において請求された組成物。
３． 当該組成物が、付加的な該創傷治癒促進成分として支持マトリックスとし
て機能する固体の構成成分を含んでなることを特徴とする、請求項１において請
求された組成物。
４． 該固体構成成分が、ヒアルロン酸はから構成される支持マトリックスであ
ることを特徴とする、請求項３において請求された組成物。
５． 該組成物がまたケラチノサイトをも含んでなることを特徴とする、前記請
求項のうちの何れか一項において請求された組成物。
６． サイトカインをコードする該遺伝子が、トランスフォーミング成長因子α
（ＴＧＦ−α）をコードする遺伝子、上皮成長因子（ＥＧＦ）をコードする遺伝
子、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）をコードする遺伝子、神経成長因
子（ＮＧＦ）をコードする遺伝子およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）をコ
ードする遺伝子とからなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のう
ちの何れか一項において請求された組成物。
７．該繊維芽細胞が、血液細胞に作用するサイトカインをコードする別の外来・
異種遺伝子を少なくとも一種含んでなることを特徴とする、前記請求項のうちの
何れか一項において請求された組成物。
８． サイトカインをコードする該遺伝子が、プラスミドベクターを用いて繊維
芽細胞に導入されることを特徴とする、前記請求項のうちの何れか一項において
請求された組成物。
９． 該プラスミドベクターが、成熟サイトカインをコードする遺伝子と分泌シ
グナル配列とのインフレーム融合物であることを特徴とする、請求項９において
請求された組成物。
１０．該分泌信号配列が、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子配列であることを特徴とする、
請求項１０において請求された組成物。
１１． 該繊維芽細胞がオートロガス繊維芽細胞であることを特徴とする、前記
請求項のうちの何れか一項において請求された組成物。
１２． 該繊維芽細胞が同種異系繊維芽細胞であることを特徴とする、請求項１
ないし１０のうちの何れか一項において請求された組成物。
１３． 該繊維芽細胞が放射線照射処理済みであることを特徴とする、前記請求
項のうちの何れか一項において請求された組成物。
１４．該繊維芽細胞がクローン選択された繊維芽細胞であることを特徴とする、
前記請求項のうちの何れか一項において請求された組成物。
１５． 該同種異系繊維芽細胞がＫＭＳＴ−６細胞株の繊維芽細胞であることを
特徴とする、請求項１２ないし１４のうちの何れか一項において請求された組成
物。
１６． 創傷を治療するため請求項１ないし１５の一項において請求された組成
物を使用する用途。
１７． 該外来・異種遺伝子が、上皮成長因子(ＥＧＦ)、トランスフォーミング
成長因子α(ＴＧＦ−α)、神経成長因子[ｌａｃｕｎａ]、塩基性繊維芽細胞成長
因子（ｂ−ＦＧＦ）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）をそれぞれコード
する遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６において請
求された用途。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] July 2, 1999 (July 7, 1999) [Content of Amendment] Claims 1. A composition for treating a wound, comprising a fibroblast having at least one foreign / heterologous gene encoding a cytokine for promoting wound healing, and a fibrin adhesion / adhesive agent. 2. A composition as claimed in claim 1, characterized in that the fibrin adhesive comprises fibrinogen and fibronectin and optionally albumin, factor XIII and plasminogen. 3. A composition as claimed in claim 1, characterized in that the composition comprises a solid component serving as a support matrix as an additional wound healing promoting component. 4. 4. The composition as claimed in claim 3, wherein the solid component is a support matrix composed of hyaluronic acid. 5. A composition as claimed in any one of the preceding claims, characterized in that the composition also comprises keratinocytes. 6. The gene encoding a cytokine is a gene encoding transforming growth factor α (TGF-α), a gene encoding epidermal growth factor (EGF), a gene encoding basic fibroblast growth factor (b-FGF) , A gene encoding nerve growth factor (NGF) and a gene encoding keratinocyte growth factor (KGF). Composition. 7. The composition according to any one of the preceding claims, characterized in that said fibroblasts comprise at least one other foreign / heterologous gene encoding a cytokine acting on blood cells. 8. The composition as claimed in any one of the preceding claims, characterized in that said cytokine-encoding gene is introduced into fibroblasts using a plasmid vector. 9. 10. The composition as claimed in claim 9, wherein said plasmid vector is an in-frame fusion of a gene encoding a mature cytokine and a secretory signal sequence. 10. The composition according to claim 10, wherein the secretory signal sequence is a human G-CSF gene sequence. 11. A composition as claimed in any one of the preceding claims, characterized in that said fibroblasts are autologous fibroblasts. 12. 11. The composition as claimed in any one of claims 1 to 10, wherein said fibroblasts are allogeneic fibroblasts. 13. The composition according to any one of the preceding claims, characterized in that the fibroblasts have been irradiated. 14． The composition according to any one of the preceding claims, characterized in that said fibroblasts are clone-selected fibroblasts. 15. 15. The composition as claimed in any one of claims 12 to 14, wherein said allogeneic fibroblasts are fibroblasts of the KMST-6 cell line. 16. Use of a composition as claimed in one of claims 1 to 15 for treating a wound. 17． The foreign / heterologous genes are epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor α (TGF-α), nerve growth factor [lacuna], basic fibroblast growth factor (b-FGF) and keratinocyte growth factor (KGF ) Is selected from the group consisting of the genes each encoding).
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
// Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 37/24
(72)発明者 クルムブルク、ペーター
フランス国、エフ―68128 ロゼナウ、リ
ュー・ド・ヴィラージュ・ヌフ、11セ
(72)発明者 スターク、ビョルン・ゲー
ドイツ国、デー―79199 キルヒツァルテ
ン、ロテックヴェーク、13番
(72)発明者 タンチョス、エスツター
ドイツ国、デー―79104 フライブルク、
カルトイザーシュトラーセ、94番
(72)発明者 コップ、ユルゲン
ドイツ国、デー―79102 フライブルク、
カルトイザーシュトラーセ、72番──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // A61K 38/22 A61K 37/24 (72) Inventor Kulmburg, Peter France, F-68128 Rosenau, Li View de Village Neuf, 11th (72) Inventor, Stark, Bjorn Göh, Germany, day 7979 Kirchzarten, Rotekweg, No. 13 (72) Inventor, Tanchos, Ester Germany, 7979 Freiburg, Germany , Kartoiserstrasse, 94 (72) Inventor Kop, Jürgen Germany, 7979 Freiburg, Kartoiserstrasse, 72