DE19921940C2

DE19921940C2 - Method for the electrochemical detection of nucleic acid oligomer hybrids

Info

Publication number: DE19921940C2
Application number: DE19921940A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Hartwich; Adam Heller
Original assignee: Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Current assignee: FRIZ BIOCHEM GESELLSCHAFT FUER BIOANALYTIK MBH, 814
Priority date: 1998-11-23
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2003-02-06
Anticipated expiration: 2019-04-30
Also published as: KR20010080973A; DE19921940A1; ZA200103180B

Description

Technical field

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer sowie ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von sequenzspezifischen Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungs ereignissen.The present invention relates to a modified nucleic acid oligomer and a method for electrochemical detection of sequence-specific nucleic acid-oligomer hybridization events.

State of the art

Zur Sequenzanalyse von DNA und RNA z. B. in der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Test verfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung sowie auf dem Agrar- und pharmazeu tischen Sektor werden im allgemeinen gel-elektrophoretische Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion verwendet.For sequence analysis of DNA and RNA z. B. in disease diagnosis, in toxicological tests process, in genetic research and development, and in agriculture and pharmacy tical sector are generally gel electrophoretic methods with autoradiographic or optical detection used.

Zur Veranschaulichung des wichtigsten gel-elektrophoretischen Verfahrens mit optischer Detektion (Sanger-Verfahren) ist in Fig. 1b ein DNA-Fragment mit Primer dargestellt. Bei dem Sanger-Ver fahren wird eine DNA-enthaltende Lösung in vier Ansätze aufgeteilt und der Primer jedes Ansatzes mit je einem bei verschiedener Wellenlänge emittierenden Fluoreszenzfarbstoff kovalent modifiziert. Wie in Fig. 1b dargestellt, wird zu jedem Ansatz Desoxyribonukleosid-Triphosphat der Basen A (Adenin), T (Thymin), C (Cytosin), und G (Guanin), also dATP, dTTP, dCTP und dGTP, gegeben, um den Einzelstrang, ausgehend vom Primer, durch DNA-Polymerase I enzymatisch zu replizieren. Zusätzlich zu den vier Desoxyribonukleosid-Triphosphaten enthält jedes Reaktionsgemisch noch genügend des 2',3'-Didesoxyanalogons (Fig. 1a) eines dieser Nukleosidtriphosphate als Stopp base (je eine der 4 möglichen Stoppbasen pro Ansatz), um die Replikation an allen möglichen Bindungsstellen zu stoppen. Nach Vereinigung der vier Ansätze entstehen replizierte DNA- Fragmente aller Längen mit stoppbasenspezifischer Fluoreszenz, die gel-elektrophoretisch der Länge nach sortiert und durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert werden können (Fig. 1c). To illustrate the most important gel electrophoretic method with optical detection (Sanger method), a DNA fragment with primer is shown in FIG. 1b. In the Sanger process, a DNA-containing solution is divided into four batches and the primer of each batch is covalently modified with a fluorescent dye that emits at different wavelengths. As shown in Fig. 1b, deoxyribonucleoside triphosphate of bases A (adenine), T (thymine), C (cytosine), and G (guanine), i.e. dATP, dTTP, dCTP and dGTP, is added to each batch, around the Single strand, starting from the primer, to be replicated enzymatically by DNA polymerase I. In addition to the four deoxyribonucleoside triphosphates, each reaction mixture contains enough of the 2 ', 3'-dideoxy analogue ( Fig. 1a) of one of these nucleoside triphosphates as a stop base (one of the 4 possible stop bases per approach) to replicate at all possible binding sites to stop. After combining the four approaches, replicated DNA fragments of all lengths with stop-base-specific fluorescence are formed, which can be sorted by gel electrophoresis in length and characterized by fluorescence spectroscopy ( FIG. 1c).

Ein anderes optisches Detektionsverfahren basiert auf der Anlagerung von Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Ethidiumbromid an Oligonukleotide. Die Fluoreszenz solcher Farbstoffe steigt im Vergleich zur freien Lösung des Farbstoffs um etwa das 20-fache an, wenn sie sich an doppelsträngige DNA oder RNA anlagern und kann deshalb zum Nachweis hybridisierter DNA oder RNA verwendet wer den.Another optical detection method is based on the attachment of fluorescent dyes such as B. Ethidium bromide on oligonucleotides. The fluorescence of such dyes increases in comparison to free dissolve the dye about 20-fold when it adheres to double-stranded DNA or attach RNA and can therefore be used for the detection of hybridized DNA or RNA the.

Bei der radioaktiven Markierung wird ³²P in das Phosphatgerüst der Oligonukleotide eingebaut, wobei ³²P gewöhnlich am 5'-Hydroxylende durch Polynukleotid-Kinase addiert wird. Die markierte DNA wird anschließend an jeweils einem der vier Nukleotidtypen bevorzugt gespalten und zwar unter definierten Bedingungen, so daß pro Kette durchschnittlich eine Spaltung erfolgt. Damit liegen im Reaktionsgemisch für einen bestimmten Basentyp Ketten vor, die sich von der ³²P-Markierung bis zur Position dieser Base erstrecken (bei mehrfachem Auftreten der Base erhält man ent sprechend Ketten unterschiedlicher Länge). Die vier Fragmentgemische werden anschließend auf vier Bahnen gel-elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wird vom Gel ein Autoradiogramm ange fertigt, an dem die Sequenz unmittelbar abgelesen werden kann.In the case of radioactive labeling, ³² P is incorporated into the phosphate skeleton of the oligonucleotides, ³² P usually being added at the 5'-hydroxyl end by polynucleotide kinase. The labeled DNA is then preferably cleaved at one of the four nucleotide types, under defined conditions, so that an average cleavage occurs per chain. This means that there are chains in the reaction mixture for a certain base type that extend from the ³² P mark to the position of this base (if the base occurs more than once, chains of different lengths are obtained accordingly). The four fragment mixtures are then separated by gel electrophoresis on four lanes. An autoradiogram is then made from the gel, from which the sequence can be read immediately.

Vor einigen Jahren wurde ein weiteres, auf optischer (oder autoradiographischer) Detektion be ruhendes Verfahren zur DNA-Sequenzierung entwickelt, nämlich die Sequenzierung durch Oligo merhybridisierung (vgl. z. B. Drmanac et al., Genomics 4, (1989), S. 114-128 oder Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), S. 303-307). Bei diesem Verfahren wird ein vollständiger Satz kurzer Oligonukleotide bzw. Oligomere (Sonden-Oligonukleotide), z. B. alle 65536 möglichen Kombina tionen der Basen A, T, C und G eines Oligonukleotid-Oktamers auf ein Trägermaterial gebunden. Die Anbindung geschieht in einem geordneten Raster aus 65536 Test-Sites, wobei jeweils eine größere Menge einer Oligonukleotid-Kombination ein Test-Site definieren und die Position jeder einzelnen Test-Site (Oligonukleotid-Kombination) bekannt ist. Auf solch einer Hybridisierungsmatrix, dem Oligomerchip, wird ein DNA-Fragment, dessen Sequenz man ermitteln will, das Target, mit Fluoreszenz-Farbstoff (oder ³²P) markiert und unter Bedingungen, die nur eine spezifische Doppel strangbildung erlauben, hybridisiert. Dadurch bindet das Target DNA-Fragment nur an die Oligo mere (im Beispiel an die Oktamere), deren komplementäre Sequenz exakt einem Teil (einem Okta mer) seiner eigenen Sequenz entspricht. Durch optische (oder autoradiographische) Detektion der Bindungsposition des hybridisierten DNA-Fragments werden damit alle im Fragment vorhandenen Oligomersequenzen (Oktamersequenzen) bestimmt. Aufgrund der Überlappung benachbarter Oligomersequenzen kann durch geeignete mathematische Algorithmen die fortlaufende Sequenz des DNA-Fragments bestimmt werden. Die Vorteile dieses Verfahrens liegen unter anderem in der Miniaturisierung der Sequenzierung und damit in der enormen Datenmenge, die gleichzeitig in einem Arbeitsgang erfaßt wird. Daneben kann auf Primer und auf das gel-elektrophoretische Auf trennen der DNA-Fragmente verzichtet werden. Beispielhaft ist dieses Prinzip in Fig. 2 für ein 13 Basen langes DNA-Fragment gezeigt.A few years ago, a further method for DNA sequencing based on optical (or autoradiographic) detection was developed, namely sequencing by oligo mer hybridization (cf. e.g. Drmanac et al., Genomics 4, (1989), p. 114-128 or Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), pp. 303-307). In this method, a complete set of short oligonucleotides or oligomers (probe oligonucleotides), e.g. B. all 65536 possible combinations of bases A, T, C and G of an oligonucleotide octamer are bound to a support material. The connection is made in an ordered grid of 65536 test sites, a larger amount of an oligonucleotide combination defining a test site and the position of each individual test site (oligonucleotide combination) being known. On such a hybridization matrix, the oligomer chip, a DNA fragment, the sequence of which is to be determined, the target is labeled with fluorescent dye (or ³² P) and hybridized under conditions which only permit specific double strand formation. As a result, the target DNA fragment only binds to the oligomers (in the example to the octamers), whose complementary sequence corresponds exactly to a part (an octamer) of its own sequence. By optical (or autoradiographic) detection of the binding position of the hybridized DNA fragment, all oligomer sequences (octamer sequences) present in the fragment are thus determined. Due to the overlap of adjacent oligomer sequences, the continuous sequence of the DNA fragment can be determined using suitable mathematical algorithms. The advantages of this method include the miniaturization of the sequencing and thus the enormous amount of data that is recorded simultaneously in one operation. In addition, primers and the gel electrophoretic separation of the DNA fragments can be dispensed with. This principle is shown by way of example in FIG. 2 for a 13-fragment-long DNA fragment.

Die Verwendung radioaktiver Markierungen bei der DNA-/RNA-Sequenzierung ist mit mehreren Nachteilen verbunden, wie z. B. aufwendige, gesetzlich vorgeschriebene Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit radioaktiven Materialien, die Strahlenbelastung, das begrenzte räumliche Auf lösungsvermögen (maximal 1 mm²) und eine Sensitivität, die nur dann hoch ist, wenn die Strahlung der radioaktiven Fragmente entsprechend lange (Stunden bis Tage) auf einen Röntgenfilm einwirkt. Es kann zwar die räumliche Auflösung durch zusätzliche Hard- und Software erhöht und die De tektionszeit durch die Verwendung von β-Scannern verkürzt werden, beides ist jedoch mit erheb lichen zusätzlichen Kosten verbunden.The use of radioactive labels in DNA / RNA sequencing has several disadvantages, such as e.g. B. elaborate, legally prescribed safety precautions when handling radioactive materials, the radiation exposure, the limited spatial resolution (maximum 1 mm ² ) and a sensitivity that is only high if the radiation of the radioactive fragments is long enough (hours to days) acts on an x-ray film. Although the spatial resolution can be increased by additional hardware and software and the detection time can be shortened by using β scanners, both are associated with considerable additional costs.

Die Fluoreszenzfarbstoffe, die üblicherweise zur Markierung der DNA verwendet werden, sind zum Teil (z. B. Ethidiumbromid) mutagen und erfordern, ebenso wie die Anwendung der Autoradio graphie, entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. In fast allen Fällen erfordert die Verwendung optischer Detektion den Gebrauch von einem oder mehreren Lasersystemen und somit geschultes Personal und entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. Die eigentliche Detektion der Fluoreszenz erfordert zusätzliche Hardware, wie z. B. optische Bauelemente zur Verstärkung und, bei ver schiedenen Anregungs- und Abfragewellenlängen wie im Sanger-Verfahren, ein Kontrollsystem. Abhängig von den benötigten Anregungswellenlängen und der gewünschten Detektionsleistung können somit erhebliche Investitionskosten entstehen. Bei der Sequenzierung durch Hybridisierung auf dem Oligomerchip ist die Detektion noch (kosten)aufwendiger, da, neben dem Anregungs system, zur 2-dimensionalen Detektion der Fluoreszenzspots hochauflösende CCD-Kameras (Charge Coupled Device Kameras) benötigt werden.The fluorescent dyes that are commonly used to label the DNA are for Part (e.g. ethidium bromide) mutagenic and require, as well as the use of the car radio graphics, corresponding safety precautions. In almost all cases, the use requires optical detection the use of one or more laser systems and thus trained Personnel and appropriate safety precautions. The actual detection of fluorescence requires additional hardware, such as B. optical components for amplification and, at ver different excitation and query wavelengths as in the Sanger method, a control system. Depending on the required excitation wavelengths and the desired detection power considerable investment costs can arise. When sequencing by hybridization Detection on the oligomer chip is even more (costly) because, in addition to the excitation system for the 2-dimensional detection of the fluorescence spots of high-resolution CCD cameras (Charge Coupled Device Cameras) are required.

Aus der US 5 312 527 ist ein voltammetrischer sequenz-selektiver Sensor zur Detektion von Poly nukleotiden bekannt. Das zu detektierende Polynukleotid hybridisiert dabei an ein an eine Elektrode gebundenes Polynukleotid. Zur elektrochemischen Detektion werden redoxaktive Verbindungen zugegeben, die reversibel an doppelsträngige, aber nicht an einsträngige DNA binden.From US 5 312 527 is a voltammetric sequence-selective sensor for the detection of poly known nucleotides. The polynucleotide to be detected hybridizes to an electrode bound polynucleotide. Redox-active compounds are used for electrochemical detection added, which bind reversibly to double-stranded, but not to single-stranded DNA.

Die US 5 770 369 offenbart kovalent an Nukleinsäuren gebundene Elektronentransfer-Einheiten wie z. B. Übergangsmetallkomplexe, Chinone und Riboflavin. Diese modifizierten Nukleinsäuren werden in einem elektrochemischen Verfahren zur Detektion von Oligonukleotiden eingesetzt.US 5 770 369 discloses electron transfer units covalently bound to nucleic acids such as z. B. transition metal complexes, quinones and riboflavin. These modified nucleic acids will used in an electrochemical method for the detection of oligonucleotides.

Obwohl es also quantitative und extrem sensitive Methoden zur DNA-/RNA-Sequenzierung gibt, sind diese Methoden zeitaufwendig, bedingen aufwendige Probenpräparation und teure Ausstattung und sind im allgemeinen nicht als transportable Systeme verfügbar.So although there are quantitative and extremely sensitive methods for DNA / RNA sequencing, if these methods are time-consuming, they require complex sample preparation and expensive equipment and are generally not available as portable systems.

Presentation of the invention

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur De tektion von Nukleinsäureoligomerhybriden zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Tech nik nicht aufweisen.The object of the present invention is therefore to provide a device and a method for de tection of nucleic acid oligomer hybrids to create, which the disadvantages of the prior art nik not have.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das modifizierte Oligonukleotid gemäß unabhängigem Patentanspruch 1, durch das Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Oligonukleotids gemäß unabhängigem Anspruch 8 und 9, durch die modifizierte leitfähige Oberfläche gemäß unab hängigem Patentanspruch 10, das Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Ober fläche gemäß unabhängigem Patentanspruch 20, sowie durch das Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Oligomerhybridisierungsereignissen gemäß unabhängigem Patentanspruch 26 ge löst.According to the invention, this object is achieved independently by the modified oligonucleotide Claim 1, by the method for producing a modified oligonucleotide according to independent claims 8 and 9, by the modified conductive surface according to unab dependent claim 10, the method for producing a modified conductive upper area according to independent claim 20, and by the method for electrochemical Detection of oligomer hybridization events according to independent claim 26 ge solves.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:The following abbreviations and terms are used in the context of the present invention:

genetics

DNA: Desoxyribonukleinsäure
RNA: Ribonukleinsäure
PNA: Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker- Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH₂ DNA: deoxyribonucleic acid
RNA: ribonucleic acid
PNA: peptide nucleic acid (synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid. When the sugar-phosphate unit is replaced by the -NH- (CH ₂

)₂ ) ₂

-N(COCH₂ -N (COCH ₂

-Base)- CH₂ -Base) - CH ₂

CO-Einheit hybridisiert PNA mit DNA).
A: Adenin
G: Guanin
C: Cytosin
T: Thymin
Base: A, G, T, oder C
Bp: Basenpaar
Nukleinsäure: wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker- Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rück grat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio- Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, daß sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Nukleinsäure-Oligomer: Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure- Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid: Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA, PNA oder RNA Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid.
dATP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des A (DNA-Einheit mit der Base A und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA- Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dGTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des G (DNA-Einheit mit der Base G und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA- Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dCTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des C (DNA-Einheit mit der Base C und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA- Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dTTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des T (DNA-Einheit mit der Base T und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA- Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
Primer: Start-Komplementär-Fragment eines Oligonukleotids, wobei die Basenlänge des Primers nur ca. 4-8 Basen beträgt. Dient als Ansatz punkt für die enzymatische Replikation des Oligonukleotids.
Mismatch: Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligo nukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, daß die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil er setzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ds: double strand (Doppelstrang)
ss: single strand (Einzelstrang)CO unit hybridizes PNA with DNA).
A: Adenine
G: Guanine
C: Cytosine
T: thymine
Base: A, G, T, or C
Bp: base pair
Nucleic acid: at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine). The term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analog structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone). An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is that it can bind naturally occurring cDNA or RNA in a sequence-specific manner.
Nucleic acid oligomer: nucleic acid of unspecified base length (e.g. nucleic acid octamer: a nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another).
Oligomer: Equivalent to nucleic acid oligomer.
Oligonucleotide: Equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer. B. a DNA, PNA or RNA fragment unspecified base length.
Oligo: Abbreviation for oligonucleotide.
dATP: deoxyribonucleoside triphosphate of A (DNA unit with base A and two other phosphates to build up a longer DNA fragment or an oligonucleotide).
dGTP: deoxyribonucleoside triphosphate of G (DNA unit with base G and two other phosphates to build up a longer DNA fragment or an oligonucleotide).
dCTP: deoxyribonucleoside triphosphate of C (DNA unit with base C and two other phosphates to build up a longer DNA fragment or an oligonucleotide).
dTTP: deoxyribonucleoside triphosphate of T (DNA unit with base T and two other phosphates to build up a longer DNA fragment or an oligonucleotide).
Primer: start complementary fragment of an oligonucleotide, the base length of the primer being only about 4-8 bases. Serves as a starting point for the enzymatic replication of the oligonucleotide.
Mismatch: To form the Watson Crick structure of double-stranded oligo nucleotides, the two single strands hybridize in such a way that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (in the case of RNA, T is by uracil he bets). Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure and is referred to as a "mismatch".
ds: double strand (double strand)
ss: single strand

Chemical substances / groups

R: beliebiger, nicht näher spezifizierter organischer Rest als Substituent oder Seitenkette.
Redox: redoxaktive Substanz
Alkyl: Der Begriff "Alkyl" bezeichnet ein gesättigtes Kohlenwasserstoffradikal, das geradkettig oder verzweigt ist (z. B. Ethyl, Isopropyl oder 2,5-Dimethyl hexyl etc.). Wenn "Alkyl" benutzt wird, um auf einen Linker oder Spacer zu verweisen, bezeichnet der Begriff eine Gruppe mit zwei verfügbaren Valenzen für die kovalente Verknüpfung (z. B. -CH₂ R: any unspecified organic radical as a substituent or side chain.
Redox: redox-active substance
Alkyl: The term "alkyl" denotes a saturated hydrocarbon radical that is straight-chain or branched (e.g. ethyl, isopropyl or 2,5-dimethylhexyl etc.). When "alkyl" is used to refer to a linker or spacer, the term refers to a group with two available valences for covalent linkage (e.g. -CH ₂

CH₂ CH ₂

-, -CH₂ -, -CH ₂

CH₂ CH ₂

- oder -CH₂ - or -CH ₂

C(CH₃ C (CH ₃

)₂ ) ₂

CH₂ CH ₂

C(CH₃ C (CH ₃

)₂ ) ₂

CH₂ CH ₂

- etc.). Bevorzugte Alkylgruppen als Substituenten oder Seitenketten R sind solche der Kettenlänge 1-30 (längste durchgehende Kette von aneinandergebundenen Atomen). Be vorzugte Alkylgruppen als Linker oder Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den Linker oder Spacer verbundenen Strukturen darstellt.
Alkenyl: Alkylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-C Einfachbindungen durch C=C Doppelbindungen ersetzt sind.
Alkinyl: Alkyl- oder Alkenylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-C Ein fach- oder C=C Doppelbindungen durch C∼C Dreifachbindungen er setzt sind.
Hetero-Alkyl: Alkylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen oder C- C Einfachbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkenyl: Alkenylgruppen bei denen eine oder mehrere C-H Bindungen, C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkinyl: Alkinylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen, C-C Einfach-, C=C Doppel- oder C∼C Dreifachbindung durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Linker: molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Ober flächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Heteroalkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stel len mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reak tionen mit den entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photo aktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1- 14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächen molekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer: Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu ver bindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevor zugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
(n × HS-Spacer)-oligo: Nukleinsäure-Oligomer, an das n Thiolfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei die Spacer jeweils eine unter schiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Thiolfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen kön nen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein und "n" ist eine be liebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
(n × R-S-S-Spacer)-oligo: Nukleinsäure-Oligomer, an das n Disulfidfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei ein beliebiger Rest R die Disulfid funktion absättigt. Der Spacer zur Anbindung der Disulfidfunktion an das Nukleinsäure-Oligomer kann jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfid funktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vor handene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Der Platzhalter "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo: zwei gleiche oder verschiedene Nukleinsäure-Oligomere, die über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind, wobei die Disulfidbrücke über zwei beliebige Spacer an die Nukleinsäure-Oligomere ange bunden ist und die beiden Spacer eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidbrücke und dem jeweiligen Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14 und diese Spacer wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure- Oligomer vorhandene oder an diese durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein können.
PQQ: Pyrrolo-Chinolino-Chinon, entspricht: 4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H- pyrrolo-[2,3-f]-chinolin-2,7,9-tricarboxylsäure)
TEATFB: Tetraethylammonium-tetrafluoroborat
sulfo-NHS: N-Hydroxysulfosuccinimid
EDC: (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES: N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
EDTA: Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
Cystamin: (H₂ - Etc.). Preferred alkyl groups as substituents or side chains R are those of chain length 1-30 (longest continuous chain of bonded atoms). Preferred alkyl groups as linkers or spacers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length being the shortest continuous connection between the structures connected to the linker or spacer.
Alkenyl: alkyl groups in which one or more of the CC single bonds are replaced by C = C double bonds.
Alkynyl: alkyl or alkenyl groups in which one or more of the CC single or C = C double bonds are replaced by C∼C triple bonds.
Hetero-alkyl: alkyl groups in which one or more of the CH bonds or C-C single bonds are replaced by CN, C = N, CP, C = P, CO, C = O, CS or C = S bonds.
Hetero-alkenyl: alkenyl groups in which one or more CH bonds, CC single or C = C double bonds are replaced by CN, C = N, CP, C = P, CO, C = O, CS or C = S bonds.
Hetero-alkynyl: alkynyl groups in which one or more of the CH bonds, CC single, C = C double or C∼C triple bond through CN, C = N, CP, C = P, CO, C = O, CS or C = S bonds are replaced.
Linker: molecular connection between two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule. As a rule, linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, hetero-alkyl, hetero-alkenyl or heteroalkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. In simple / known chemical reactions, these groups form a covalent chemical bond with the corresponding reactants. The reactive groups can also be photo-activatable, ie the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength. Preferred linkers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures to be connected, that is to say between the two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another Molecule.
Spacer: Linker that is covalently linked via the reactive groups to one or both of the structures to be linked (see linker). Preferred spacers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected.
(n × HS spacer) oligo: nucleic acid oligomer to which n thiol functions are each connected via a spacer, the spacers each having a different chain length (shortest continuous connection between thiol function and nucleic acid oligomer), in particular in each case any chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be bound to various reactive groups that are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to it by modification and “n” is an arbitrary integer, in particular a number between 1 and 20.
(n × RSS spacer) oligo: nucleic acid oligomer to which n disulfide functions are each connected via a spacer, any residue R saturating the disulfide function. The spacer for connecting the disulfide function to the nucleic acid oligomer can each have a different chain length (shortest continuous connection between disulfide function and nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be connected to various nucleic acid Oligomer before existing or attached to this by modification attached reactive groups. The placeholder "n" is any integer, in particular a number between 1 and 20.
oligo-spacer-SS-spacer-oligo: two identical or different nucleic acid oligomers which are connected to one another via a disulfide bridge, the disulfide bridge being linked to the nucleic acid oligomers via any two spacers and the two spacers having a different chain length (shortest can have a continuous connection between the disulfide bridge and the respective nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14, and these spacers can in turn be bound to various reactive groups that are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to these by modification.
PQQ: pyrrolo-quinolino-quinone, corresponds to: 4,5-dihydro-4,5-dioxo-1H-pyrrolo- [2,3-f] -quinoline-2,7,9-tricarboxylic acid)
TEATFB: tetraethylammonium tetrafluoroborate
sulfo-NHS: N-hydroxysulfosuccinimide
EDC: (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
HEPES: N- [2-hydroxyethyl] piperazine-N '- [2-ethanesulfonic acid]
Tris: tris (hydroxymethyl) aminomethane
EDTA: ethylenediamine tetraacetate (sodium salt)
Cystamine: (H ₂

N-CH₂ N-CH ₂

-CH₂ -CH ₂

-S-)₂ -S-) ₂

modified surfaces / electrodes

Mica: Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner Schichten.
Au-S-ss-oligo-PQQ: Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivatisiertem 12 Bp Einzelstrang Oligonukleotid (Sequenz: TAGTCGGAAGCA). Hierbei ist die endständigen Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH₂ Mica: muscovite platelets, carrier material for applying thin layers.
Au-S-ss-oligo-PQQ: Gold film on mica with covalently applied monolayer of derivatized 12 bp single strand oligonucleotide (sequence: TAGTCGGAAGCA). The terminal phosphate group of the oligonucleotide is at the 3 'end with (HO- (CH ₂

)₂ ) ₂

-S)₂ -S) ₂

zum P-O-(CH₂ to PO- (CH ₂

)₂ ) ₂

-S-S- (CH₂ -SS- (CH ₂

)₂ ) ₂

-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt. Die endständige Base Thy min am 5'- Ende des Oligonukleotids ist am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-NH-CH₂ -OH esterified, the SS bond being cleaved homolytically and causing an Au-SR bond. The terminal base Thy min at the 5 'end of the oligonucleotide is at C-5 carbon with -CH = CH-CO-NH-CH ₂

-CH₂ -CH ₂

-NH₂ -NH _2nd

modifiziert und dieser Rest wiederum ist über seine freie Aminogruppe durch Amidbildung mit einer Carbon säuregruppe des PQQ verbunden.
Au-S-ds-oligo-PQQ: Au-S-ss-oligo-PQQ, welches mit dem zu ss-oligo (Sequenz: TAGTCGGAAGCA) komplementären Oligonukleotid hybridisiert vorliegt.modified and this rest in turn is connected via its free amino group by amide formation with a carboxylic acid group of the PQQ.
Au-S-ds-oligo-PQQ: Au-S-ss-oligo-PQQ, which is present in hybridized form with the oligonucleotide complementary to ss-oligo (sequence: TAGTCGGAAGCA).

electrochemistry

E: Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
E₀ E: Electrode potential that is applied to the working electrode.
E ₀

: Halbstufenpotential, Potential in der Mitte zwischen den Strom-Maxima für Oxidation und Reduktion einer in der Cyclovoltametrie reversiblen Elektro oxidation oder -reduktion.
i: Stromdichte (Strom pro cm² : Half-level potential, potential in the middle between the current maxima for oxidation and reduction of an electrical oxidation or reduction reversible in cyclic voltammetry.
i: current density (current per cm ²

Elektrodenoberfläche)
Cyclovoltametrie: Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert, aus gehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
Amperometrie: Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom wird in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.Electrode surface)
Cyclic voltametry: recording a current / voltage curve. The potential of a stationary working electrode is changed linearly as a function of time, from a potential at which no electrooxidation or reduction takes place to a potential at which a dissolved or adsorbed species is oxidized or reduced (i.e. current flows). After passing through the oxidation or reduction process, which generates an initially rising current in the current / voltage curve and a gradually decreasing current after reaching a maximum, the direction of the potential feed is reversed. The behavior of the products of electrooxidation or reduction is then recorded in the return.
Amperometry: recording a current / time curve. Here, the potential of a stationary working electrode z. B. by a potential jump to a potential at which the electrooxidation or reduction of a dissolved or adsorbed species takes place and the flowing current is recorded as a function of time.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Oligomer, das durch chemische Anbindung einer redoxaktiven Substanz modifiziert ist, nämlich durch Anbindung einer Verbindung mit einem über wiegend planaren p-π-Orbital-System, nämlich ein 1,2-Naphtochinon der allgemeinen Struktur
The present invention relates to a nucleic acid oligomer which is modified by chemical attachment of a redox-active substance, namely by attachment of a compound with a predominantly planar p-π orbital system, namely a 1,2-naphthoquinone of the general structure

oder ein 1,4-Naphtochinon der allgemeinen Struktur
or a 1,4-naphthoquinone of the general structure

oder ein 9,10-Anthrachinon der allgemeinen Struktur
or a 9,10-anthraquinone of the general structure

oder ein Pyrrolo-Chinolin-Chinon der allgemeinen Struktur
or a pyrrolo-quinoline-quinone of the general structure

wobei R₁ bis R₈ unabhängig voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten sind.wherein R ₁ to R _{8 are} independently H or any alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent.

Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent ver bundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Gua nin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. In der vorliegenden Erfindung be zieht sich der Begriff Nukleinsäure auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimi din- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, daß sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenz spezifisch binden kann. Alternativ zu dem Begriff "Nukleinsäure-Oligomer" werden die Begriffe "(Sonden-)Oligonukleotid", "Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet. In the context of the present invention, a compound is used as the nucleic acid oligomer at least two covalently linked nucleotides or from at least two covalently ver bound pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or gua nin), preferably a DNA, RNA or PNA fragment. In the present invention the term nucleic acid extends to any "backbone" of the covalently linked pyrimi din or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of DNA, cDNA or RNA a peptide backbone of the PNA or on analogous backbone structures such as e.g. B. a thio-phosphate, a dithio-phosphate or a phosphoramide backbone. Essential characteristic of a nucleic acid In the sense of the present invention is that they naturally occurring cDNA or RNA sequence can bind specifically. As an alternative to the term "nucleic acid oligomer", the terms "(Probe) oligonucleotide", "nucleic acid" or "oligomer" used.

Daneben betrifft die vorliegende Erfindung eine leitfähige Oberfläche, an die direkt oder indirekt (über einen Spacer) ein Nukleinsäure-Oligomer mit angebundener redoxaktiver Substanz chemisch gebunden ist. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer modi fizierten leitfähigen Oberfläche, wobei ein modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer auf eine leitfähige Oberfläche aufgebracht wird. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das die elektrochemische Detektion molekularer Strukturen, insbesondere die elektro chemische Detektion von DNA-/RNA-/PNA-Fragmenten in einer Probenlösung durch sequenz spezifische Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierung ermöglicht. Die Detektion der Hybridisierungs ereignisse durch elektrische Signale ist eine einfache und kostengünstige Methode und ermöglicht in einer batteriebetriebenen Variante eines Sequenziergeräts den Einsatz vor Ort.In addition, the present invention relates to a conductive surface to which directly or indirectly (via a spacer) a nucleic acid oligomer with attached redox-active substance chemically is bound. The present invention also relates to a method for producing a mode fected conductive surface, wherein a modified nucleic acid oligomer on a conductive Surface is applied. According to a further aspect, the present invention relates to a Method that involves the electrochemical detection of molecular structures, in particular the electro chemical detection of DNA / RNA / PNA fragments in a sample solution by sequence enables specific nucleic acid-oligomer hybridization. The detection of hybridization events through electrical signals is a simple and inexpensive method and enables in a battery-operated variant of a sequencer used on site.

Binding of a redox-active substance to a nucleic acid oligomer

Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Bindung einer redoxaktiven Substanz an ein Nukleinsäure-Oligomer. Unter dem Begriff "selektiv oxidierbar und reduzierbar" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Redoxreaktion, also Abgabe oder Aufnahme eines Elektrons, ver standen, welche selektiv am Ort der redoxaktiven Substanz stattfindet. Durch das angelegte Poten tial wird also letztendlich kein anderer Teil des Nukleinsäure-Oligomers reduziert oder oxidiert, son dern ausschließlich die an das Nukleinsäure-Oligomer gebundene redoxaktive Substanz.The binding of a redox-active substance is a prerequisite for the method according to the invention a nucleic acid oligomer. The term "selectively oxidizable and reducible" is used in the framework the present invention, a redox reaction, that is to say the emission or acceptance of an electron stood, which takes place selectively at the site of the redox-active substance. By the created poten Ultimately, no other part of the nucleic acid oligomer is ultimately reduced or oxidized only the redox-active substance bound to the nucleic acid oligomer.

Unter redoxaktiver Substanz werden erfindungsgemäß die nachfolgend genannten Moleküle ver standen, die im elektrochemisch zugänglichen Potentialbereich der jeweiligen Trägeroberfläche (Elektrode) durch Anlegen einer äußeren Spannung an dieser Elektrode elektrooxidiert/-reduziert werden können. Zur Anbindung an das Sonden-Oligonukleotid eignen sich die Pyrrolo-Chinolin- Chinone (PQQ) der allgemeinen Formel 1 oder sonstige Chinone wie 1,4-Naphtochinone der all gemeinen Formel 2, 1,2-Naphtochinone der allgemeinen Formel 3 oder 9,10-Anthrachinone der allgemeinen Formel 4. According to the invention, the molecules mentioned below are used under redox-active substance stood in the electrochemically accessible potential range of the respective carrier surface (Electrode) electro-oxidized / reduced by applying an external voltage to this electrode can be. The pyrrolo-quinoline are suitable for binding to the probe oligonucleotide. Quinones (PQQ) of the general formula 1 or other quinones such as 1,4-naphthoquinones of all general formula 2, 1,2-naphthoquinones of the general formula 3 or 9,10-anthraquinones general formula 4.

R₁ bis R₈ sind unabhängig voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten.R ₁ to R ₈ are independently H or any alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent.

Erfindungsgemäß wird eine redoxaktive Substanz an ein Oligonukleotid kovalent durch die Reaktion des Oligonukleotids mit der redoxaktiven Substanz gebunden. Diese Bindung kann auf drei ver schiedene Arten durchgeführt werden:
According to the invention, a redox-active substance is covalently bound to an oligonucleotide by the reaction of the oligonucleotide with the redox-active substance. This binding can be carried out in three different ways:

a) As a reactive group for binding formation on the nucleic acid oligomer is a free phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group of the oligonucleotide backbone, in particular a group at one of the two ends of the oligonucleotide backbone , used. The free, terminal phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups have an increased reactivity and are therefore easily typical reactions such. B. amide formation with (primary or secondary) amino groups or with acid groups, ester formation with (primary, secondary or tertiary) alcohols or with acid groups, thioester formation with (primary, secondary or tertiary) thio alcohols or with acid groups or the condensation of amine and aldehyde with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond. The coupling group (acid, amine, alcohol, thioalcohol or aldehyde function) required for the covalent attachment of the redox-active substance is either naturally present on the redox-active substance or is obtained by chemical modification of the redox-active substance.
b) The nucleic acid oligomer is on a covalently attached part of the molecule (spacer) of any composition and chain length (represents the shortest continuous connection between the structures to be connected), in particular chain length 1 to 14, on the oligonucleotide backbone or on a base with a modified reactive group. The modification is preferably carried out at one of the ends of the oligonucleotide backbone or at a terminal base. As a spacer z. B. an alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent can be used ver. Possible simple reactions for the formation of the covalent bond between the redox-active substance and the nucleic acid oligomer modified in this way are described under a), the amide formation from the acid and amino group, the ester formation from the acid and alcohol group, and the thioester formation Acid and thio alcohol group or the condensation of aldehyde and amine with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond.
The nucleic acid oligomer is modified by a redox-active substance which has areas with a predominantly planar, in one plane extended p-π orbital system, such as. B. the PQQ of Example 1 or the quinones of the formula 2-4. In this case, the spacer, via which the redox-active substance is bound to the nucleic acid oligomer, can be chosen such that the level of the π orbitals of the redox-active substance is parallel to the p-π orbitals of the bases adjacent to the redox-active substance of the nucleic acid oligomer can arrange. This spatial arrangement of redox-active substance with partially planar in one plane made of extended p-π orbitals has proven to be particularly favorable.
c) In the synthesis of the nucleic acid oligomer, a terminal base is activated by the redox Substance replaced.

Erfindungsgemäß kann die Bindung der redoxaktiven Substanz an das Oligonukleotid wie unter a) und b) beschrieben vor oder nach der Bindung des Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche erfolgen. Die Anbindung der redoxaktiven Substanz an das auf der leitfähigen Oberfläche ge bundene Oligonukleotid erfolgt dann ebenfalls wie unter a) und b) beschrieben.According to the invention, the binding of the redox-active substance to the oligonucleotide can be carried out as under a) and b) described before or after the binding of the oligonucleotide to the conductive surface respectively. The connection of the redox-active substance to that on the conductive surface bound oligonucleotide is then also carried out as described under a) and b).

Bei mehreren verschiedenen Oligonukleotid-Kombinationen (Test-Sites) auf einer gemeinsamen Oberfläche ist es vorteilhaft, die (kovalente) Anbindung der redoxaktiven Substanz an die Sonden- Oligonukleotide durch geeignete Wahl der reaktiven Gruppe an den freien Sonden- Oligonukleotidenden der verschiedenen Test-Sites für die gesamte Oberfläche zu vereinheitlichen.With several different oligonucleotide combinations (test sites) on a common one Surface, it is advantageous to (covalently) bind the redox-active substance to the probe Oligonucleotides by suitable choice of the reactive group on the free probe Unify oligonucleotide ends of different test sites for the entire surface.

The conductive surface

Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird erfindungsgemäß jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe "Elektrode" und "leitfähige (Träger-)Oberfläche" alternativ zu "leitfähige Oberfläche" gebraucht.According to the invention, the term “conductive surface” means each carrier with an electrical understood conductive surface of any thickness, in particular surfaces made of platinum, Palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, carbon, silver, copper, iron, lead, Aluminum and manganese. In the context of the present invention, the terms “electrode” and "conductive (carrier) surface" used as an alternative to "conductive surface".

Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Ver wendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und be liebiger Struktur der Elemente der Gruppen 14 und 16, der Elemente der Gruppen 13 und 15, sowie der Elemente der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zu sammensetzung und beliebiger Struktur der Elemente der Gruppen 11, 13 und 16 oder der Elemente der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985. In addition, any doped or undoped semiconductor surfaces of any thickness can also be used be used. All semiconductors can be used as pure substances or as mixtures find application. As non-limiting examples, here are carbon, Silicon, germanium, α-tin, Cu (I) - and Ag (I) -halides called any crystal structure. Also suitable are all binary compounds of any composition and be random structure of the elements of groups 14 and 16, the elements of groups 13 and 15, and of the elements of groups 15 and 16. In addition, ternary compounds of any type composition and any structure of the elements of groups 11, 13 and 16 or the Group 12, 13 and 16 elements are used. The names of the groups of the Periodic table of the elements refer to the 1985 IUPAC recommendation.

Binding of an oligonucleotide to the conductive surface

Erfindungsgemäß wird ein Oligonukleotid direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Trägerober flächenatomen oder -molekülen einer leitfähigen Trägeroberfläche der oben beschriebenen Art ver knüpft. Diese Bindung kann auf drei verschiedene Arten durchgeführt werden:
According to the invention, an oligonucleotide is linked directly or via a linker / spacer to the carrier surface atoms or molecules of a conductive carrier surface of the type described above. This binding can be done in three different ways:

a) The surface is modified so that a reactive group of molecules is accessible. This can be done by direct derivatization of the surface molecules, e.g. B. done by wet chemical or electro-chemical oxidation / reduction. So z. B. the surface of graphite electrodes can be wet-chemically provided with aldehyde or carboxylic acid groups by oxidation. Electro-chemical consists, for. B. the possibility by reduction in the presence of aryl diazonium salts the corresponding (functionalized, that is provided with a reactive group) aryl radical or by oxidation in the presence of R'CO 2 H the (functionalized) R 'radical on the graphite Coupling the electrode surface. An example of the direct modification of semiconductor surfaces is the derivatization of silicon surfaces to reactive silanols, ie silicon substrates with Si-OR "groups on the surface, where R" and R 'represent any functionalized organic residue (e.g. Alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent). Alternatively, the entire surface can be modified by the covalent attachment of a reactive group of a bifunctional linker, so that a monomolecular layer of any molecule is formed on the surface, which preferably contains a reactive group at the end. The term “bifunctional linker” means any molecule of any chain length, in particular chain lengths 2-14, with two identical (homo-bifunctional) or two different (hetero-bifunctional) reactive molecule groups.
If several different test sites are to be formed on the surface by using the methodology of photolithography, then at least one of the reactive groups of the homo- or hetero-biofunctional linker is a photo-inducible reactive group, ie a group that becomes reactive only through light irradiation of a certain or any wavelength Group. This linker is applied in such a way that the photoactivatable reactive group is available on the surface after the linker has been covalently bound. The nucleic acid oligomers are covalently attached to the surface modified in this way, whereby they themselves are modified with a reactive group via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14, preferably in the vicinity of one end of the nucleic acid oligomer. The reactive group of the oligonucleotide is a group which reacts directly (or indirectly) with the modified surface to form a covalent bond. In addition, a further reactive group can be bound to the nucleic acid oligomers in the vicinity of their second end, this reactive group in turn, as described above, bound directly or via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14 is. Furthermore, as an alternative to this further reactive group, the redox-active substance can be attached to this second end of the nucleic acid oligomer.
b) The nucleic acid oligomer to be applied to the conductive surface is over a covalently attached spacer of any composition and chain length, in particular of chain length 1-14, modified with one or more reactive groups, these being reactive groups are preferably located near one end of the nucleic acid oligomer. at The reactive groups are groups that work directly with the unmodified surface can react. Examples include: (i) thiol (HS) or disulfide (S-S) derivatized Nucleic acid oligomers of the general formula (n × HS spacer) oligo, (n × R-S-S spacer) oligo or oligo-spacer-S-S-spacer-oligo, which have a gold surface with the formation of gold Sulfur bonds react or (ii) amines that are chemically or physisorbed on platinum or attach silicon surfaces. In addition, close to the nucleic acid oligomers their second end bound another reactive group, this reactive group again, as described above, directly or via a spacer of any composition and Chain length, in particular chain length 1-14, is connected. Furthermore, the redox active substance alternative to this further reactive group, at this second end of the oligo be bound to nucleotides. In particular nucleic acid oligomers with multiple spacers bridged thiol or disulfide bridges are modified ((n × HS spacer) oligo or (n × R-S-S- Spacer oligo) have the advantage that such nucleic acid oligomers under a certain An angle against the conductive surface (angle between the surface normal and the Helix axis of a double-stranded helical nucleic acid oligomer or between the upper surface normal and the axis perpendicular to the base pairs of a double-stranded non-heli kalen nucleic acid oligomers) can be applied if the thiol or disulfide Functions to the nucleic acid oligomer spacer, from one end of the nucleic acid considered here, have an increasing or decreasing chain length.
c) As a reactive group on the probe nucleic acid oligomer, the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups of the oligonucleotide backbone, in particular end groups, are used. The phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine groups have an increased reactivity and are therefore easy to carry out typical reactions such. B. amide formation with (primary or secondary) amino or acid groups, ester formation with (primary, secondary or tertiary) alcohols or acid groups, thioester formation with (primary, secondary or tertiary) thio alcohols or acid groups or the condensation of amine and aldehyde with subsequent reduction of the resulting CH = N bond to the CH 2 -NH bond. In this case, the coupling group required for covalent attachment to the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group is part of the surface derivatization with a (monomolecular) layer of any molecular length, as under a) in be described in this section, or the phosphoric acid, sugar-C-3-hydroxy, carboxylic acid or amine group can react directly with the unmodified surface, as described under b) in this section. In addition, a further reactive group can be bound to the oligonucleotides in the vicinity of their second end, this reactive group in turn, as described above, being attached directly or via a spacer of any composition and chain length, in particular chain length 1-14. Furthermore, as an alternative to this further reactive group, the redox-active substance can be attached to this second end of the nucleic acid oligomer.

Die Bindung des Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche kann alternativ vor oder nach der An bindung der redoxaktiven Substanz an das Oligonukleotid bzw. vor oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der redoxaktiven Substanz erfolgen. Die Bindung des bereits modifizierten Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche, d. h. die Bindung an die Oberfläche nach der Anbindung der redoxaktiven Substanz an das Oligonukleotid bzw. nach der Anbindung des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der redoxaktiven Substanz, erfolgt ebenfalls wie unter a) bis c) (Abschnitt "Bindung eines Oligonukleotids an die leit fähige Oberfläche") beschrieben.The binding of the oligonucleotide to the conductive surface can alternatively before or after the An binding of the redox-active substance to the oligonucleotide or before or after binding the a reactive group provided spacers for binding the redox-active substance. The Binding of the already modified oligonucleotide to the conductive surface, i.e. H. the bond to the surface after the attachment of the redox-active substance to the oligonucleotide or after the Connection of the spacer provided with a reactive group to bind the redox-active Substance, is also carried out as in a) to c) (section "binding an oligonucleotide to the leader capable surface ").

Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Anbindung der Einzelstrang-Oligonukleotide an die Oberfläche darauf geachtet werden, daß zwischen den einzelnen Oligonukleotiden ein genügend großer Abstand verbleibt, um den für eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid nötigen Freiraum zur Verfügung zu stellen. Dazu bieten sich unter anderem zwei verschiedene Vorgehens weisen an:
When producing the test sites, when the single-strand oligonucleotides are connected to the surface, care must be taken to ensure that there is a sufficient distance between the individual oligonucleotides to provide the space required for hybridization with the target oligonucleotide. There are two different ways to do this:

1. Production of a modified carrier surface by binding a hybridized oligo nucleotides, i.e. a carrier surface derivatization with hybridized probe oligonucleotide instead of with single stranded probe oligonucleotide. The oligo used for hybridization nucleotide strand is unmodified (the surface connection is carried out as under a) - c) im Section "binding of an oligonucleotide to the conductive surface" described). Subsequently the hybridized oligonucleotide double strand is thermally dehybridized, whereby a single strand oligonucleotide modified support surface with a larger distance between the sample oligonucleotides is produced.
2. Production of a modified carrier surface by connecting a single strand or Double-stranded oligonucleotide, being a suitable one during the carrier surface derivatization monofunctional linker is added, in addition to the single-stranded or double-stranded oligo nucleotide is also bound to the surface (the surface binding is carried out as described under a) -c) in the section "Binding of an oligonucleotide to the conductive surface"). According to the monofunctional linker has a chain length that the chain length of Spacers between the support surface and the oligonucleotide is identical or by a maximum of eight chains atoms deviate. When using double-stranded oligonucleotide for the carrier surface Derivatization is carried out after the binding of the double-stranded oligonucleotide and the linker to the The carrier surface of the hybridized oligonucleotide double strand is thermally dehybridized as above described under 1. By connecting a linker to the surface at the same time, the Distance between the single or double strand nuclei also bound to the surface acid oligomers enlarged. In case of using double stranded nucleic acid oligomer This effect is reinforced by the subsequent thermal dehybridization.

Method for the electrochemical detection of nucleic acid oligomer hybrids

Vorteilhafterweise werden gemäß dem Verfahren zur elektrochemischen Detektion mehrere Sonden-Oligonukleotide unterschiedlicher Sequenz, idealerweise alle nötigen Kombinationen des Nukleinsäure-Oligomers, auf einem Oligomer- oder DNA-Chip aufgebracht, um die Sequenz eines beliebigen Target-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA sicher zu detektieren bzw. um Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer leitfähigen Trägeroberfläche die Trägeroberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Oligonukleotiden bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann aber der DNA-Chip auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Oligonukleotide werden Nukleinsäure-Oligomere (DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 50, bevorzugt der Länge 5 bis 30, besonders bevorzugt der Länge 7 bis 25 verwendet. Erfindungs gemäß wird an die Sonden-Oligonukleotide entweder vor oder nach deren Bindung an die leitfähige Oberfläche eine redoxaktive Substanz gebunden.According to the method for electrochemical detection, several are advantageously Probe oligonucleotides of different sequences, ideally all necessary combinations of the Nucleic acid oligomers, applied on an oligomer or DNA chip to the sequence of a any target oligomer or a (fragmented) target DNA safely to detect or Detect mutations in the target and demonstrate them in a sequence-specific manner. For this, be on a conductive support surface, the support surface atoms or molecules of a defined area (a test site) with DNA / RNA / PNA oligonucleotides of known but any sequence, such as described above, linked. In a most general embodiment, however, the DNA chip can also be derivatized with a single probe oligonucleotide. As probe oligonucleotides nucleic acid oligomers (DNA, RNA or PNA fragments) with a base length of 3 to 50, preferably the length 5 to 30, particularly preferably the length 7 to 25 used. Fiction according to the probe oligonucleotides either before or after their binding to the conductive Surface bound a redox-active substance.

Erfolgt die Modifikation der Sonden-Oligonukleotide vor der Bindung an die leitfähige Oberfläche, so werden die bereits modifizierten Sonden-Oligonukleotide wie oben beschrieben an die leitfähige Oberfläche gebunden. Alternativ werden die nicht modifizierten, an die leitfähige Oberfläche gebun denen Sonden-Oligonukleotide am zweiten, freien Ende der Oligonukleotidkette direkt oder indirekt über einen Spacer mit einer redoxaktive Substanz modifiziert.If the probe oligonucleotides are modified before binding to the conductive surface, then the already modified probe oligonucleotides are transferred to the conductive as described above Surface bound. Alternatively, the unmodified ones are bonded to the conductive surface the probe oligonucleotides at the second, free end of the oligonucleotide chain directly or indirectly modified with a redox-active substance via a spacer.

In beiden Fällen entsteht ein Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo- Spacer-Redox (Fig. 3). Die elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Trägeroberfläche und dem über ein Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten redoxaktiven Substanz ("Redox") in der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox ist schwach oder gar nicht vorhanden. Die Verbrückungen können natürlich auch ohne Spacer oder mit nur einem Spacer (Elek-ss-oligo- Spacer-Redox bzw. Elek-Spacer-ss-oligo-Redox) durchgeführt werden.In both cases, a surface hybrid of the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer redox is formed ( FIG. 3). The electrical communication between the (conductive) support surface and the redox-active substance (“redox”) bridged by a single-strand oligonucleotide in the general structure elek-spacer-ss-oligo-spacer redox is weak or nonexistent. The bridges can of course also be carried out without a spacer or with only one spacer (Elek-ss-oligo-Spacer-Redox or Elek-Spacer-ss-oligo-Redox).

In einem nächsten Schritt werden die Test-Sites mit der zu untersuchenden Oligonukleotid-Lösung (Target) in Kontakt gebracht. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Oligonukleotid-Stränge enthält, die zu den an die leitfähige Oberfläche gebundenen Sonden-Oligo nukleotiden komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. Im Falle der Hybridisierung zwischen Sonden- und Target-Oligonukleotid kommt es zu einer verstärkten Leit fähigkeit zwischen der Trägeroberfläche und der redoxaktiven Substanz, da diese nunmehr über das aus einem Doppelstrang bestehende Oligonukleotid verbrückt sind (in Fig. 3 an einem Beispiel der Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox schematisch gezeigt).In a next step, the test sites are brought into contact with the oligonucleotide solution to be examined (target). Hybridization only occurs in the case in which the solution contains oligonucleotide strands which are complementary to the probe oligo nucleotides bound to the conductive surface, or are at least complementary in a wide range. In the case of hybridization between probe and target oligonucleotide, there is an increased conductivity between the support surface and the redox-active substance, since these are now bridged via the oligonucleotide consisting of a double strand (in FIG. 3 using an example of the elec-spacer -ss-oligo-spacer redox shown schematically).

Durch die Veränderung der elektrischen Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Trägeroberfläche und der redoxaktiven Substanz aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Oligonukleotid und dem dazu komplementären Oligonukleotid-Strang (Target) kann somit ein sequenzspezifisches Hybridi sierungsereignis durch elektrochemische Verfahren wie z. B. Cyclovoltametrie, Amperometrie oder Leitfähigkeitsmessungen detektiert werden.By changing the electrical communication between the (conductive) carrier surface and the redox active substance due to hybridization of probe oligonucleotide and the complementary oligonucleotide strand (target) can thus be a sequence-specific hybrid tion event by electrochemical processes such. B. cyclic voltammetry, amperometry or Conductivity measurements can be detected.

In der vorliegenden Erfindung wird eine redoxaktive Substanz verwendet, die Bereiche mit einem überwiegend planaren, in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbital-System aufweist, wie z. B. das PQQ des Beispiels 1 (vgl. Fig. 3), oder die Chinone der Formel 2-4. In diesem Fall wird der Spacer zwischen Nukleinsäure-Oligomer und der redoxaktiven Substanz so gewählt, daß sich die Ebene der π-Orbitale der redoxaktiven Substanz parallel zu den p-π-Orbitalen des an die redoxaktive Sub stanz angrenzenden Basenpaars des mit Komplementärstrang hybridisierten Nukleinsäure-Oligo mers anordnen kann. Diese räumliche Anordnung von redoxaktiver Substanz mit teilweise planarem in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbitalen erweist sich für die elektrische Leitfähigkeit der Doppel strang-Nukleinsäure-Oligomere als besonders günstig.In the present invention, a redox-active substance is used which has regions with a predominantly planar, p-π-orbital system which is extended in one plane, such as e.g. B. the PQQ of Example 1 (see FIG. 3), or the quinones of the formula 2-4. In this case, the spacer between the nucleic acid oligomer and the redox-active substance is selected such that the level of the π orbitals of the redox-active substance is parallel to the p-π orbitals of the base pair adjacent to the redox-active substance of the nucleic acid hybridized with the complementary strand. Can arrange oligo mers. This spatial arrangement of redox-active substance with partially planar p-π orbitals extended in one plane proves to be particularly favorable for the electrical conductivity of the double-stranded nucleic acid oligomers.

Bei der Cyclovoltametrie wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear ver ändert. Ausgehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet, wird das Potential solange verändert bis die redoxaktive Substanz oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom, einen Maximalstrom (Peak) und dann einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Ver halten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.In cyclic voltammetry, the potential of a stationary working electrode is linearly ver changes. Starting from a potential where there is no electrooxidation or reduction the potential is changed until the redox-active substance is oxidized or reduced (i.e. electricity flows). After going through the oxidation or reduction process in the current / voltage curve an initially rising current, a maximum current (peak) and then a gradually decreasing Generates electricity, the direction of the potential feed is reversed. In the return the Ver keep the products of electro-oxidation or reduction recorded.

Eine alternative elektrische Detektionsmethode, die Amperometrie, wird dadurch ermöglicht, daß die redoxaktive Substanz durch Anlegen eines geeigneten, konstant gehaltenen Elektrodenpotentials zwar elektrooxidiert (elektroreduziert) wird, die Rereduktion (Reoxidation) der redoxaktiven Substanz in den ursprünglichen Zustand aber nicht durch Änderung des Elektrodenpotentials erreicht wird, wie in der Cyclovoltametrie, sondern durch ein der Targetlösung zugesetztes geeignetes Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), wodurch der Stromkreis des Gesamtsystems geschlossen wird. Solange Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) vorhanden ist bzw. solange verbrauchtes Reduktions mittel (Oxidationsmittel) an der Gegenelektrode rereduziert (reoxidiert) wird, fließt Strom, der amperometrisch detektiert werden kann und der proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse ist.An alternative electrical detection method, amperometry, is made possible by the fact that redox-active substance by applying a suitable, constant electrode potential Although it is electro-oxidized (electro-reduced), the re-reduction (reoxidation) of the redox-active substance in the original state but is not achieved by changing the electrode potential, as in cyclic voltammetry, but with a suitable reducing agent added to the target solution (Oxidizing agent), which closes the circuit of the entire system. As long as reducing agent (oxidizing agent) is present or as long as the used reducing agent medium (oxidizing agent) is reduced (reoxidized) at the counter electrode, current flows can be detected amperometrically and which is proportional to the number of hybridization events is.

Brief description of the drawings

Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigenThe invention will be described below using an exemplary embodiment in connection with the Drawings are explained in more detail. Show it

Fig. 1 Schematische Darstellung des Sanger-Verfahrens der Oligonukleotid- Sequenzierung; Fig. 1 Schematic representation of the Sanger method of sequencing oligonucleotide;

Fig. 2 Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Sequenzierung durch Hybridisierung auf einem Chip; Fig. 2 Schematic representation of the oligonucleotide sequencing by hybridization on a chip;

Fig. 3 Schematische Darstellung des Oberflächen-Hybrids der allgemeinen Struktur Elek- Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox mit einem 12 Bp Sonden- Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' (links) und Au-S-ss-oligo-PQQ im hybridisierten Zustand als Ausführungsbeispiel einer Elek-Spacer-ss-oligo- Spacer-Redox, wobei nur ein Teil des Sonden-Oligonukleotids mit hybridisierten Komplementärstrang gezeigt ist (rechts) und die Anbindung des Oligonukleotids an die Oberfläche über einen -S-CH₂CH₂- Spacer sowie die Anbindung der redox aktiven Substanz PQQ über den Spacer -CH₂-CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH- er folgte; Fig. 3 Schematic diagram of the surface hybrid having the general structure elec- spacer-ss-oligo-spacer-redox probe with a 12 bp oligonucleotide of the exemplary sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 '(left) and Au-S-ss- oligo-PQQ in the hybridized state as an embodiment of an electr-spacer-ss-oligo-spacer redox, only a part of the probe oligonucleotide with hybridized complementary strand being shown (right) and the attachment of the oligonucleotide to the surface via an -S- CH ₂ CH ₂ spacer and the connection of the redox active substance PQQ via the spacer -CH ₂ -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH- followed;

Fig. 4 Cyclovoltagramm einer Test-Site aus Au-S-ss-oligo-PQQ (gepunktet) im Vergleich zu einer identischen Test-Site mit vollständig hybridisiertem Target (Au-S-ds-oligo-PQQ, durchgezogene Linie); Fig. 4 Cyclic voltagram of a test site made of Au-S-ss-oligo-PQQ (dotted) compared to an identical test site with a fully hybridized target (Au-S-ds-oligo-PQQ, solid line);

Fig. 5 Cyclovoltagramm einer Test-Site mit vollständig hybridisiertem Target (Au-S-ds- oligo-PQQ) (durchgezogene Linie) im Vergleich zu einer Test-Site mit hybridi siertem Target, das 2 Basenpaar Mismatches aufweist (Au-S-ds-oligo-PQQ mit 2 Bp Mismatches, gestrichelt). Fig. 5 Cyclic voltagram of a test site with a fully hybridized target (Au-S-ds-oligo-PQQ) (solid line) compared to a test site with hybridized target, which has 2 base pairs of mismatches (Au-S-ds -oligo-PQQ with 2 bp mismatches, dashed).

Ways of Carrying Out the Invention

Eine exemplarische Test-Site mit hybridisiertem Target (Au-S-ds-oligo-PQQ) der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox ist in Fig. 3 dargestellt. In dem Beispiel der Fig. 3 ist die Trägeroberfläche eine Gold-Elektrode. Die Verbindung zwischen Gold-Elektrode und Sonden- Oligonukleotid wurde mit dem Linker (HO-(CH₂)₂-S)₂ aufgebaut, der mit der endständigen Phosphat gruppe am 3' Ende zu P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert wurde und nach homolytischer Spaltung der S-S Bindung an der Gold-Oberfläche je eine Au-S Bindung bewirkte, womit 2-Hydroxy-mercaptoethanol und Mercaptoethanol-verbrücktes Oligonukleotid auf der Oberfläche koadsorbiert wurde. Die redoxaktive Substanz im Beispiel der Fig. 3 ist tricarboxylisches Pyrrolo-Chinolin-Chinon (PQQ), wobei eine der drei Carbonsäurefunktionen des PQQ (im Beispiel die C-7-CO₂H-Funktion) zur kovalenten An bindung des PQQ an das Sonden-Oligonukleotid verwendet wurde (Amidbildung unter Wasser abspaltung mit der terminalen Aminofunktion des an die C-5-Position des 5'-Thymins ange bundenen -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ Spacers). Sowohl freies, unmodifiziertes PQQ als auch über einen kurzen Spacer der Kettenlänge 1-6, wie z. B. -S-(CH₂)₂-NH-, oder über (modifiziertes) Doppelstrang-Oligonukleotid mit der Trägeroberfläche verbrücktes PQQ wird, z. B. in HEPES Puffer mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB (siehe Abkürzungen), im Potentialbereich 0,7 V ≧ ϕ ≧ 0,0 V, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode, selektiv reduziert und reoxidiert.An exemplary test site with hybridized target (Au-S-ds-oligo-PQQ) of the general structure Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox is shown in FIG. 3. In the example of FIG. 3, the carrier surface is a gold electrode. The connection between the gold electrode and probe oligonucleotide was established with the linker (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ , which with the terminal phosphate group at the 3 'end to PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- ( CH ₂ ) ₂ -OH was esterified and after homolytic cleavage of the SS bond on the gold surface each caused an Au-S bond, with which 2-hydroxy-mercaptoethanol and mercaptoethanol-bridged oligonucleotide was adsorbed on the surface. The redox-active substance in the example of FIG. 3 is tricarboxylic pyrrolo-quinoline quinone (PQQ), one of the three carboxylic acid functions of the PQQ (in the example the C-7-CO ₂ H function) for covalently linking the PQQ to the probes -Oligonucleotide was used (amide formation with elimination of water with the terminal amino function of the -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ spacer attached to the C-5 position of the 5'-thymine). Both free, unmodified PQQ and a short spacer of chain length 1-6, such as. B. -S- (CH ₂ ) ₂ -NH-, or via (modified) double-stranded oligonucleotide PQQ bridged to the support surface, e.g. B. in HEPES buffer with 0.7 molar addition of TEATFB (see abbreviations), in the potential range 0.7 V ≧ ϕ ≧ 0.0 V, measured against normal hydrogen electrode, selectively reduced and reoxidized.

Die elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Trägeroberfläche und dem über Einzel strang-Oligonukleotid verbrückten Redoxpaar in der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo- Spacer-Redox ist schwach oder gar nicht vorhanden. Für die exemplarische Test-Site Au-S-ss- oligo-PQQ (mit 12-Bp Sonden-Oligonukleotiden) ist dies anhand der Cyclovoltametrie (Fig. 4) ge zeigt. Ohne an eine theoretische Beschreibung gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß die negativen Ladungen des Phosphatgerüsts eine gegenseitig Abstoßung der Oligonukleotid- Einzelstränge bedingen und so einen Aufbau der -Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox Kette (in Richtung Helixachse) unter einem Winkel Φ < 70° zur Normalen der Trägeroberfläche ("stehende Röhren") erzwingen. Die (hybridisierte) Test-Site Au-S-ds-oligo-PQQ der Fig. 3 weist einen Aufbau mit Φ = 30° auf. Aufgrund der Länge der -Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox Kette (z. B. ca. 40 Å Länge eines 12-Basenpaar-Oligonukleotids; die Spacer und das angebundene PQQ sind rund 10 Å lang) ent steht bei Φ < 70° zwischen Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz ein Abstand von < 17 Å. Dadurch kann ein direkter Elektron- oder Lochtransfer zwischen Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz ausgeschlossen werden. Durch Behandlung der Test-Site(s) mit einer zu untersuchenden Oligonukleotid-Lösung, kommt es, im Falle der Hybridisierung zwischen Sonde und Target zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Trägeroberfläche und dem über das Doppelstrang-Oligo nukleotid verbrückten Redoxpaar. Die Änderung der Leitfähigkeit äußert sich cyclovoltammetrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz (Fig. 4). Damit ist es möglich, die sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Sonden-Oligonukleotiden durch elektrochemische Verfahren wie z. B. cyclische Voltametrie zu detektieren.The electrical communication between the (conductive) support surface and the redox pair bridged by single-strand oligonucleotide in the general structure elek-spacer-ds-oligo-spacer-redox is weak or nonexistent. For the exemplary test site Au-S-ss- oligo-PQQ (with 12 bp probe oligonucleotides), this is shown using cyclic voltammetry ( FIG. 4). Without wishing to be bound by a theoretical description, it is assumed that the negative charges of the phosphate skeleton cause mutual repulsion of the oligonucleotide single strands and thus a structure of the spacer-ds-oligo-spacer redox chain (in the direction of the helix axis) under one Force an angle Φ <70 ° to the normal of the support surface ("standing tubes"). The (hybridized) test site Au-S-ds-oligo-PQQ of FIG. 3 has a structure with Φ = 30 °. Due to the length of the spacer-ds-oligo-spacer redox chain (e.g. approx. 40 Å length of a 12-base pair oligonucleotide; the spacers and the attached PQQ are approx. 10 Å long), this results in Φ <70 ° a distance of <17 Å between the carrier surface and the redox-active substance. This means that direct electron or hole transfer between the carrier surface and the redox-active substance can be excluded. By treating the test site (s) with an oligonucleotide solution to be examined, in the case of hybridization between probe and target, there is an increased conductivity between the support surface and the redox couple bridged by the double-stranded oligo nucleotide. The change in conductivity manifests itself in cyclic voltammetry in a clear current flow between the carrier surface and the redox-active substance ( FIG. 4). This makes it possible to sequence-specific hybridization of the target with the probe oligonucleotides by electrochemical methods such as. B. to detect cyclic voltammetry.

Daneben können fehlerhafte Basenpaarungen (Basenpaar Mismatches) durch eine geänderte cyclovoltammetrische Charakteristik erkannt werden (Fig. 5). Ein Mismatch äußert sich in einem größeren Potentialabstand zwischen den Strommaxima der Elektroreduktion und der Elektro reoxidation (Umkehrung der Elektroreduktion bei umgekehrter Potentialvorschubrichtung) bzw. der Elektrooxidation und Elektrorereduktion in einem cyclovoltammetrisch reversiblen Elektronen übertragungsprozess zwischen der elektrisch leitenden Trägeroberfläche und der redoxaktiven Sub stanz. Dieser Umstand wirkt sich vor allem in der amperometrischen Detektion günstig aus, da dort der Strom bei einem Potential getestet werden kann, bei dem zwar das perfekt hybridisierende Oligonukleotid-Target signifikant Strom liefert, nicht aber das fehlerhaft gepaarte Oligonukleotid- Target. Im Beispiel der Fig. 5 ist dies bei einem Potential E-E₀ von ca. 0,03 V möglich.In addition, incorrect base pairings (base pair mismatches) can be recognized by a changed cyclic voltammetric characteristic ( FIG. 5). A mismatch manifests itself in a larger potential distance between the current maxima of the electrical reduction and the electro reoxidation (reversal of the electrical reduction with reversed direction of potential feed) or the electro oxidation and electrical reduction in a cyclic voltammetrically reversible electron transfer process between the electrically conductive carrier surface and the redox-active substance. This fact has a particularly favorable effect in amperometric detection, since the current can be tested there at a potential at which the perfectly hybridizing oligonucleotide target delivers significant current, but not the incorrectly paired oligonucleotide target. In the example in FIG. 5, this is possible at a potential EE ₀ of approximately 0.03 V.

example 1 Preparation of the Au-S-ds-oligo-PQQ oligonucleotide electrode

Die Herstellung von Au-S- ds-oligo-PQQ gliedert sich in 4 Teilabschnitte, nämlich Darstellung der Trägeroberfläche, Hybri disierung des Sonden-Oligonukleotids mit dem komplementären Doppelstrang (Hybridi sierungsschritt), Derivatisierung der Trägeroberfläche mit dem Doppelstrang-Oligonukleotid (Inkuba tionsschritt) und Anbindung der redoxaktiven Substanz (Redoxschritt). The production of Au-S- ds-oligo-PQQ is divided into 4 sections, namely representation of the carrier surface, hybri the probe oligonucleotide with the complementary double strand (hybridi step), derivatization of the support surface with the double-stranded oligonucleotide (Inkuba tion step) and connection of the redox-active substance (redox step).

Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wurde in einer elektrischen Ent ladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon-Ionenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99.99%) in einer Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. An schließend wurde der Gold-Film mit 30% H₂O₂/70% H₂SO₄ von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der Trägeroberfläche mit bi destilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte Trägeroberfläche eine vorher bereitete 1 × 10^-4 molare Lösung des (modifizierten) Doppelstrang-Oligonukleotids aufgetragen, so daß die komplette Trägeroberfläche benetzt wird (Inkubationsschritt, siehe auch unten).The carrier material for the covalent attachment of the double-strand oligonucleotides is formed by an approximately 100 nm thin gold film on mica (muscovite platelets). For this purpose, freshly split mica was cleaned with an argon ion plasma in an electrical discharge chamber and gold (99.99%) was applied in a layer thickness of approx. 100 nm by electrical discharge. The gold film was then freed of surface impurities with 30% H ₂ O ₂ /70% H ₂ SO ₄ (oxidation of organic deposits) and immersed in ethanol for about 20 minutes in order to displace oxygen adsorbed on the surface. After rinsing the carrier surface with bi-distilled water, a previously prepared 1 × 10 ^-4 molar solution of the (modified) double-stranded oligonucleotide is applied to the horizontally stored carrier surface, so that the entire carrier surface is wetted (incubation step, see also below).

Zur Bereitung der ds-Oligonukleotid Lösung wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang- Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist die endständige Base des Oligonukleotids, Thymin, am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ modifiziert. Eine 2 × 10^-4 molare Lösung dieses Oligonukleotids im Hybridisierungspuffer (10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde mit einer 2 × 10^-4 molaren Lösung des (unmodifizierten) komplementären Strang im Hybridisierungspuffer bei Raumtemperatur für ca. 2 h hybridisiert (Hybridisierungsschritt). Während einer Reaktionszeit von ca. 12-24 h wurde der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch ge spalten. Dabei bildet der Spacer mit den Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ds-Oligonukleotids und des 2-Hydroxy-mer captoethanols kommt (Inkubationsschritt).To prepare the ds-oligonucleotide solution, a double-modified 12 bp single-stranded oligonucleotide of the sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'was used, which at the phosphate group of the 3' end with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ to the PO - (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH is esterified. At the 5 'end, the terminal base of the oligonucleotide, thymine, at the C-5 carbon is modified with -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ -NH ₂ . A 2 × 10 ^-4 molar solution of this oligonucleotide in the hybridization buffer (10 mmol / l Tris, 1 mmol / l EDTA, pH 7.5 with 0.7 molar addition of TEATFB, see abbreviations) was mixed with a 2 × 10 ^-4 molar solution of the (unmodified ) hybridized complementary strand in the hybridization buffer at room temperature for about 2 h (hybridization step). During a reaction time of approximately 12-24 h, the disulfide spacer PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH of the oligonucleotide was cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ds-oligonucleotide and the 2-hydroxy-mer captoethanol (incubation step).

Die so mit einer dichten (1 : 1) Monolayer aus ds-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 3 × 10^-3 molarem Chinon PQQ, 10^-2 molarem EDC und 10^-2 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1 h bindet der -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂- NH₂ Spacer das PQQ kovalent an (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und einer Säurefunktion des PQQ, Redoxschritt). The gold electrode modified with a dense (1: 1) monolayer of ds-oligonucleotide and 2-hydroxy-mercaptoethanol was washed with bidistilled water and then with a solution of 3 × 10 ^-3 molar quinone PQQ, 10 ^-2 molar EDC and 10 ^-2 molar sulfo-NHS wetted in HEPES buffer. After a reaction time of approx. 1 h, the -CH = CH-CO-NH-CH ₂ -CH ₂ - NH ₂ spacer covalently binds the PQQ (amide formation between the amino group of the spacer and an acid function of the PQQ, redox step).

Die Aufklärung der Oberflächenbeschaffenheit mit XPS (X-Ray Photoelektronenspektroskopie) er gab eine maximal dicht gepackte Monolayer aus 1 : 1 koadsorbiertem ds-Oligonukleotid und 2- Hydroxy-mercaptoethanol (4.7 × 10¹² ds-Oligonukleotide/cm²), wobei die lange Achse (Richtung der Helixachse) der ds-Oligonukleotide mit der Flächennormalen der Goldoberfläche einen Winkel von Φ ≈ 30° bildet.The clarification of the surface quality with XPS (X-Ray photoelectron spectroscopy) gave a maximally densely packed monolayer of 1: 1 adsorbed ds-oligonucleotide and 2-hydroxy-mercaptoethanol (4.7 × 10 ¹² ds-oligonucleotides / cm ² ), the long axis (Direction of the helix axis) of the ds-oligonucleotides forms an angle of Φ ≈ 30 ° with the surface normal of the gold surface.

Example 2 Preparation of the Au-S-ss-oligo-PQQ oligonucleotide electrode

Analog zur Darstellung des Systems Au-S-ds-oligo-PQQ wird die Trägeroberfläche mit modifiziertem Einzelstrang-Oligo nukleotid derivatisiert, wobei lediglich auf die Hybridisierung des modifizierten Oligonukleotids der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' mit seinem komplementären Strang verzichtet wurde und im In kubationsschritt nur das doppelt modifizierte 12 Bp Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid (siehe Bei spiel 1) als 1 × 10^-4 molare Lösung in Wasser und in Gegenwart von 10^-2 molarem Tris, 10^-3 molarem EDTA und 0.7 molarem TEATFB (oder 1 molarem NaCl) bei pH 7.5 verwendet wurde. Der Redoxschritt wurde, wie in Beispiel 1 angegeben, durchgeführt.Analogous to the representation of the Au-S-ds-oligo-PQQ system, the support surface is derivatized with modified single-strand oligo nucleotide, only hybridization of the modified oligonucleotide of the sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'with its complementary strand being dispensed with and im In the cubation step, only the double modified 12 bp single-stranded probe oligonucleotide (see example 1) as a 1 × 10 ^-4 molar solution in water and in the presence of 10 ^-2 molar Tris, 10 ^-3 molar EDTA and 0.7 molar TEATFB (or 1 molar NaCl) at pH 7.5 was used. The redox step was carried out as indicated in Example 1.

Example 3 Production of the oligonucleotide electrode Au-S-ds-oligo-PQQ with 2-bp mismatches

Die Herstellung einer Trägeroberfläche derivatisiert mit modifiziertem Doppelstrang-Oligonukleotid wurde analog zur Darstellung des Systems Au-S-ds-oligo-PQQ durchgeführt, wobei lediglich bei der Hybridisierung des modifizierten Oligonukleotids der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' ein kom plementärer Strang verwendet wurde (Sequenz: 5'-ATCAGATTTCGT-3'), bei dem die eigentlich komplementären Basen Nr. 6 und 7 (vom 5'-Ende gezählt) von C nach A bzw. von C nach T modifi ziert wurden, um so zwei Basenpaar Mismatches einzuführen.The Production of a carrier surface derivatized with modified double-strand oligonucleotide was carried out analogously to the representation of the system Au-S-ds-oligo-PQQ, with only the Hybridization of the modified oligonucleotide of the sequence 5'-TAGTCGGAAGCA-3 'a com complementary strand was used (sequence: 5'-ATCAGATTTCGT-3 '), in which the actually complementary bases nos. 6 and 7 (counted from the 5 'end) from C to A and from C to T modifi were decorated to introduce two base pairs of mismatches.

Example 4 Preparation of an Au-S-ss-oligo-PQQ Oligonucleotide Electrode with Increased Inter-Oligo nucleotide distance

Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Derivatisierung der Trägerober fläche mit Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid darauf geachtet werden, daß zwischen den ange bundenen Einzelsträngen genügend Platz verbleibt, um eine Hybridisierung mit dem Target-Oligo nukleotid zu ermöglichen. Dazu bieten sich drei verschiedene Vorgehensweisen an: (a) Herstellung einer Au-S-ds-oligo-PQQ Elektrode wie in Beispiel 1 beschrieben mit anschließender thermischer Dehybridisierung der Doppelstränge bei Temperaturen von T < 40°C. (b) Herstellung einer Au-ss- oligo-PQQ Elektrode wie unter Beispiel 2 beschrieben, aber im Inkubationsschritt zur Derivatisierung der Goldoberfläche mit (doppelt derivatisiertem) Einzelstrang-Oligonukleotid wird 2-Hydroxy-mercaptoethanol oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge 10^-5 bis 10^-1 molar zugesetzt (je nach gewünschtem Inter-Oligonukleotid-Abstand), das gemeinsam mit dem Einzel strang Oligonukleotid an die Goldoberfläche koadsorbiert. (c) Herstellung einer Au-ss-oligo-PQQ Elektrode wie unter Beispiel 2 beschrieben, aber unter Weglassen des 0.7 molaren Zusatzes an Elektrolyten (im Beispiel TEATFB) im Inkubationsschritt zur Derivatisierung der Goldoberfläche mit (doppelt derivatisiertem) Einzelstrang-Oligonukleotid. Die Phosphatgruppen und Basen-Sickstoff atome des Oligonukleotids sind durch die Abwesenheit des Salzes elektrostatisch nicht abgeschirmt und wechselwirken stark mit der Goldoberfläche. Dadurch kommt es zu einer flachen Anlagerung der Oligonukleotide auf der Elektrodenoberfläche (Φ < 60°) und es werden pro Flächeneinheit deutlich weniger Oligonukleotide gebunden. Anschließend können die Oligonukleotide wieder in die gewünschte Position gebracht werden, indem in einem 2. Inkubationsschritt (vor oder nach An bringen des PQQ) 2-Hydroxy-mercaptoethanol oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge kovalent an die noch freien Oberflächen-Goldatome angebunden wird. Dazu wird die weniger dicht mit Einzelstrang-Oligonukleotid belegte Elektrode vor oder nach Modifikation mit PQQ (Au-S-ss-oligo bzw. Au-S-ss-oligo-PQQ) mit einer ca. 5 × 10^-2 molaren Lösung des 2- Hydroxy-mercaptoethanols oder eines anderen Thiol- oder Disulfid-Linkers geeigneter Kettenlänge in Ethanol oder HEPES Puffer (bzw. einem Gemisch daraus, abhängig von der Löslichkeit des Thiols) benetzt und 2-24 h inkubiert.In the preparation of the test sites, when derivatizing the support surface with single-stranded probe oligonucleotide, care must be taken to ensure that there is sufficient space between the attached single strands to enable hybridization with the target oligonucleotide. There are three different procedures for this: (a) Production of an Au-S-ds-oligo-PQQ electrode as described in Example 1 with subsequent thermal dehybridization of the double strands at temperatures of T <40 ° C. (b) Preparation of an Au-ss-oligo-PQQ electrode as described in Example 2, but in the incubation step to derivatize the gold surface with (double-derivatized) single-strand oligonucleotide, 2-hydroxy-mercaptoethanol or another thiol or disulfide linker becomes more suitable Chain length 10 ^-5 to 10 ^-1 molar added (depending on the desired inter-oligonucleotide distance), which together with the single strand of oligonucleotide co-adsorbs to the gold surface. (c) Preparation of an Au-ss-oligo-PQQ electrode as described in Example 2, but with the omission of the 0.7 molar addition of electrolytes (in the example TEATFB) in the incubation step to derivatize the gold surface with (double-derivatized) single-strand oligonucleotide. The phosphate groups and base nitrogen atoms of the oligonucleotide are not electrostatically shielded by the absence of the salt and interact strongly with the gold surface. This leads to a flat accumulation of the oligonucleotides on the electrode surface (Φ <60 °) and significantly fewer oligonucleotides are bound per unit area. The oligonucleotides can then be brought back into the desired position by covalently attaching 2-hydroxy-mercaptoethanol or another thiol or disulfide linker of suitable chain length to the free surface in a second incubation step (before or after attaching the PQQ). Gold atoms is tied up. For this purpose, the electrode, which is less densely populated with single-strand oligonucleotide, is modified with an approx. 5 × 10 ^-2 molar solution of the 2nd - Hydroxy-mercaptoethanol or another thiol or disulfide linker of suitable chain length in ethanol or HEPES buffer (or a mixture thereof, depending on the solubility of the thiol) wetted and incubated for 2-24 h.

Example 5 Carrying out the cyclic voltammetric measurements

Die cyclovoltammetrischen Messungen wurden mit einem Computer-kontrolliertem Bipotentiostaten (CH Instruments, Model 832) bei Raumtemperatur in einer Standard Zelle mit 3-Elektroden-Anordung vermessen. Die modi fizierte Goldelektrode wurde als Arbeitselektrode verwendet, als Hilfselektrode (Gegenelektrode) diente ein Platindraht und als Referenzelektrode zur Potentialbestimmung wurde eine über eine Luggin Kapillare vom Probenraum abgetrennte Ag/AgCl-Elektrode mit interner gesättigter KCl Lö sung verwendet. Als Elektrolyt diente 0.7 molares TEATFB oder 1 molares NaCl. Ein Cyclovol tagramm der Au-S-ds-oligo-PQQ Elektrode im Vergleich zu einer Au-S-ss-oligo-PQQ Elektrode ist in Fig. 4 gezeigt, die Auswirkung der 2 Bp Mismatches auf das Cyclovoltagramm der Au-S-ds-oligo- PQQ Elektrode ist in Abb. 5 dargestellt. Die Potentiale sind jeweils als E-E₀, also relativ zum Halbstufenpotential angegeben. The cyclic voltammetric measurements were carried out using a computer-controlled bipotentiostat (CH Instruments, Model 832) at room temperature in a standard cell with a 3-electrode arrangement. The modified gold electrode was used as the working electrode, a platinum wire was used as the auxiliary electrode (counter electrode) and an Ag / AgCl electrode with an internally saturated KCl solution was separated from the sample space via a Luggin capillary as a reference electrode. 0.7 molar TEATFB or 1 molar NaCl was used as the electrolyte. A cyclovol tagram of the Au-S-ds-oligo-PQQ electrode compared to an Au-S-ss-oligo-PQQ electrode is shown in Fig. 4, the effect of the 2 bp mismatches on the cyclovoltagram of the Au-S-ds -oligo- PQQ electrode is shown in Fig. 5. The potentials are given as EE ₀ , i.e. relative to the half-wave potential.

Aus Fig. 4 ist ein deutlich erhöhter Stromfluß bei Vorliegen eines Doppelstrang-Oligonukleotids gegenüber der nicht hybridisierten Form zu erkennen. Dadurch können sequenzspezifische Hybridi sierungsereignisse detektiert werden. Aus Fig. 5 wird deutlich, daß bei Hybridisierung mit einem Target-Oligonukleotid-Strang, der 2 Basenpaar-Mismatches aufweist zum einen ein geringerer Strom fließt, zum anderen die Differenz der Strommaxima vergrößert wird.From Fig. 4, a significantly increased current flow when there can be seen a double-stranded oligonucleotide to the unhybridized form. This enables sequence-specific hybridization events to be detected. It is clear from FIG. 5 that when hybridizing with a target oligonucleotide strand which has 2 base pair mismatches, on the one hand a lower current flows, on the other hand the difference in the current maxima is increased.

Claims

1. A nucleic acid oligomer modified by binding a redox-active substance, characterized in that the redox-active substance is a compound having a predominantly planar p-π orbital system, namely a 1,2-naphthoquinone of the general structure
or a 1,4-naphthoquinone of the general structure
or a 9,10-anthraquinone of the general structure
or a pyrrolo-quinoline-quinone of the general structure
is used, wherein R ₁ to R _{8 are} independently H or any alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl substituent.

2. Modified nucleic acid oligomer according to claim 1, wherein a pyrrolo-quinoline quinone of the general structure as the redox-active substance
is used, wherein R ₂ , R ₄ = H and R ₁ , R ₃ , R ₅ = COOH.

3. Modified nucleic acid oligomer according to claim 1 or 2, wherein the redox-active substance covalently to one of the phosphoric acid, carboxylic acid or Amine units, to one of the sugar units or to one of the bases of the Nucleic acid oligomers is attached, especially to a terminal Unit of the nucleic acid oligomer.

4. Modified nucleic acid oligomer according to claim 1 or 2, wherein the redox-active substance covalently to a branched or unbranched Molecular part of any composition and chain length is attached and the branched or unbranched part of the molecule to one of the phosphoric acid, Carboxylic acid or amine units, to one of the sugar units or to one of the bases of the nucleic acid oligomer is bound, in particular to one separate unit of the nucleic acid oligomer.

5. Modified nucleic acid oligomer according to claim 4, wherein the redox active Substance covalently to a branched or unbranched part of the molecule is connected, the shortest continuous connection between the connected structures comprises 1 to 14 atoms.

6. Modified nucleic acid oligomer according to one of the preceding Claims, wherein the modified nucleic acid oligomer is sequence specific Single-stranded DNA, RNA and / or PNA can bind.

7. Modified nucleic acid oligomer according to claim 6, wherein the modified Nucleic acid oligomer is a deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid Peptide nucleic acid oligomer or a nucleic acid oligomer with structural analog backbone.

8. A method for producing a modified nucleic acid oligomer according to Claims 1 to 3, characterized in that the redox active Substance is bound to a nucleic acid oligomer, the binding to a phosphoric acid or carboxylic acid group of the nucleic acid Oligomers by amide formation with a (primary or secondary) Amino group of the redox-active substance, by ester formation with a (primary, secondary or tertiary) alcohol group of the redox-active Substance, or by thioester formation with a (primary, secondary or tertiary) thio-alcohol group of the redox-active substance or by Condensation of an amine group of the nucleic acid oligomer with a Aldehyde group of the redox-active substance takes place.

9. A method for producing a modified nucleic acid oligomer according to claims 4 to 7, characterized in that the redox active Any substance to a branched or unbranched part of the molecule Composition and chain length is covalently linked, the Connection to a phosphoric acid or carboxylic acid group of the branched or unbranched part of the molecule by amide formation with a (primary or secondary) amino group of the redox-active substance, by ester formation with a (primary, secondary or tertiary) alcohol group of the redox-active Substance, or by thioester formation with a (primary, secondary or tertiary) thio-alcohol group of the redox-active substance or by Condensation of an amine group of the branched or unbranched Part of the molecule with an aldehyde group of the redox-active substance.

10. Modified conductive surface, characterized in that one or several types of modified nucleic acid oligomers according to the Claims 1 to 7 are connected to a conductive surface.

11. Modified conductive surface according to claim 10, wherein the surface of a metal or a metal alloy, in particular a metal selected from the group of platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, Nickel, zinc, carbon, silver, copper, iron, lead, aluminum, manganese and their mixtures.

12. Modified conductive surface according to claim 10, wherein the surface of a semiconductor, in particular a semiconductor selected from the Group of carbon, silicon, germanium and α-tin.

13. Modified conductive surface according to claim 10, wherein the surface of a binary connection of the elements of groups 14 and 16, a binary Connection of the elements of groups 13 and 15, a binary connection the elements of groups 15 and 16, or a binary connection of the Elements of groups 11 and 17 consist, in particular, of a Cu (I) - Halide or an Ag (I) halide.

14. Modified conductive surface according to claim 10, wherein the surface of a ternary combination of the elements of groups 11, 13 and 16 or one ternary compound elements of groups 12, 13 and 16.

15. Modified conductive surface according to one of claims 10 to 14, wherein the modified nucleic acid oligomers covalently to the conductive surface or are bound by physisorption.

16. Modified conductive surface according to claim 15, wherein one of the Phosphoric acid, carboxylic acid or amine units, one of the sugar units or one of the bases of the nucleic acid oligomer covalently or through Physisorption is bound to the conductive surface, especially one terminal unit of the nucleic acid oligomer.

17. Modified conductive surface according to one of claims 10 to 14, wherein branched or unbranched parts of the molecule on the conductive surface any composition and chain length covalently or by Physisorption are linked and the modified nucleic acid oligomers are covalently attached to these parts of the molecule.

18. Modified conductive surface according to claim 17, wherein the branched or unbranched part of the molecule a shortest continuous connection between the connected structures comprises from 1 to 14 atoms.

19. Modified conductive surface according to one of claims 17 or 18, wherein the branched or unbranched part of the molecule to one of the phosphoric acid, Carboxylic acid or amine units, to one of the sugar units or to one the bases of the nucleic acid oligomer is covalently bound, in particular to a terminal unit of the nucleic acid oligomer.

20. A method for producing a modified conductive surface according to a of claims 10 to 19, wherein one or more types of modified Nucleic acid oligomers according to claims 1 to 7 on a conductive Surface to be applied.

21. A method for producing a modified conductive surface according to a of claims 10 to 19, wherein one or more types of nucleic acid Oligomers are bound to a conductive surface and exclusively the nucleic acid oligomers bound to the conductive surface Linking a redox-active substance to the nucleic acid oligomers be modified.

22. A method for producing a modified conductive surface according to Claim 21, wherein the binding of the redox-active substance to the Nucleic acid oligomer by reacting the redox-active substance with a Phosphoric acid unit, a sugar unit or one of the bases of the Nucleic acid oligomers takes place, in particular by reaction with a terminal unit of the nucleic acid oligomer.

23. A method for producing a modified conductive surface according to Claim 21, wherein the redox-active substance covalently to a branched or unbranched molecular part of any composition and chain length is attached and the branched or unbranched part of the molecule to one of the Phosphoric acid, carboxylic acid or amine units to one of the sugar Units or attached to one of the bases of the nucleic acid oligomer is, in particular to a terminal unit of the nucleic acid oligomer.

24. A method for producing a modified conductive surface according to a of claims 20 to 23, wherein the nucleic acid oligomer or modified nucleic acid oligomer with the complementary one Nucleic acid oligomer strand is hybridized and in the form of the Double stranded hybrid is applied to the conductive surface.

25. Process for producing a modified conductive surface according to a of claims 20 to 24, wherein the nucleic acid oligomer or modified nucleic acid oligomer in the presence of further chemical Connections that are also attached to the conductive surface is applied to the conductive surface.

26. Method for the electrochemical detection of nucleic acid oligomer Hybridization events, characterized in that a conductive Surface as defined in claims 10 to 19 with nucleic acid Oligomers is brought into contact and then a detection of the Change in electrical communication between the redox active Unit and the respective conductive surface due to the hybridization of the nucleic acid oligomers with the modified nucleic acid oligomers he follows.

27. The method according to claim 26, wherein the detection is cyclovoltametric, done amperometrically or by conductivity measurement.