DE10000161A1 - Determining test substances that inhibit protease, involves incubating cells expressing fusion protein having substrate with cleavage site for protease and reporter, measuring cleaved reporter and comparing with standard - Google Patents

Determining test substances that inhibit protease, involves incubating cells expressing fusion protein having substrate with cleavage site for protease and reporter, measuring cleaved reporter and comparing with standard

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Abstract

Determining test substances (S) for inhibiting proteases (I) that cleave membrane-bound substrates, comprises incubating cultivated cells with protease activity and expressing membrane-associated recombinant fusion protein having a substrate with a specific cleavage site for (I) and a reporter, with (S), measuring amount of cleaved reporter and comparing with a value obtained in absence of (S). Independent claims are also included for the following: (1) a substance (S) determined by the above method, which specifically inhibits the proteolytic cleavage of gamma -secretase substrate or presenilinase substrate, and (2) a pharmaceutical formulation comprising (S). - ACTIVITY : Nootropic; neuroprotective. - MECHANISM OF ACTION : Proteolytic cleavage of gamma -secretase and presenilinase inhibitor. The cell clones Abeta -KKK-ER/40, 59 and 65 (substrate Abeta -KKK/Gal4 with ER retention signal) and the cell clone Abeta -KKK/52 (substance Abeta -KKK/Gal4 without ER retention signal) were used to test the inhibitory effect of substance A. Confluent cells were incubated overnight with different concentrations of substance A. The luciferase assay was carried out. In all cell clones substance A inhibited Abeta formation in a concentration-dependent manner, as indicated by the decrease in the luciferase signal.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt im Feld der Verfahren zum Auffinden von Inhibitoren membranständiger Proteasen, insbesondere sind dies γ-Sekretase- und Presenilinase- Inhibitoren. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung dieser Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen sowie pharmazeutische Formulierungen, die diese Substanzen enthalten. Aggregation und Präzipitation von Proteinen sind an der Entstehung von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Veitstanz (Engl.: "Chorea Huntington") beteiligt. Bei der Alzheimer Erkrankung aggregiert das Amyloid-β-peptid (Aβ) und führt zu unlöslichen senilen Plaques, welche einen der pathologischen Marker der Erkrankung darstellen (Selkoe et al. 1996). Aβ entsteht durch proteolytische Spaltung eines Vorläuferproteins, dem Amyloid-Vorläuferprotein (Engl.: "amyloid precursor protein"; Engl.: APP). Man unterscheidet zwei Stoffwechselwege des APPs, den nicht amyloidogenen Weg und den amyloidogenen Weg (Selkoe, 1994).The present invention is in the field of methods for finding inhibitors membrane-bound proteases, in particular these are γ-secretase and presenilinase Inhibitors. Another embodiment of the invention relates to the use of this Inhibitors for the manufacture of a medicament for the treatment of neurodegenerative Diseases and pharmaceutical formulations containing these substances. Aggregation and precipitation of proteins are involved in the emergence of different neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson's and Veitstanz (English: "Chorea Huntington "). In Alzheimer's disease, the amyloid-β-peptide aggregates (Aβ) and leads to insoluble senile plaques, which is one of the pathological markers of the Represent disease (Selkoe et al. 1996). Aβ is formed by proteolytic cleavage Precursor protein, the amyloid precursor protein ("amyloid precursor protein"; Engl .: APP). A distinction is made between two metabolic pathways of the APP, which is not amyloidogenic route and the amyloidogenic route (Selkoe, 1994).

Im nicht amyloidogenen Metabolismus des APPs spaltet die α-Sekretase innerhalb der Aβ Region des APPs und führt damit zur Sekretion des löslichen N-terminalen Bereiches des Proteins (α-APPs) sowie nach erfolgtem γ-Sekretase-Schnitt zur Freisetzung von p3. Dagegen führt der amyloidogene Weg zur Enstehung von Aβ, indem zwei Proteasen den N- Terminus (β-Sekretase) bzw. den C-Terminus (γ-Sekretase) von Aβ generieren (Haass, 1993; Selkoe, 1994).In the non-amyloidogenic metabolism of the APP, the α-secretase cleaves within the Aβ Region of the APP and thus leads to the secretion of the soluble N-terminal region of the Proteins (α-APPs) and after the γ-secretase cut to release p3. In contrast, the amyloidogenic pathway leads to the formation of Aβ by two proteases Generate the terminus (β-secretase) or the C-terminus (γ-secretase) of Aβ (Haass, 1993; Selkoe, 1994).

In vivo ist Aβ im humanen Plasma und der Zerebrospinalflüssigkeit nachzuweisen. Auch in Zellkultur kann sekretiertes Aβ im Zellkulturüberstand in verschiedenen Zelltypen nachgewiesen werden, die APP oder Fragmente davon endogen exprimieren oder überexprimieren. Sowohl Aβ-Produktion und damit auch die Amyloid-Plaqueentstehung werden durch verschiedene genetische Risikofaktoren beeinflußt. Dazu gehören Mutationen in den homologen Proteinen Presenilin 1 und Presenilin 2 als auch im APP selbst. Die Analyse dieser Mutationen an Fibroblasten von Alzheimer-Patienten mit familiär vererbter Alzheimerkrankheit (Engl.: "Familiar Alzheimer Disease" (FAD)), zeigten den Einfluß, den sie auf die Aβ-Entstehung haben. Dies konnte durch Untersuchungen an transfizierten Zellen und transgenen Tieren bestätigt werden. Alle Mutationen erhöhen die Produktion von Aβ und führen im Fall der Presenilin Mutationen zur selektiven Erhöhung der längeren Aβ Variante, dem Aβ42 (Selkoe, 1996; Price, 1998). Dieses Peptid aggregiert im höheren Maße als die kürzere Form, das Aβ40, und wirkt toxischer auf Zellen neuronalen wie auch peripheren Ursprungs (Lemere et al., 1996; Mann et al., 1996). Neben diesem Einfluß der Mutationen gibt es Hinweise, daß auch die Wildtypform der Preseniline eine fundamentale Funktion in der physiologischen Entstehung von Aβ haben. In Neuronen von Mausembryonen, bei denen das PS1-Gen (PS: Presenilin) auf gentechnischen Wege ausgeschaltet wurde, konnte eine drastische Reduktion von Aβ 40 und Aβ 42 nachgewiesen werden. Außerdem akkumulieren in diesen Zellen die C-terminalen Fragmente des APPs, welches zu der Ansicht führte, die Preseniline aktivieren die γ-Sekretase oder besitzen selbst γ-Sekretase Aktivität (De Strooper et al., 1998; Sisodia et al., 1998). Erste in vitro Testsysteme kombiniert mit Mutationsstudien an konservierten Aspartaten des Presenilin 1 legen die Vermutung nahe, daß die Preseniline spezielle autokatalytisch aktive Aspartatproteasen sein könnten, die für den γ-Sekretase Schnitt in der Membran verantwortlich sind (Wolfe et al., 1999).Aβ can be detected in vivo in human plasma and cerebrospinal fluid. Also in Cell culture can secrete Aβ in the cell culture supernatant in various cell types can be detected that endogenously express APP or fragments thereof or overexpress. Both Aβ production and thus amyloid plaque formation are affected by various genetic risk factors. This includes mutations in the homologous proteins Presenilin 1 and Presenilin 2 as well as in the APP itself Analysis of these mutations in fibroblasts from Alzheimer's patients with familial inheritance Alzheimer's disease (English: "Familiar Alzheimer Disease" (FAD)), showed the influence that they have on the Aβ genesis. This was possible through studies on transfected Cells and transgenic animals are confirmed. All mutations increase production of Aβ and in the case of presenilin mutations lead to the selective increase of the longer ones  Aβ variant, the Aβ42 (Selkoe, 1996; Price, 1998). This peptide aggregates in the higher Measures as the shorter form, the Aβ40, and is more toxic to neuronal cells as well peripheral origin (Lemere et al., 1996; Mann et al., 1996). In addition to this influence There are indications of mutations that the wild-type form of Preseniline is also a fundamental one Have a function in the physiological formation of Aβ. In neurons from Mouse embryos in which the PS1 gene (PS: Presenilin) is genetically engineered switched off, a drastic reduction of Aβ 40 and Aβ 42 could be demonstrated become. In addition, the C-terminal fragments of the APP accumulate in these cells, which led to the view that the presenilins activate γ-secretase or possess it themselves γ-secretase activity (De Strooper et al., 1998; Sisodia et al., 1998). First in vitro Test systems combined with mutation studies on preserved aspartates of presenilin 1 suggest that the presenilins are special autocatalytically active Aspartate proteases could be responsible for the γ-secretase cut in the membrane are responsible (Wolfe et al., 1999).

Die Diskussion über Identifizierung der γ-Sekretase als entscheidender Schritt in der Generierung von Aβ und damit in der Entstehung von Alzheimer ist bis heute nicht abgeschlossen. Unabhängig davon stellt diese Protease ein interessantes Ziel dar, um pharmakologisch in den Prozeß der Aβ-Entstehung eingreifen zu können, indem man Inhibitoren findet, die selektiv ihre Aktivität reduzieren. Dazu ist es wichtig, neben Tiermodellen und in vitro Testsystemen auch zelluläre Assays zu entwickeln, die unabhängig von Transportprozessen innerhalb der Zelle, das Testen von spezifischen Wirksubstanzen möglich machen.The discussion about identifying γ-secretase as a crucial step in the The generation of Aβ and thus the development of Alzheimer's has not yet occurred completed. Regardless, this protease represents an interesting target to to be able to intervene pharmacologically in the process of Aβ formation by Find inhibitors that selectively reduce their activity. It is important to do this next to Animal models and in vitro test systems also develop cellular assays that independent of transport processes within the cell, testing specific Make active substances possible.

Von Wolfe et al. (1999) wird ein in vitro System zur Messung der Aktivität der γ-Sekretase gezeigt. Zur Bereitstellung des Systems werden Membranen aus Zellen aufgearbeitet, die stabil PS1 exprimieren. Diese werden mit einem das LC99-Polypeptid kodierenden Plasmid vermischt und einer in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion in Gegenwart von 35S- Methionin unterworfen, wobei das γ-Sekretäse-Substrat C99 gebildet wird. Die Mischung wird anschließend unter geeigneten Bedingungen inkubiert, wobei das C99-Fragment von APP von der γ-Sekretase proteolytisch gespalten und die Abbauprodukte durch Gelelektrophorese nach einer Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Dieses Testsystem ist sehr langwierig und nicht automatisierbar und damit nicht für das Auffinden von spezifischen Proteaseinhibitoren geeignet. By Wolfe et al. (1999) an in vitro system for measuring the activity of γ-secretase is shown. To provide the system, membranes are processed from cells that stably express PS1. These are mixed with a plasmid encoding the LC99 polypeptide and subjected to an in vitro transcription / translation reaction in the presence of 35 S-methionine, the γ-secretary substrate C99 being formed. The mixture is then incubated under suitable conditions, the C99 fragment of APP being proteolytically cleaved by the γ-secretase and the degradation products being detected by gel electrophoresis after an immunoprecipitation. This test system is very lengthy and cannot be automated and is therefore not suitable for finding specific protease inhibitors.

Augenblicklich sind keine therapeutischen Ansätze bekannt, um den neuronalen Zelltod aufgrund von Presenilinfragmenten, welche an der neuronalen Apoptose beteiligt zu sein scheinen, zu unterbinden. Die Presenilinase, d. h. die Proteaseaktivität, die besagte Presenilinfragmente generiert, stellt ein exzellentes Zielmolekül dar. Aus dem Stand der Technik sind keine Verfahren bekannt, die es ermöglichen, Presenilinase-Inhibitoren aufzufinden, insbesondere nicht in einem gewerblichen Kontext.No therapeutic approaches to neuronal cell death are currently known due to presenilin fragments that are involved in neuronal apoptosis seem to prevent. The presenilinase, i.e. H. the protease activity that said Generated presenilin fragments represents an excellent target molecule Techniques are known that do not allow presenilinase inhibitors to find, especially not in a commercial context.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Testsystem zum Auffinden von spezifischen Proteaseinhibitoren bereitzustellen. Die Aufgabe konnte durch die vorliegende Erfindung im Rahmen der Beschreibung und der Ansprüche gelöst werden.The object of the present invention is to provide an improved test system for detection of specific protease inhibitors. The task could be done by present invention can be solved within the scope of the description and the claims.

Bevor die vorliegende Erfindung näher beschrieben wird, sollte angemerkt werden, das jeglicher Plural auch den Singular umfasst und umgekehrt, d. h. falls auf "die Substanzen" Bezug genommen wird, ist auch eine einzelne Substanz von der Erfindung umfasst.Before describing the present invention, it should be noted that any plural also includes the singular and vice versa, d. H. if on "the substances" By reference, a single substance is also encompassed by the invention.

Kurzbeschreibung der vorliegenden ErfindungBrief Description of the Present Invention

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch membranständige Proteasen inhibieren können und einen Hochdurchsatzmusterungstest zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase oder Presenilinase inhibieren können. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieses Verfahrens oder dieser Hochdurchsatzmusterungstests zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase oder Presenilinase inhibieren können. Auch werden Substanzen offenbart, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden werden könnnen, die Verwendung besagter erfindungsgemäßer Substanzen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer-Krankheit sowie pharmazeutische Formulierungen, welche die erfindungsgemäßen Substanzen enthalten.The present invention relates to a method for finding substances which can specifically inhibit membrane-bound proteases and a High throughput patterning test for finding substances that specifically γ-secretase or inhibit presenilinase. The invention further relates to the use this method or high throughput patterning tests to find Substances that can specifically inhibit γ-secretase or presenilinase. Be too Discloses substances that are found with a method according to the invention can, the use of said substances according to the invention for producing a Medicament for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular the Alzheimer's disease and pharmaceutical formulations which Contain substances according to the invention.

AbbildungslegendeFigure legend

Abbildung (Figur) 1: Herstellung von Reporterkonstrukten und Zelllinien.Figure 1: Production of reporter constructs and cell lines.

Abbildung (Figur) 2: Durchführung des Testsystems - HTS Assay Prinzip. Figure 2: Execution of the test system - HTS assay principle.  

Abbildung (Fig) 3: ER Retention des γ-Sekretase Substrats - die intrazelluläre APP Prozessierung.Figure (Fig) 3: ER retention of the γ-secretase substrate - the intracellular APP Processing.

Abbildung (Figur) 4: Charakterisierung der transfizierten Zellinien für den HTS.Figure 4: Characterization of the transfected cell lines for the HTS.

  • A) Bestimmung der Aβ-KKK/Gal4 Substrat-Expression mittels Western Blot.A) Determination of the Aβ-KKK / Gal4 substrate expression using Western blot.
  • B) Bestimmung der Luziferase-Expression mittels Western Blot.B) Determination of luciferase expression using Western blot.
  • C) Bestimmung der Luziferase Expression mittels enzymatischem Nachweis.C) Determination of the luciferase expression by means of enzymatic detection.
  • D) Bestimmung der Luziferase Expression mittels enzymatischem Nachweis.D) Determination of the luciferase expression by means of enzymatic detection.

Abbildung (Figur) 5. Bestimmung der Level an extrazellulärem Aβ42 das von den transfizierten HTS Testzellinien sekretiert wird.Figure (Figure) 5. Determination of the levels of extracellular Aβ42 that of the transfected HTS test cell lines is secreted.

Abbildung (Figur) 6: BFA Effekt in den HTS Testzellinien Aβ-KKK-ER/59 und Aβ-KKK/52.Figure 6: BFA effect in the HTS test cell lines Aβ-KKK-ER / 59 and Aβ-KKK / 52.

  • A) Luziferase-Test.A) Luciferase test.
  • B) Vitalitätstest.B) vitality test.

Abbildung (Figur) 7: Effekt der Presenilin (PS1 und PS2) Aspartatmutationen in den HTS Testzellinien Aβ-KKK-ER/59 und Aβ-KKK/52
Figure 7: Effect of presenilin (PS1 and PS2) aspartate mutations in the HTS test cell lines Aβ-KKK-ER / 59 and Aβ-KKK / 52

  • A) Effekt der PS (Asp) Mutanten in den Poolzellen Aβ-KKK/52/D385N (PS1mut) und Aβ-KKK/52/D366A (PS2mut).A) Effect of the PS (Asp) mutants in the pool cells Aβ-KKK / 52 / D385N (PS1mut) and Aβ-KKK / 52 / D366A (PS2mut).
  • B) Effekt der PS (Asp) Mutanten in den Poolzellen Aβ-KKK-ER/59/D385N (PS1mut) und Aβ-KKK-ER/59/D366A (PS2mut).B) Effect of the PS (Asp) mutants in the pool cells Aβ-KKK-ER / 59 / D385N (PS1mut) and Aβ-KKK-ER / 59 / D366A (PS2mut).
  • C) Nachweis der Überexpression der PS (Asp) Mutanten in den jeweiligen Zellinien.C) Detection of the overexpression of the PS (Asp) mutants in the respective cell lines.

Abbildung (Fig) 8: Substanz A.Figure (Fig) 8: Substance A.

  • A) Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ Bildung durch die Substanz A.A) Concentration-dependent inhibition of Aβ formation by substance A.
  • B) Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ 40 und Aβ 42 Sekretion durch die Substanz A.B) Concentration-dependent inhibition of Aβ 40 and Aβ 42 secretion by the Substance A.

Abbildung (Figur) 9: Substanz B.Figure 9: Substance B.

Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ Bildung durch die Substanz B. Concentration-dependent inhibition of Aβ formation by substance B.  

Abbildung (Fig) 10: Substanz C.Figure (Fig) 10: Substance C.

Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ Bildung durch die Substanz C.Concentration-dependent inhibition of Aβ formation by substance C.

Detaillierte BeschreibungDetailed description

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch Proteasen, die membranständige Substrate spalten, inhibieren können, bereitgestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
According to the invention, there is provided a method for finding substances which can specifically inhibit proteases which cleave membrane substrates, which is characterized in that

  • a) man Zellen, die besagte Protease-Aktivität endogen oder exogen aufweisen sowie ein membran-assoziiertes rekombinantes Fusionsprotein exprimieren, welches das Substrat der besagten Protease mit der spezifischen Spaltstelle für besagte Protease und einen Reporter umfasst, kultiviert,a) cells which have said protease activity endogenously or exogenously and express a membrane-associated recombinant fusion protein that the Substrate of said protease with the specific cleavage site for said protease and includes a reporter, cultivated,
  • b) diese Zellen mit einer Testsubstanz inkubiert,b) these cells are incubated with a test substance,
  • c) man die Menge des abgespaltenen Reporters mißt undc) one measures the amount of the reporter split off and
  • d) der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.d) the value obtained is compared with the value obtained in the absence of the Test substance is obtained.

Unter besagter Protease oder Proteaseaktivität wird ein Enzym bzw. eine enzymatische Aktivität verstanden, die spezifisch, d. h. zwischen bestimmten Aminosäuresequenzen spaltet und zwischen anderen Aminosäuresequenzen nicht, und deren Substrate membranständig oder membranassoziiert sind. Unter membranständig soll im Rahmen dieser Erfindung verstanden werden, daß das Substrat integraler Bestandteil der Membran ist. Unter membranassoziert soll im Rahmen dieser Erfindung verstanden werden, daß das Substrat an die Oberfläche der Membran oder an integrale Membranproteine gebunden ist. Es sollen von dieser Definition für membranassozierte Substrate auch Substrate umfaßt werden, die über chemische Gruppierungen mit dem hydrophoben Teil der Membran wechselwirken, die durch posttranslationale Modifikationen hinzugefügt wurden. Ferner sollen unter den Begriff membranassozierte Substrate auch Substrate fallen, die über Aminosäurenseitenketten mit dem hydrophoben Teil der Membran wechselwirken, allerdings in geringerem Maße als die integralen Membranproteine. Beispielhaft soll hier die Prostaglandinsynthetase genannt werden. Unter Substrat sollen Peptide und Proteine verstanden werden, die mindestens eine Spaltstelle besagter Protease enthalten. Die Substrate können auch modifiziert sein, d. h. z. B. glykosyliert. (Sambrook et al., 1989). Erfindungsgemäß ist besagtes Substrat an einen Reporter (s. unten) fusioniert, der zum Nachweis der Proteaseaktivität (Spaltung) dient. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können durch gängige gentechnologische Methoden (Sambrook et al., 1989) hergestellt werden, wenn die für das Substrat und das Reporterprotein kodierende DNS verfügbar ist. Die DNS, die für die Reporterproteine kodiert, kann z. B. von kommerziellen Anbietern erhalten werden, wie z. B. Clontech, Heidelberg, und durch Standardverfahren (Sambrook and Maniatis, 1989) in die gewünschten Vektoren eingesetzt werden. Die DNS, die für das Substrat kodiert, kann für einige Proteasen mit Standardmethoden aus geeigneten Genbanken erhalten werden.Under said protease or protease activity, an enzyme or an enzymatic Understood activity that specifically, d. H. cleaves between certain amino acid sequences and not between other amino acid sequences, and their substrates are membrane-bound or membrane-associated. Under membrane is intended within the scope of this invention be understood that the substrate is an integral part of the membrane. Under membrane-associated should be understood in the context of this invention that the substrate the surface of the membrane or is bound to integral membrane proteins. It should This definition for membrane-associated substrates also includes substrates which interact with the hydrophobic part of the membrane via chemical groups through post-translational modifications. Furthermore, among the The term membrane-associated substrates also includes substrates that fall over Amino acid side chains interact with the hydrophobic part of the membrane, however to a lesser extent than the integral membrane proteins. The example here is Prostaglandin synthetase can be called. Peptides and proteins are said to be under substrate can be understood that contain at least one cleavage site of said protease. The Substrates can also be modified, i. H. e.g. B. glycosylated. (Sambrook et al., 1989). According to the invention, said substrate is fused to a reporter (see below) which is used for  Evidence of protease activity (cleavage) is used. The fusion proteins according to the invention can be produced by common genetic engineering methods (Sambrook et al., 1989) when the DNA encoding the substrate and reporter protein is available. The DNA encoding the reporter proteins can e.g. B. from commercial providers be obtained, such as. B. Clontech, Heidelberg, and by standard methods (Sambrook and Maniatis, 1989) can be used in the desired vectors. The DNS for that Encoded substrate, can be used for some proteases using standard methods Genebanks can be obtained.

Testsubstanzen können jegliche dem Fachmann bekannte oder auch neue Substanzen sein. Beispielsweise können diese Substanzen Proteine oder chemische Verbindungen sein, die auch in kommerziellen Substanz-Bibliotheken erhältlich sind.Test substances can be any substances known to the person skilled in the art or also new substances. For example, these substances can be proteins or chemical compounds that are also available in commercial substance libraries.

Indem, wie unter Teil d) des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird, kann die Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens kontrolliert werden. Der Fachmann kann mit einer solchen Kontrolle die Substanzen erkennen, die die erfindungsgemäße Inhibition besagter Proteasen aufweisen.By, as described in part d) of the process according to the invention, the obtained Value is compared with the value obtained in the absence of the test substance, the specificity of the method according to the invention can be checked. The expert can with such a control recognize the substances that the invention Have inhibition of said proteases.

Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen kultiviert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das die spezifische Spaltstelle der γ-Sekretase umfasst (Siehe auch Beispiel 1). Das erfindungsgemäße Fusionsprotein mit dem γ- Sekretase-Substrat kann ganz allgemein membranassoziert, bevorzugt aber membranständig, sein.In particular, the method according to the invention is characterized in that cells cultured expressing a fusion protein that the specific cleavage site of γ-secretase includes (see also example 1). The fusion protein according to the invention with the γ- Secretase substrate can be membrane-associated in general, but is preferred be membranous.

Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen kultiviert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das die spezifische Spaltstelle der Presenilinase umfasst.Furthermore, the inventive method is characterized in that cells cultured expressing a fusion protein that the specific cleavage site of Presenilinase includes.

Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren in einer besonderen Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein Amyloid β umfaßt. Dies stellt das Substrat der γ-Sekretase dar.In addition, the method according to the invention is in a special embodiment characterized in that the fusion protein comprises amyloid β. This represents the substrate the γ-secretase.

Für das erfindungsgemäße Verfahren in einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Fusionsprotein ein Fragment von Amyloid β. Dies stellt das Substrat der γ-Sekretase dar und muß erfindungsgemäß zumindest eine spezifische γ-Sekretase Schnittstelle beinhalten. Für das erfindungsgemäße Verfahren in einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Fusionsprotein das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP; engl.: "amyloid precursor protein") oder ein Fragment davon. Beispielsweise kann das Fusionsprotein aus einem Reporterprotein und dem C99-Fragment bestehen. Die DNS, die für das γ-Sekretase- Substrat oder für das C99-Fragment kodiert, kann mit Standardmethoden aus geeigneten Genbanken erhalten werden. Dies stellt das Substrat der γ-Sekretase dar und muß erfindungsgemäß zumindest eine spezifische γ-Sekretase Schnittstelle beinhalten. Für das erfindungsgemäße Verfahren in einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Fusionsprotein Presenilin 1 oder ein Fragment davon. Die Fragmente können beispielsweise N-terminale Fragmente (NTF) von ca. 21-28 kDa oder C-terminale Fragmente (CTF) von 16-24 kDa (Haas et al., 1998; Okochi et al., 1997; Thinakaran et al., 1996) sein, die allerdings über die Presenilinase Schnittstelle hinausgehen müssen. Presenilin 1 oder dessen Fragmente stellen die Substrate der Presenilinase dar und muß erfindungsgemäß zumindest eine spezifische Presenilinase Schnittstelle beinhalten.For the method according to the invention in a special embodiment, this includes Fusion protein a fragment of amyloid β. This is the substrate of γ-secretase and according to the invention must contain at least one specific γ-secretase interface. For the method according to the invention in a special embodiment, this includes Fusion protein the amyloid precursor protein (APP; "amyloid precursor protein")  or a fragment of it. For example, the fusion protein can be made from a Reporter protein and the C99 fragment exist. The DNA responsible for the γ-secretase Substrate or encoded for the C99 fragment can be made using suitable methods Genebanks can be obtained. This is and must be the substrate of γ-secretase according to the invention contain at least one specific γ-secretase interface. For the method according to the invention in a special embodiment, this includes Fusion protein presenilin 1 or a fragment thereof. The fragments can, for example N-terminal fragments (NTF) of approx. 21-28 kDa or C-terminal fragments (CTF) of 16-24 kDa (Haas et al., 1998; Okochi et al., 1997; Thinakaran et al., 1996), the however, have to go beyond the presenilinase interface. Presenilin 1 or its Fragments represent the substrates of the presenilinase and must, according to the invention, at least include a specific presenilinase interface.

Für das erfindungsgemäße Verfahren in einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Fusionsprotein Presenilin 2 oder ein Fragment davon. Die Fragmente können beispielsweise N-terminale Fragmente (NTF) von ca. 28-30 kDa (NTF) kDa oder C-terminale Fragmente (CTF) von 20-25 kDa (Haas et al., 1998; Kim et al., J Biol Chem 1997, 272, 11006-11010; Podlisny et al., 1997) sein, die allerdings über die Presenilinase Schnittstelle hinausgehen müssen. Presenilin 2 oder dessen Fragmente stellen die Substrate der Presenilinase dar und muß erfindungsgemäß zumindest eine spezifische Presenilinase Schnittstelle beinhalten. Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Hochdurchsatzmusterungstest ("high throughput screening - HTS"). Dieser HTS ist vorteilhaft gegenüber dem Stand der Technik, da hiermit auf einfache Weise eine Vielzahl von Substanzen auf ihre Wirksamkeit getestet werden kann. Ein Hochdurchsatztest oder HTS ist ein Verfahren, bei dem eine große bis sehr große Anzahl an Substanzen gleichzeitig untersucht wird. Vorzugsweise kann ein HTS in Mikrotiterplatten ausgeführt werden, kann teilweise oder völlig automatisiert werden und kann an elektronische Geräte wie Computer für die Datenspeicherung, -analyse und -auswertung mittels Bioinformatik angeschlossen werden. Bevorzugt findet besagte Automatisierung sowohl mittels Robotern statt, wie sie auch aus der Automobilindustrie bekannt sind, welche in der Lage sind, große Anzahlen an Mikrotiterplatten gleichzeitig oder sequenziell zu handhaben als auch mittels automatischer Pipettiereinrichtungen. Diese automatischen oder teil-automatischen HTS-Anlagen sind in der Lage, mehrere tausend Tests pro Tag durchzuführen und werden kommerziell angeboten. Testsubstanzen können als Substanzbibliotheken kommerziell erworben werden. Die Testsubstanzen werden vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel gelöst, besonders bevorzugt werden sie in DMSO gelöst. Vorzugsweise werden die Testsubstanzen, welche die gewünschte Proteaseinhibitorfunktion in einem zellfreien System aufweisen, auch in einem zellbasierten System getestet. Der Ausdruck Hochdurchsatztest oder HTS beinhaltet auch Ultrahochdurchsatztests (Englisch: "ultra high throughput screening: UHTS"). Bevorzugt werden besagte Ultrahochdurchsatztests oder UHTS in 384- oder 1536-Loch Mikrotiterplatten ausgeführt mit sub-Mikroliter- oder sub-Nanoliter- Pipettoren, verbesserten Plattenlesegeräten und mit Verfahren, die die Verdunstung verhindern. HTS Methoden werden beispielsweise in den US Patenten US 5876946 A or US 5902732 A beschrieben. Dem Durchschnittsfachmann sind weitere Literaturquellen zu HTS oder UHTS Tests bekannt und er kann die Verfahren der gegenwärtigen Erfindung ohne erfinderischen Schritt an ein HTS oder UHTS Format anpassen, ohne selbst erfinderisch tätig zu sein. Im Rahmen dieser Erfindung soll unter einem Reporterprotein ein Protein verstanden werden, das die Eigenschaft besitzt, ein leicht detektierbares Signal zu generieren, und dessen Menge mit der Menge des interessierenden Spaltproduktes korreliert. Die Signalgenerierung erfolgt entweder durch die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Reporterproteins mit leicht zu detektierenden Substraten oder durch Messung der Intensität der Fluoreszenz des Reporterproteins. Beispiele für Reporterproteine sind das grün fluoreszierende Protein (GFP; engl: "green fluorescent protein"; siehe z. B. WO 95/07463) oder in anderen Wellenlängenbereichen fluoreszierende Derivate davon oder Enzyme wie die Luziferase, die sekretorische alkalische Phosphatase oder die β-Galaktosidase. Daher wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Menge des abgespaltenen Reporters mit Luziferase, grün fluoreszierendem Protein oder einem Derivat davon, der sekretorischen alkalischen Phosphatase oder der β- Galaktosidase gemessen.For the method according to the invention in a special embodiment, this includes Fusion protein presenilin 2 or a fragment thereof. The fragments can, for example N-terminal fragments (NTF) of approx. 28-30 kDa (NTF) kDa or C-terminal fragments (CTF) of 20-25 kDa (Haas et al., 1998; Kim et al., J Biol Chem 1997, 272, 11006-11010; Podlisny et al., 1997), which, however, go beyond the presenilinase interface have to. Presenilin 2 or its fragments represent the substrates of presenilinase and According to the invention, it must contain at least one specific presenilinase interface. The method according to the invention is preferably a high-throughput patterning test ("high throughput screening - HTS "). This HTS is advantageous over the prior art, because this is a simple way to test a variety of substances for their effectiveness can be. A high throughput test or HTS is a procedure in which a large up very large number of substances is examined simultaneously. Preferably an HTS run in microtiter plates, can be partially or fully automated and can be connected to electronic devices such as computers for data storage, analysis and -evaluation using bioinformatics. Preferably said Automation takes place using robots as well as from the automotive industry are known, which are capable of large numbers of microtiter plates at the same time or to be handled sequentially as well as by means of automatic pipetting devices. This automatic or semi-automatic HTS systems are capable of several thousand Perform tests per day and are offered commercially. Test substances can  commercially available as substance libraries. The test substances are preferably dissolved in an organic solvent, they are particularly preferred solved in DMSO. Preferably the test substances which are the desired ones Have protease inhibitor function in a cell-free system, even in a cell-based one System tested. The term high throughput test or HTS also includes Ultra high throughput screening (UHTS). Prefers are said ultra high throughput tests or UHTS in 384 or 1536 holes Microtiter plates made with sub-microliter or sub-nanoliter pipettors, improved plate readers and processes that prevent evaporation. HTS Methods are described, for example, in US Pat. Nos. 5876946 A or 5902732 A. described. The average person skilled in the art has additional literature sources on HTS or UHTS Tests known and he can use the methods of the present invention without being inventive Adapt step to an HTS or UHTS format without being inventive yourself. In the context of this invention, a reporter protein is understood to mean a protein which has the property of generating an easily detectable signal, and the amount of which correlates with the amount of the cleavage product of interest. The Signal generation takes place either by determining the enzymatic activity of the Reporter protein with easily detectable substrates or by measuring the intensity the fluorescence of the reporter protein. Examples of reporter proteins are green fluorescent protein (GFP; ": green fluorescent protein"; see, for example, WO 95/07463) or fluorescent derivatives thereof or enzymes such as in other wavelength ranges the luciferase, the secretory alkaline phosphatase or the β-galactosidase. Therefore, in a further preferred embodiment of the invention Procedure the amount of reporter split off with luciferase, green fluorescent Protein or a derivative thereof, the secretory alkaline phosphatase or the β- Galactosidase measured.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Menge des abgespaltenen Reporters indirekt nachgewiesen.In yet another preferred embodiment of the method according to the invention the amount of the reporter split off is indirectly detected.

Eine große Anzahl an Transkriptionsfaktoren ist bekannt, für deren Aktivität zwei Untereinheiten erforderlich sind. In anderen Fällen kann ein einzelner Transkriptionsfaktor zwei separate funktionelle Domänen für seine Aktivität erfordern (z. B. eine transkriptionelle Aktivatordomäne und eine DNA-Bindungsdomäne), so daß jede Domäne alleine inaktiv ist, aber wenn sie zusammengebracht werden, kann die transkriptionelle Aktivität stattfinden. A large number of transcription factors are known, two of which are active Subunits are required. In other cases, a single transcription factor require two separate functional domains for its activity (e.g. a transcriptional Activator domain and a DNA binding domain) so that each domain alone is inactive, but when they are brought together, the transcriptional activity can take place.  

Einer dieser Faktoren ist Gal4, der wie beschrieben in zwei Domänen geteilt werden kann (Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 1984, 4: 260-267; Fields and Song, Nature, 1989, 340: 245). Weitere Transkriptionsfaktoren sind Mitglieder der Jun, Fos, and ATF/CREB Familien, Oct1, Sp1, HNF-3, die steroide Rezeptor-Superfamilie und ähnliche mehr.One of these factors is Gal4, which can be split into two domains as described (Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 1984, 4: 260-267; Fields and Song, Nature, 1989, 340: 245). Other transcription factors include members of Jun, Fos, and ATF / CREB families, Oct1, Sp1, HNF-3, the steroid receptor superfamily and the like more.

Ebenso wird in noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Menge des abgespaltenen Reporters indirekt nachgewiesen, indem eine abgespaltene Reporterdomäne in den Nukleus wandert, dort an eine weitere Reporterdomäne eines Reporterkonstruktes bindet und die Expression des Reporters aktiviert wird.Likewise, in yet another preferred embodiment of the invention Procedure indirectly detected the amount of reporter split off by a cleaved reporter domain migrates to the nucleus, there to another Reporter domain of a reporter construct binds and the expression of the reporter is activated.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Menge des abgespaltenen Reporters Gal4 indirekt nachgewiesen, indem Gal4 im Nukleus an die Gal4DNA-Bindungsdomäne eines weiteren Reporterkonstruktes bindet und die Expression von Luziferase aktiviert wird (Siehe Beispiele 2 und 4).In yet another preferred embodiment of the method according to the invention the amount of the rejected Gal4 reporter is indirectly detected by Gal4 in the Nucleus binds to the Gal4DNA binding domain of another reporter construct and the expression of luciferase is activated (see Examples 2 and 4).

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Menge des abgespaltenen Reporters direkt nachgewiesen. Beispielsweise könnte dies ein direkter Nachweis der Spaltung durch die Protease mittels eines Reporters, der beispielsweise erst bei Abspaltung aktiviert wird. Beispiele für Reporter können die oben beschriebenen sein: GFP, oder Enzyme wie die Luziferase, die sekretorische alkalische Phosphatase oder die β-Galaktosidase.In yet another preferred embodiment of the method according to the invention the amount of the reporter split off is directly detected. For example this is direct evidence of the cleavage by the protease using a reporter who for example, is only activated when it is split off. Examples of reporters can be found above described: GFP, or enzymes such as luciferase, the secretory alkaline Phosphatase or the β-galactosidase.

Zur Ausführung der Erfindung sind alle Zellen oder Zelllinien geeignet, die dem Fachmann bekannt sind, vor allem eukaryontische Zellen oder Zelllinien. Bevorzugt sind Zellen oder Zelllinien, die in der neurologischen oder neurobiologischen Forschung verwendet werden, z. B. Säugerzellen oder -zelllinien wie H4, U373, NT2, HEK 293, PC12, COS, CHO, Fibroblasten, Myelomazellen, Neuroblastomzellen, Hybridomzellen, Oozyten, embryonische Stammzellen. Ferner sind Insektenzelllinien (z. B. unter Verwendung von Baculovirus Vektoren wie pPbac oder pMbac (Stratagene, La Jolla, CA)), Hefe (z. B. unter Verwendung von Hefeexpressionsvektoren wie pYESHIS (Invitrogen, CA)), und Pilze geeignet.All cells or cell lines suitable for the person skilled in the art are suitable for carrying out the invention are known, especially eukaryotic cells or cell lines. Cells or are preferred Cell lines used in neurological or neurobiological research e.g. B. mammalian cells or cell lines such as H4, U373, NT2, HEK 293, PC12, COS, CHO, Fibroblasts, myeloma cells, neuroblastoma cells, hybridoma cells, oocytes, embryonic Stem cells. Furthermore, insect cell lines (e.g. using baculovirus Vectors such as pPbac or pMbac (Stratagene, La Jolla, CA)), yeast (e.g. using of yeast expression vectors such as pYESHIS (Invitrogen, CA)) and fungi.

Besonders bevorzugt sind Zellen oder Zelllinien neuronalen oder glialen Ursprungs. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den verwendeten Zelten um H4-Zellen, menschliche Neurogliomazellen aus dem Gehirn, die unter der ATCC-Nummer HTB-148 bei der "American Type Culture Collection (ATCC)", in Manassas, Virginia, USA, hinterlegt sind. Cells or cell lines of neuronal or glial origin are particularly preferred. In a very particularly preferred embodiment of the invention is the used tents around H4 cells, human neuroglioma cells from the brain that under the ATCC number HTB-148 at the "American Type Culture Collection (ATCC)", in Manassas, Virginia, USA.  

Daher sind in einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Zellen neuronalen oder glialen Ursprungs.Therefore, in a special embodiment of the method according to the invention Cells of neuronal or glial origin.

In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Zellen H4- Zellen.In a special embodiment of the method according to the invention, the cells H4- Cells.

Erfindungsgemäß ist auch ein Hochdurchsatzmusterungstest zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase inhibieren können, dadurch gekennzeichnet, daß
According to the invention, a high-throughput patterning test for finding substances which can specifically inhibit γ-secretase is characterized in that

  • a) man H4 Zellen, die besagte γ-Sekretase-Aktivität endogen oder exogen aufweisen sowie das membran-assoziierte rekombinante Fusionsprotein Aβ-KKK/Gal4 exprimieren, kultiviert,a) H4 cells which have said γ-secretase activity endogenously or exogenously and express the membrane-associated recombinant fusion protein Aβ-KKK / Gal4, cultured,
  • b) diese Zellen mit einer Testsubstanz inkubiert,b) these cells are incubated with a test substance,
  • c) man mittels der Höhe der Luziferaseexpression die Menge des abgespaltenen und an die Gal4-DNA Bindungsdomäne des Luziferasekonstruktes bindenden Transaktivators Gal4 mißt undc) by means of the level of luciferase expression, the amount of the split off and to the Gal4-DNA binding domain of the transactivator Gal4 that binds to luciferase construct measures and
  • d) der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.d) the value obtained is compared with the value in the absence of the test substance is obtained.

In den Beispielen ist dieser erfindungsgemäße Hochdurchsatztest näher beschrieben. Die erfindungsgemäßen Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstests können im Rahmen dieser Erfindung zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase inhibieren können, verwendet werden.This high throughput test according to the invention is described in more detail in the examples. The methods according to the invention or high-throughput patterning tests can be carried out in the of this invention for finding substances that specifically inhibit γ-secretase can be used.

Die erfindungsgemäßen Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstests können im Rahmen dieser Erfindung zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch Presenilinase inhibieren können, verwendet werden.The methods according to the invention or high-throughput patterning tests can be carried out within the framework of this invention for finding substances that specifically inhibit presenilinase can be used.

Weiterhin umfasst die Erfindung Substanzen, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstest auffindbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die proteolytische Spaltung eines γ-Sekretase-Substrats inhibieren. Beispielsweise können diese Substanzen Proteine oder chemische Verbindungen sein. Eine erfindungsgemäße Substanz ist die Substanz A, wie in der folgenden Formel dargestellt (siehe auch Beispiel 8):
Furthermore, the invention comprises substances which can be found using a method according to the invention or a high-throughput pattern test, characterized in that they specifically inhibit the proteolytic cleavage of a γ-secretase substrate. For example, these substances can be proteins or chemical compounds. A substance according to the invention is substance A, as shown in the following formula (see also Example 8):

Weiterhin umfasst die Erfindung Substanzen, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstest auffindbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die proteolytische Spaltung eines Presenilinase-Substrats inhibieren. Beispielsweise können diese Substanzen Proteine oder chemische Verbindungen sein. Besagte erfindungsgemäße Substanzen können im Rahmen dieser Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer-Krankheit verwendet werden. Weitere neurodegenerative Erkrankungen umfassen beispielsweise Alzheimer, Parkinson und Veitstanz (Engl.: "Chorea Huntington"). Die Erfindung umfaßt auch eine pharmazeutische Formulierung, die eine erfindungsgemäße Substanz sowie übliche pharmazeutische Trägersubstanzen enthält.The invention further comprises substances which are produced using a method according to the invention or high-throughput patterning test can be found, characterized in that they specifically inhibit the proteolytic cleavage of a presenilinase substrate. For example, these substances can be proteins or chemical compounds. Said substances according to the invention can be used for the production of this invention a drug for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular the Alzheimer's disease can be used. Other neurodegenerative diseases include, for example, Alzheimer's, Parkinson's and Veitstanz (English: "Chorea Huntington"). The invention also encompasses a pharmaceutical formulation comprising an inventive formulation Contains substance as well as usual pharmaceutical carrier substances.

Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger kann physiologisch akzeptable Verbindungen enthalten, die z. B. die Stabilität oder Absorption der erfindungsgemäßen Substanz erhöhen. Solche physiologisch akzeptable Verbindungen beinhalten z. B. Kohlenhydrate wie Glukose, Saccharose oder Dextrane, Antioxidantien wie Ascorbat oder Glutathion, Chelatbildner, Proteine mit niedrigem Molekulargewicht oder andere Stabilisatoren (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)). Ein Fachmann weiß, daß die Auswahl eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers einschließlich einer physiologisch akzeptablen Verbindung z. B. vom Administrationsweg abhängt.A pharmaceutically acceptable carrier can be physiologically acceptable compounds contain the z. B. increase the stability or absorption of the substance of the invention. Such physiologically acceptable compounds include e.g. B. carbohydrates such as glucose, Sucrose or dextrans, antioxidants such as ascorbate or glutathione, chelating agents, Low molecular weight proteins or other stabilizers (see e.g. Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)). One skilled in the art knows that choosing one pharmaceutically acceptable carrier including a physiologically acceptable one Connection z. B. depends on the administration route.

Die folgenden Beispiele sollen der Erläuterung dienen und in keiner Weise die Breite der Erfindung einschränken. The following examples are intended to be illustrative and in no way the breadth of the Limit invention.  

Beispiel 1 - Herstellung von Reporterkonstrukten und Zelllinien (siehe auch Abb. 1)Example 1 - Production of reporter constructs and cell lines (see also Fig. 1) Durchführung des TestsystemsExecution of the test system 1.1 Herstellung einer geeigneten Zellinie γ-Sekretase HTS1.1 Preparation of a suitable cell line γ-secretase HTS

H4 Neurogliomazellen (Hinterlegungsnummer HTB 148 bei der "American Type Culture Collection", Manassas, Virginia, USA) wurden unter Standardbedingungen mit dem Reporterkonstrukt pFRLuc (Stratagene) stabil transfiziert, das das Gen für die Luziferase trägt, welches unter der Kontrolle eines Promotors ist, der die Gal4-DNA Bindungsdomäne beinhaltet. Durch transiente Transfektionsexperimente mit pcDNA3-Gal4, das für das lösliche Gal4 codiert, wurde ein individueller Klon ausgewählt, der die höchste Lucifearse Aktivität aufwies. Zur Herstellung des Aβ-KKK/Gal4-Konstrukts wurde eine Sequenz, die die N-terminale Signalsequenz des APP und die ersten 55 Aminosäuren von Aβ (Shoji et al. 1992) enthielt, mit der Gal4 kodierenden Sequenz (Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 1984, 4: 260-267) durch gentechnische Methoden verbunden und in den Expressionsvektor pcDNA3neo (Invitrogen) kloniert. Dieses Konstrukt wurde als Aβ- KKK/Gal4 bezeichnet. Um ein ER-Retentionssignal in das Substrat der γ-Sekretase einzufügen, wurden die letzten Nukleotide des Gal4 durch gentechnische Methoden so verändert, daß sie für die Aminosäuren KKLI kodierten. Dieses Konstrukt wurde Aβ-KKK- ER/Gal4 genannt. Der wie oben beschrieben erhaltene Zellklon wurde für die zweite stabile Transfektion mit pcDNA3/Aβ-KKK/Gal4 oder pcDNA3/Aβ-KKK-ER/Gal4 eingesetzt und die Selektion mit Neomycin unter Standardbedingungen (Sambrook and Maniatis, 1989) durchgeführt. Einzelne Neomycin resistente Zellklone wurden auf Expression der Luziferase untersucht. Die Klone mit der höchsten Expression wurden für die Substanz-Analysen eingesetzt. Alle Transfektionen wurden mit dem Fugene-Transfektionssystem von Boehringer Mannheim nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.H4 neuroglioma cells (deposit number HTB 148 with the "American Type Culture Collection ", Manassas, Virginia, USA) were created under the standard conditions with the Reporter construct pFRLuc (Stratagene) stably transfects the gene for luciferase carries, which is under the control of a promoter, the Gal4-DNA binding domain includes. Through transient transfection experiments with pcDNA3-Gal4, which encoded soluble Gal4, an individual clone was selected which was the highest luciferase Showed activity. To produce the Aβ-KKK / Gal4 construct, a sequence that the N-terminal signal sequence of the APP and the first 55 amino acids of Aβ (Shoji et al. 1992), with the Gal4 coding sequence (Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 1984, 4: 260-267) linked by genetic engineering methods and in the Expression vector pcDNA3neo (Invitrogen) cloned. This construct was called Aβ- KKK / Gal4 called. For an ER retention signal in the substrate of γ-secretase the last nucleotides of Gal4 were inserted using genetic engineering methods changed that they coded for the amino acids KKLI. This construct was Aβ-KKK- Called ER / Gal4. The cell clone obtained as described above became stable for the second Transfection with pcDNA3 / Aβ-KKK / Gal4 or pcDNA3 / Aβ-KKK-ER / Gal4 used and selection with neomycin under standard conditions (Sambrook and Maniatis, 1989) carried out. Individual neomycin resistant cell clones were screened for expression of the luciferase examined. The clones with the highest expression were used for substance analyzes used. All transfections were performed using the Fugene transfection system from Boehringer Mannheim carried out according to the manufacturer's instructions.

1.2 Herstellung eines geeigneten Konstruktes für den Presenilinase HTS1.2 Preparation of a suitable construct for the Presenilinase HTS

Um Inhibitoren der Presenilinase zu identifizieren, wurde ein Konstrukt entworfen, daß aus einem Substratanteil (Presenilinanteil) und einem Reporteranteil (Gal4) besteht. Der Presenilinanteil besteht aus den Nukleotiden, die für die Aminosäuren 3-101 und den Aminosäuren 263 bis 325 des PS-1 (Sherrington et al., 1995) kodieren. Die erste Region beinhaltet dabei die erste Transmembranregion des PS-1. Durch gentechnische Methoden wurde N-terminal der ersten Presenilinsequenz die humane APP Signalsequenz (Shoji et al. 1992) angehängt. Der Reporteranteil schließt sich an die zweite Presenilinregion an (Gal4, Aminosäure 1-881; Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 1984, 4: 260-267). Dieses Kontrukt wurde in den Expressionsvektor pcDNA3neo (Invitrogen) kloniert.In order to identify inhibitors of presenilinase, a construct was designed that from a substrate component (presenilin component) and a reporter component (Gal4). The Presenilin consists of the nucleotides necessary for amino acids 3-101 and Encode amino acids 263 to 325 of PS-1 (Sherrington et al., 1995). The first region  includes the first transmembrane region of the PS-1. Through genetic engineering methods became the human APP signal sequence N-terminal of the first presenilin sequence (Shoji et al. 1992). The reporter share follows the second presenilin region (Gal4, Amino acid 1-881; Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 1984, 4: 260-267). This construct was cloned into the expression vector pcDNA3neo (Invitrogen).

Beispiel 2 - Durchführung des TestsystemsExample 2 - Execution of the test system HTS Assay Prinzip (siehe auch Abb. 2)HTS assay principle (see also Fig. 2)

Die doppelt stabile HTS Zellinie wird auf eine 96/384 Mikrotiterplatte ausgesät. Bei Konfluenz der Zellen werden diese mit der jeweiligen Testsubstanz für einen definierten Zeitraum inkubiert. Nach Inkubation wird das Zellmedium abgenommen und die Luziferase- Enzymaktivität exakt nach Angaben des Herstellers des verwendeten Testkits (SteadyGlo, Promega oder von einem anderen Hersteller) bestimmt.The double stable HTS cell line is sown on a 96/384 microtiter plate. At The cells become confluent with the respective test substance for a defined Incubated period. After incubation, the cell medium is removed and the luciferase Enzyme activity exactly according to the manufacturer of the test kit used (SteadyGlo, Promega or from another manufacturer).

Durch die Anwesenheit einer endogenen oder exogenen γ-Sekretaseaktivität in den H4 Zellen wird das Substrat (Aβ-KKK/Gal4) proteolytisch gespalten, wobei sich der Transaktivator Gal4 aus der Membran lösen und in den Zellkern gelangen kann. Im Zellkern bindet Gal4 an die Gal4-DNA Bindungsdomäne des Reporterkonstrukts und aktiviert somit die Expression der Luziferase. Bei Anwesenheit eines spezifischen γ-Sekretase-Inhibitors kann das Substrat nicht gespalten werden und Gal4 verbleibt, am Substrat gebunden, an der Zellmembran, was zu einer Reduktion bis hin zur vollständigen Inhibitio in der Luziferaseaktivität führt.Due to the presence of endogenous or exogenous γ-secretase activity in the H4 Cells, the substrate (Aβ-KKK / Gal4) is cleaved proteolytically, whereby the Detach transactivator Gal4 from the membrane and get into the cell nucleus. In the cell nucleus binds Gal4 to the Gal4-DNA binding domain of the reporter construct and thus activates expression of luciferase. In the presence of a specific γ-secretase inhibitor the substrate cannot be cleaved and Gal4 remains bound to the substrate Cell membrane, leading to a reduction up to complete inhibition in the Luciferase activity leads.

Zellen werden auf 96/384 Loch-Platten in DMEM Vollmedium (10% FCS, 1% Glutamin, 1% Penicillin/ Streptomycin) ausgesät in einer Verdünnung von 1 : 5. Die Zellen werden 24 bis 48 h (je nach verwendetem Zellklon und Verdünnung) bei 37°C, 5% CO2 inkubiert und bis 80-90% Konfluenz wachsen gelassen (auch etwas kürzer bzw. länger möglich). Nun wird die Testsubstanz zugegeben und über Nacht (8-16 h) bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die 96/384 Loch-Platten werden auf Raumtemperatur (RT) equilibriert. Das Kit "Steady­ Glo"-Luziferase Assay System (Promega Katalog Nr. E2520) wird verwendet. Die Luziferase Assay Reagenz wird aufgetaut und auf Raumtemperatur equilibriert bzw. frisch angesetzt (Luziferase Assay-Substrat in Luziferase Assay-Puffer gelöst). Das Medium wird von den Zellen abgesaugt. Es werden 100 µl (bezogen auf 96 Loch-Platten) frisches Vollmedium pro Vertiefung zugegeben. Es werden 100 µl (bezogen auf 96 Loch-Platten) Luziferase Assay-Reagenz zugegeben und 5 min bei RT inkubiert. Nun wird die Lumineszenz gemessen. Für 384 Loch-Platten werden die pipettierten Mengen entsprechend reduziert, wie dem Fachmann bekannt ist.Cells are sown on 96/384 well plates in DMEM complete medium (10% FCS, 1% glutamine, 1% penicillin / streptomycin) in a dilution of 1: 5. The cells are grown for 24 to 48 h (depending on the cell clone and dilution used ) incubated at 37 ° C, 5% CO 2 and allowed to grow to 80-90% confluency (also possible a little shorter or longer). Now the test substance is added and incubated overnight (8-16 h) at 37 ° C and 5% CO 2 . The 96/384 well plates are equilibrated to room temperature (RT). The "Steady Glo" Luciferase Assay System kit (Promega Catalog No. E2520) is used. The luciferase assay reagent is thawed and equilibrated to room temperature or freshly prepared (luciferase assay substrate dissolved in luciferase assay buffer). The medium is aspirated from the cells. 100 μl (based on 96 well plates) of fresh complete medium are added to each well. 100 μl (based on 96 well plates) of luciferase assay reagent are added and incubated for 5 min at RT. Now the luminescence is measured. For 384 well plates, the pipetted amounts are reduced accordingly, as is known to the person skilled in the art.

Beispiel 3Example 3 ER Retention des γ-Sekretase Substrats - die intrazelluläre APP Prozessierung (siehe Abb. 3)ER retention of the γ-secretase substrate - the intracellular APP processing (see Fig. 3)

APP ist ein Transmembranprotein, das entlang des sekretorischen Stoffwechselwegs prozessiert wird. Das 'full length' Protein wird vermutlich dabei bereits in sehr frühen zellulären Kompartimenten wie ER (endoplasmatisches Retikulum) und Golgi-Apparat durch die sogenannte β- und γ-Sekretasen gespalten, wobei überwiegend Aβ42 entsteht (Wild-Bode et al., 1997). Im Trans Golgi-Netzwerk (TGN), in den Vesikeln, die vom TGN abgeschnürt werden und zur Zellmembran wandern, bzw. direkt an der Zellmembran wird vermutlich durch die Aktivität der gleichen oder aber ähnlicher Proteasen das Aβ40 gebildet (Thinakaran et al., 1996). APP, das nicht im sekretorischen Stoffwechselweg prozessiert wurde, kann dann über Endozytose in das endosomale/lysosomale System gelangen und dort zu Aβ bzw. ganz degradiert werden (Koo and Squazzo, 1994).APP is a transmembrane protein that runs along the secretory pathway is processed. The 'full length' protein will presumably be in the very early stages cellular compartments such as ER (endoplasmic reticulum) and Golgi apparatus cleaved by the so-called β- and γ-secretases, whereby mainly Aβ42 is formed (Wild-Bode et al., 1997). In the Trans Golgi network (TGN), in the vesicles generated by the TGN be pinched off and migrate to the cell membrane, or directly on the cell membrane presumably the Aβ40 is formed by the activity of the same or similar proteases (Thinakaran et al., 1996). APP that does not process in the secretory metabolic pathway can then get into the endosomal / lysosomal system via endocytosis and be degraded to Aβ there or completely (Koo and Squazzo, 1994).

Um die Substratkonzentration in denjenigen zellulären Kompartimenten zu erhöhen, in denen die Aβ42 Bildung stattfindet, und um die Identifizierung von unspezifischen Inhibitoren, wie z. B. Transport-Inhibitoren auszuschließen, wurde an das γ-Sekretase Substrat, das Aβ-KKK/Gal4 Fusionsprotein, eine ER Retention-Signalsequenz gehängt.In order to increase the substrate concentration in those cellular compartments, in to which Aβ42 formation takes place and to identify non-specific ones Inhibitors, such as B. Exclude transport inhibitors, was to the γ-secretase Substrate that hangs the Aβ-KKK / Gal4 fusion protein, an ER retention signal sequence.

Beispiel 4 - Charakterisierung der transfizierten Zellinien für den HTS (siehe Abb. 4)Example 4 - Characterization of the transfected cell lines for the HTS (see Fig. 4) A) Expression des Aβ-KKK/Gal4 SubstratsA) Expression of the Aβ-KKK / Gal4 substrate

Eine größere Anzahl verschiedener doppelt stabiler H4 Zellklone wurde hergestellt und auf die Expression des Aβ-KKK/Gal4 Substratproteins hin untersucht. Zellextrakte wurden nach Standardmethoden hergestellt, die Proteine in einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferriert. Das Fusionsprotein wurde mit einem primären Antikörper gegen das Gal4 (Clontech; 1 : 5000) sowie mit einem sekundären 'Horseradish-Peroxidase'-gekoppelten Antikörper (Amersham; 1 : 6000) durch Chemolumineszenz nachgewiesen. A large number of different double-stable H4 cell clones were produced and opened the expression of the Aβ-KKK / Gal4 substrate protein was examined. Cell extracts were made Produced according to standard methods, the proteins in a 10% SDS polyacrylamide gel separated and transferred to a PVDF membrane. The fusion protein was with a primary antibody against Gal4 (Clontech; 1: 5000) as well as with a secondary one 'Horseradish peroxidase' coupled antibody (Amersham; 1: 6000) by Chemiluminescence detected.  

Exemplarisch wird hier die Expression des Fusionsproteins in den Zellklonen Aβ-KKK- ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) sowie in den Zellklonen Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) gezeigt. Hingegen konnte in den untransfizierten H4 Zellen (u. t.) und in den H4-Luc53 Zellen (luc53), die nur mit dem Reporterkonstrukt Gal4dbd-Luc (Gal4-DNA- Bindungsdomäne/Luziferase; engl. Luziferase) transfiziert wurden, keine Expression nachgewiesen werden.Exemplary here is the expression of the fusion protein in the cell clones Aβ-KKK-ER / 40, 59 and 65 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER retention signal) and in the cell clones Aβ-KKK / 40 and 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER retention signal). Could, however, in the untransfected H4 cells (ut) and in the H4-Luc53 cells (luc53), only with the reporter construct Gal4DBD-Luc (Gal4 D NA- B indungs d omäne / luciferase; Engl. Luciferase) were transfected, no Expression can be demonstrated.

B) Bestimmung der Luziferase-Expression mittels Western BlotB) Determination of luciferase expression using Western blot

Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) sowie die Zellklone Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurden auf die Expression der Luziferase hin untersucht. Zellextrakte wurden nach Standardmethoden hergestellt, die Proteine in einem 10%igen SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferiert. Die Luziferase wurde mit einem primären Antikörper (Europa) in einer 1 : 100 Verdünnung sowie mit einem sekundären 'Horseradish-Peroxidase'-gekoppelten Antikörper (Amersham; 1 : 6000) durch Chemolumineszenz nachgewiesen.The cell clones Aβ-KKK-ER / 40, 59 and 65 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER Retention signal) and the cell clones Aβ-KKK / 40 and 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER retention signal) were examined for the expression of the luciferase. Cell extracts were produced according to standard methods, the proteins in a 10% SDS Polyacrylamide gel separated and transferred to a PVDF membrane. The luciferase was with a primary antibody (Europe) in a 1: 100 dilution and with a secondary 'Horseradish peroxidase' coupled antibody (Amersham; 1: 6000) Chemiluminescence detected.

In allen doppelt stabilen Zellklonen, nicht aber in den untransfizierten H4 (u. t.) sowie den H4-Luc53 Zellen (luc53) konnte die Luziferase-Expression nachgewiesen werden. Als Positivkontrolle wurden H4 Zellen mit den unterschiedlichen Substraten (lösliches Gal4 [sol. gal4], Aβ-KKK/Gal4 und Aβ-KKK-ER/Gal4) und dem Reporterkonstrukt Gal4dbd- Luc (Gal4-DNA-Bindungsdomäne/Luziferase; engl. Luziferase) ko-transfiziert. Auch bei diesen transienten Transfektionen konnte die Luziferase in den H4 Zellen nachgewiesen werden.Luciferase expression was detected in all doubly stable cell clones, but not in the untransfected H4 (ut) and the H4-Luc53 cells (luc53). As a positive control H4 cells with the different substrates were (soluble Gal4 [sol. Gal4] Aβ-KKK / Gal4 and Aβ-KKK-ER / Gal4) and the reporter construct Gal4dbd- Luc (Gal4 D NA- B indungs d omäne / luciferase ; English Luciferase ) co-transfected. The luciferase in the H4 cells could also be detected in these transient transfections.

C) Bestimmung der Luziferase Expression mittels enzymatischem NachweisC) Determination of the luciferase expression by means of enzymatic detection

Der Expressionslevel der Luziferase in den Zellidonen Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) sowie in den Zellklonen Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurde auch mittels enzymatischer Aktivitätsbestimmung (SteadyGlo, Promega) untersucht. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers (Promega) durchgeführt. The expression level of luciferase in the cell idons Aβ-KKK-ER / 40, 59 and 65 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER retention signal) and in the cell clones Aβ-KKK / 40 and 52 (Substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER retention signal) was also enzymatic Activity determination (SteadyGlo, Promega) examined. The luciferase assay was accurate according to the manufacturer (Promega).  

In allen doppelt stabilen Zellklonen, nicht aber in den untransfizierten H4 (H4) sowie in den H4-Luc53 Zellen (luc53) konnte Luziferase-Aktivität nachgewiesen werden. In diesem Versuch wurde das Signal nicht auf die Proteinmenge bezogen.In all doubly stable cell clones, but not in the untransfected H4 (H4) and in the H4-Luc53 cells (luc53) could detect luciferase activity. In this In the experiment, the signal was not related to the amount of protein.

D) Bestimmung der Luziferase Expression mittels enzymatischem Nachweis.D) Determination of the luciferase expression by means of enzymatic detection.

In den beiden Zellklonen Aβ-KKK-ER/59 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) und Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurde die Luziferase-Aktivität bestimmt. Der Luziferase Assay (SteadyGlo, Promega) wurde exakt nach Angaben des Herstellers (Promega) durchgeführt.In the two cell clones Aβ-KKK-ER / 59 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER Retention signal) and Aβ-KKK / 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER retention signal) the luciferase activity was determined. The Luciferase Assay (SteadyGlo, Promega) was carried out exactly according to the manufacturer (Promega).

In allen doppelt stabilen Zellklonen, nicht aber in den untransfizierten H4 (H4) sowie in den H4-Luc53 (luc53) Zellen konnte Luziferase-Aktivität nachgewiesen werden. In diesem Versuch wurde das Signal auf die Proteinmenge bezogen. Die Unterschiede in der Signalintensität zwischen den beiden Zellklonen korreliert mit dem Expressionslevel des Substrats (siehe A).In all doubly stable cell clones, but not in the untransfected H4 (H4) and in the H4-Luc53 (luc53) cells were able to detect luciferase activity. In this Experiment, the signal was related to the amount of protein. The differences in the Signal intensity between the two cell clones correlates with the expression level of the Substrate (see A).

Beispiel 5Example 5 Bestimmung der Level an egtrazellulärem Aβ40 und Aβ42 in den transfizierten HTS Testzellinien (siehe Abb. 5)Determination of the levels of egtracellular Aβ40 and Aβ42 in the transfected HTS test cell lines (see Fig. 5)

Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) sowie die Zellklone Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurden auf Level an extrazellulärem Aβ40 und Aβ42 hin untersucht. Zu den konfluenten Zellen wurde frisches Medium hinzugegeben und diese für weitere 16 h inkubiert. Das Medium wurde nach der Inkubation abgenommen, und die Konzentration an Aβ40 und Aβ42 in einem quantitativen ELISA (Steiner et al., 1998) bestimmt. Als Kontrolle wurden untransfizierte H4 Zeilen verwendet, und die Konzentration an sekretiertem Aβ40 und Aβ42 als 100% gesetzt.The cell clones Aβ-KKK-ER / 40, 59 and 65 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER Retention signal) and the cell clones Aβ-KKK / 40 and 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER retention signal) were examined for levels of extracellular Aβ40 and Aβ42. Fresh medium was added to the confluent cells and this was continued for a further 16 h incubated. The medium was removed after the incubation and the concentration on Aβ40 and Aβ42 determined in a quantitative ELISA (Steiner et al., 1998). As Control, untransfected H4 lines, and concentration were used secreted Aβ40 and Aβ42 set as 100%.

Die Level an extrazellulärem Aβ42 in den Zellklonen Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 waren geringfügig erhöht, kein Unterschied konnte allerdings für die Menge an sekretiertem Aβ40 in diesen Klonen festgestellt werden. Für die Zellklone Aβ-KKK/40 und 52 war weder für Aβ40 noch für Aβ42 eine höhere Konzentration nachzuweisen.The levels of extracellular Aβ42 in cell clones Aβ-KKK-ER / 40, 59 and 65 were slightly increased, but no difference could be made for the amount of Aβ40 secreted are found in these clones. For the cell clones Aβ-KKK / 40 and 52 was neither for Aβ40 to detect a higher concentration for Aβ42.

Beispiel 6Example 6 BFA Effekt in den HTS Testzellinien Aβ-KKK-ER/59 und Aβ-KKK/52. (siehe Abb. 6)BFA effect in the HTS test cell lines Aβ-KKK-ER / 59 and Aβ-KKK / 52. (see Fig. 6)

Zellen der Klone Aβ-KKK-ER/59 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) und Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurden für 6 h mit unterschiedlichen Konzentrationen von Brefeldin A (BFA) behandelt. Als Kontrolle wurden unbehandelte Zellen verwendet.Cells from clones Aβ-KKK-ER / 59 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER retention signal) and Aβ-KKK / 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER retention signal) were mixed for 6 h different concentrations of Brefeldin A (BFA) treated. As a control untreated cells are used.

A) Luziferase-TestA) Luciferase test

Die Luziferase wurde mittels enzymatischer Aktivitätsbestimmung nachgewiesen. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega) durchgeführt. Im Zellklon Aβ-KKK/52, nicht aber in dem Zellklon Aβ-KKK-ER/59 zeigte sich ein deutlicher BFA Effekt. Eine Erhöhung der BFA Konzentration führt zu einer verstärkten Aβ Bildung im ER (Wild-Bode et al., 1997) und damit zu einem Anstieg des Luziferasesignals.The luciferase was determined by means of enzymatic activity determination proven. The luciferase assay was made exactly according to the manufacturer's instructions (SteadyGlo, Promega). In the cell clone Aβ-KKK / 52, but not in the cell clone Aβ-KKK-ER / 59 showed a clear BFA effect. An increase in the BFA Concentration leads to increased Aβ formation in the ER (Wild-Bode et al., 1997) and thus an increase in the luciferase signal.

B) VitalitätstestB) vitality test

Eine mögliche toxische Wirkung des BFA (in unterschiedlichen Konzentrationen) auf die Zellen wurde durch ein Alamar Blue-Test (s. u.) untersucht, der parallel zum Luziferase-Test durchgeführt wurde. Über den gesamten Konzentrationsbereich hinweg war kein Vitalitätsverlust festzustellen.A possible toxic effect of the BFA (in different Concentrations) on the cells was examined by an Alamar Blue test (see below), which was carried out in parallel with the luciferase test. Over the whole No loss of vitality was found across the concentration range.

Alamar Blue Messung (Zytotoxizitätsbestimmung)Alamar Blue measurement (cytotoxicity determination) Vorbereitungpreparation

Alamar Blue (Fa. Biosource International, VE = 100 ml, Cat. Nr. DAL 1100 (AL-01-100)) wird sterilfiltriert. Die Aussaat der Zellen und Substanzinkubation erfolgt wie in Beispiel 1.Alamar Blue (Fa.Biosource International, pack = 100 ml, Cat.No.DAL 1100 (AL-01-100)) is sterile filtered. The cells are sown and the substance incubated as in Example 1.

Die Alamar Blue Inkubation erfolgt parallel zum Luziferase-Test.The Alamar Blue incubation is carried out in parallel with the luciferase test.

Vorgehensweisemethod

Alamar blue wird mit Vollmedium (DMEM m 4,5 g/l Glucose + 10% FCS + 1% Glutamin + 1% Pen/Strep) auf 5% verdünnt. Das Medium wird abgesaugt. Die Zellen werden 1 × mit Medium oder PBS gewaschen. Es werden 100 µl Alamar blue (5%) zugegeben (96 Well Platte) und die Platte 1 h bei 37° und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Die Fluorometrische Messung erfolgt bei einer Eingangswellenlänge von 544 nm, einer Emissionswellenlänge von 590 nm und einer Messzeit: von 0,3 s/well. Die Angaben erfolgen in Prozent der Kontrolle. Alamar blue is made with full medium (DMEM m 4.5 g / l glucose + 10% FCS + 1% glutamine + 1% pen / strep) diluted to 5%. The medium is suctioned off. The cells are 1 × with Medium or PBS washed. 100 µl Alamar blue (5%) are added (96 well Plate) and the plate was incubated for 1 h at 37 ° and 5% CO2 in the incubator. The Fluorometric measurement takes place at an input wavelength of 544 nm, one Emission wavelength of 590 nm and a measurement time of 0.3 s / well. The information is given as a percentage of control.  

Beispiel 7Example 7 Effekt der Presenilin (PS1 und PS2) Aspartatmutationen in den HTS Testzellinien Aβ-KKK-ER/59 und Aβ-KKK/52 (siehe Abb. 7)Effect of presenilin (PS1 and PS2) aspartate mutations in the HTS test cell lines Aβ-KKK-ER / 59 and Aβ-KKK / 52 (see Fig. 7)

Die Zellklone Aβ-KKK-ER/59 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) und Aβ- KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurden mit cDNAs transfiziert, die für PS1 oder PS2 kodierten und eine Aspartat(Asp)mutation (PS1-D385N oder PS2-D366A) trugen. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen mit Zeozin selektioniert, um Poolzellen zu erhalten.The cell clones Aβ-KKK-ER / 59 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER retention signal) and Aβ- KKK / 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER retention signal) were cDNAs transfected, which encoded PS1 or PS2 and an aspartate (Asp) mutation (PS1-D385N or PS2-D366A). 48 hours after transfection, the cells were filled with zeocin selected to get pool cells.

A) Effekt der PS (Asp) Mutanten in den Poolzetlen Aβ-KKK/52/D385N und Aβ- KKK/52/D366AA) Effect of the PS (Asp) mutants in the pool areas Aβ-KKK / 52 / D385N and Aβ- KKK / 52 / D366A

Der Expressionslevel der Luziferase in den Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) Poolzellen Pool-PS1mut (D385N) und Pool-PS2mut (D366A) wurde mittels enzymatischer Aktivitätsbestimmung untersucht. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega) durchgeführt. Eine deutliche Reduktion der Luziferase-Signals auf ungefähr 10% des Kontrollwertes konnte in beiden Poolzellen nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden die H4-Luc53 Zellen verwendet.The level of expression of the luciferase in the Aβ-KKK / 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER Retention signal) Pool cells Pool-PS1mut (D385N) and Pool-PS2mut (D366A) was investigated by means of enzymatic activity determination. The luciferase assay was accurate according to the manufacturer (SteadyGlo, Promega). A clear one Reduction of the luciferase signal to approximately 10% of the control value was possible in both Pool cells are detected. The H4-Luc53 cells were used as controls.

B) Effekt der PS (Asp) Mutanten in den Poolzellen Aβ-KKK-ER/59/D385N und Aβ- KKK-ER/59/D366AB) Effect of the PS (Asp) mutants in the pool cells Aβ-KKK-ER / 59 / D385N and Aβ- KKK-ER / 59 / D366A

Der Expressionslevel der Luziferase in den Aβ-KKK-ER/59 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) Poolzellen Pool-PS1mut (D385N) und Pool-PS2mut (D366A) wurde mittels enzymatischer Aktivitätsbestimmung untersucht. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega) durchgeführt. Eine Reduktion des Luziferase-Signals auf ~60% (PS1mut), bzw ~70% (PS2mut) der Kontrolle konnte in beiden Poolzellen nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden die H4-Luc53 Zellen verwendet.The level of expression of the luciferase in the Aβ-KKK-ER / 59 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER retention signal) Pool cells Pool-PS1mut (D385N) and Pool-PS2mut (D366A) was investigated by means of enzymatic activity determination. The luciferase assay was accurate according to the manufacturer (SteadyGlo, Promega). A reduction in Luciferase signal to ~ 60% (PS1mut), or ~ 70% (PS2mut) of the control could in be detected in both pool cells. As a control, the H4-Luc53 cells used.

C) Nachweis der Überexpression der PS (Asp) Mutanten in den jeweiligen ZellinienC) Detection of the overexpression of the PS (Asp) mutants in the respective cell lines

Die Poolzellen Aβ-KKK/52/D385N und D366A sowie die Poolzellen Aβ-KKK- ER/59/D385N und D366A wurden auf die Überexpression der jeweiligen Presenilin- Aspartatmutante hin mittels Western Blot Verfahren überprüft. Zellextrakte wurden nach Standardmethoden hergestellt, die Proteine in einem 12%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran transferiert. PS1 wurde mit einem polyklonalen Antikörper (5023; 1: 1000; Walter et al., 1997), PS2 mit einem monoklonalen Antikörper (BI.HF5C; 1.3000; Steiner et al. 1999b) nachgewiesen. Wie beschrieben (Steiner et al. 1999a; Wolfe et al. 1999) verhindern beide Aspartatmutationen die Proteolyse von PS Proteinen, so daß nur 'full length' PS nachgewiesen werden kann. Die Überexpression des exogenen PS führt zudem in allen Fällen zur deutlichen Reduktion des endogenen PS, ersichtlich durch die Abnahme an PS-C-terminalen Fragmenten (CTFs).The pool cells Aβ-KKK / 52 / D385N and D366A and the pool cells Aβ-KKK- ER / 59 / D385N and D366A were designed to overexpress the respective presenilin Mutant aspartate checked by Western blot method. Cell extracts were made after Standard methods made the proteins in a 12% SDS polyacrylamide gel separated and transferred to a PVDF membrane. PS1 was made with a polyclonal Antibody (5023; 1: 1000; Walter et al., 1997), PS2 with a monoclonal antibody  (BI.HF5C; 1.3000; Steiner et al. 1999b). As described (Steiner et al. 1999a; Wolfe et al. 1999) both aspartate mutations prevent the proteolysis of PS Proteins so that only 'full length' PS can be detected. The overexpression of the Exogenous PS also leads to a significant reduction in endogenous PS in all cases, evident from the decrease in PS-C-terminal fragments (CTFs).

Beispiel 8Example 8 Substanz A. (siehe Abb. 8)Substance A. (see Fig. 8)

A) Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ Bildung durch die Substanz A A) Concentration-dependent inhibition of Aβ formation by substance A

Substanz A Substance A

Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) sowie der Zellklon Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurden eingesetzt, um die inhibitorische Wirkung der Substanz A zu überprüfen. Konfluente Zellen wurde über Nacht mit unterschiedlichen Konzentrationen der Substanz A inkubiert. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega) durchgeführt.The cell clones Aβ-KKK-ER / 40, 59 and 65 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER Retention signal) and the cell clone Aβ-KKK / 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER Retention signal) were used to determine the inhibitory effect of substance A. check. Confluent cells were mixed overnight with different concentrations of the Incubated substance A. The luciferase assay was made exactly according to the manufacturer's instructions (SteadyGlo, Promega).

In allen Zellklonen inhibiert die Substanz A konzentrationsabhängig die Aβ Bildung, was durch die Abnahme des Luziferasesignals angezeigt wird.In all cell clones, substance A inhibits concentration formation of Aβ, depending on the concentration is indicated by the decrease in the luciferase signal.

B) Konzentrationsabhängige Inhibition der Aβ40 und Aβ42 Sekretion durch die Substanz AB) Concentration-dependent inhibition of Aβ40 and Aβ42 secretion by the Substance A

Die Substanz A war auch in einem zellulären Testsystem aktiv, in dem der extrazelluläre Gehalt an Aβ40 und Aβ42 bestimmt wurde, der von der U373 Zellinie (U373: ATCC No. HTB 14) sekretiert wurde. Diese Zellinie U373/APP751 ist eine Astrocytoma Zellinie, die menschliches APP751 überexpremiert und große Mengen an Aβ40 (~100 pg/ml/4 Stunden mit 5 × 107 Zellen in 15 ml Medium) und Aβ42 (~100 pg/ml/4 Stunden mit 5 × 107 Zellen in 15 ml Medium) sekretiert. Die Bestimmung erfolgt über ELISA (Steiner et al., 1998). Die Aβ40 Sekretion wurde durch die Substanz A in einer konzentrationsabhängigen Weise stark reduziert, wobei die Aβ42 Sekretion bei subinhibitorischen Dosen erhöht war und dann bei höheren Dosen ebenfalls inhibiert wurde.Substance A was also active in a cellular test system in which the extracellular content of Aβ40 and Aβ42 was determined, which was secreted by the U373 cell line (U373: ATCC No. HTB 14). This cell line U373 / APP751 is an astrocytoma cell line that overexpresses human APP751 and contains large amounts of Aβ40 (~ 100 pg / ml / 4 hours with 5 × 10 7 cells in 15 ml medium) and Aβ42 (~ 100 pg / ml / 4 hours) with 5 × 10 7 cells in 15 ml of medium). The determination is carried out via ELISA (Steiner et al., 1998). The Aβ40 secretion was greatly reduced by substance A in a concentration-dependent manner, the Aβ42 secretion being increased at subinhibitory doses and then also being inhibited at higher doses.

Beispiel 9Example 9 Substanz B (siehe Abb. 9)Substance B (see Fig. 9)

Wirkung der Substanz B auf die Aβ Bildung Effect of substance B on Aβ formation

Substanz B Substance B

Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 mit ER Retentionssignal) sowie die Zellklone Aβ-KKK/40 und 52 (Substrat Aβ-KKK/Gal4 ohne ER Retentionssignal) wurden eingesetzt, um die inhibitorische Wirkung der Substanz B zu überprüfen. Konfluente Zellen wurde über Nacht mit unterschiedlichen Konzentrationen der Substanz B inkubiert. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega) durchgeführt.The cell clones Aβ-KKK-ER / 40, 59 and 65 (substrate Aβ-KKK / Gal4 with ER Retention signal) and the cell clones Aβ-KKK / 40 and 52 (substrate Aβ-KKK / Gal4 without ER retention signal) were used to determine the inhibitory effect of substance B. check. Confluent cells were mixed overnight with different concentrations of the Incubated substance B. The luciferase assay was made exactly according to the manufacturer's instructions (SteadyGlo, Promega).

In keinem der Zellklone inhibiert die Substanz B konzentrationsabhängig die Aβ Bildung, was durch gleichbleibende Signalintensität der Luziferase angezeigt wird. In none of the cell clones does substance B inhibit Aβ formation depending on the concentration, which is indicated by the constant signal intensity of the luciferase.  

Beispiel 10Example 10 Substanz C (siehe Abb. 10)Substance C (see Fig. 10)

Wirkung der Substanz C auf die Aβ Bildung Effect of substance C on Aβ formation

Substanz C Substance C

Die Zellklone Aβ-KKK-ER/40, 59 und 65 (Substrat Aβ-KKK mit ER Retentionssignal) sowie der Zellklon Aβ-KKK/52 (Substrat Aβ-KKK ohne ER Retentionssignal) wurden eingesetzt, um die inhibitorische Wirkung der Substanz C zu überprüfen. Konfluente Zellen wurde über Nacht mit unterschiedlichen Konzentrationen der Substanz A inkubiert. Der Luziferase Assay wurde exakt nach Angaben des Herstellers (SteadyGlo, Promega) durchgeführt.The cell clones Aβ-KKK-ER / 40, 59 and 65 (substrate Aβ-KKK with ER retention signal) as well as the cell clone Aβ-KKK / 52 (substrate Aβ-KKK without ER retention signal) used to check the inhibitory effect of substance C. Confluent cells was incubated overnight with different concentrations of substance A. The Luciferase assay was carried out exactly according to the manufacturer's instructions (SteadyGlo, Promega) carried out.

In keinem der Zellklone inhibiert die Substanz C konzentrationsabhängig die Aβ Bildung, was durch gleichbleibende Signalintensität der Luziferase angezeigt wird. In none of the cell clones does substance C inhibit Aβ formation depending on the concentration, which is indicated by the constant signal intensity of the luciferase.  

Literaturliterature

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Claims (23)

1. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch Proteasen, die membranständige Substrate spalten, inhibieren können, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) man Zellen, die besagte Protease-Aktivität aufweisen sowie ein membran­ assoziiertes rekombinantes Fusionsprotein exprimieren, welches das Substrat der besagten Protease mit der spezifischen Spaltstelle für besagte Protease und einen Reporter umfasst, kultiviert,
  • b) diese Zellen mit einer Testsubstanz inkubiert,
  • c) man die Menge des abgespaltenen Reporters mißt und
  • d) der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.
1. A method for finding substances that can specifically inhibit proteases that cleave substrates in the membrane, characterized in that
  • a) cells which have said protease activity and which express a membrane-associated recombinant fusion protein which comprises the substrate of said protease with the specific cleavage site for said protease and a reporter are cultured,
  • b) these cells are incubated with a test substance,
  • c) one measures the amount of the reporter split off and
  • d) the value obtained is compared with the value obtained in the absence of the test substance.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen kultiviert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das die spezifische Spaltstelle der γ-Sekretase umfasst.2. The method according to claim 1, characterized in that cells are cultivated, the express a fusion protein that includes the specific cleavage site of the γ-secretase. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen kultiviert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das die spezifische Spaltstelle der Presenilinase umfasst.3. The method according to claim 1, characterized in that cells are cultivated, the express a fusion protein that includes the specific presenilinase cleavage site. 4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein Amyloid β umfaßt.4. The method according to any one of claims 1 to 2, characterized in that the Fusion protein includes amyloid β. 5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein ein Fragment von Amyloid β umfaßt.5. The method according to any one of claims 1 to 2, characterized in that the Fusion protein comprises a fragment of amyloid β. 6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein das Amyloid-Vorläufer-Protein oder ein Fragment davon umfaßt.6. The method according to any one of claims 1 to 2, characterized in that the Fusion protein comprising the amyloid precursor protein or a fragment thereof. 7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein Presenilin 1 oder ein Fragment davon umfaßt.7. The method according to any one of claims 1 and 3, characterized in that the Fusion protein Presenilin 1 or a fragment thereof. 8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein Presenilin 2 oder ein Fragment davon umfaßt.8. The method according to any one of claims 1 and 3, characterized in that the Fusion protein Presenilin 2 or a fragment thereof. 9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ein Hochdurchsatzmusterungstest ("high throughput screening") ist.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the The method is a high throughput screening test. 10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des abgespaltenen Reporters mit Luziferase, grün fluoreszierendem Protein oder einem Derivat davon, der sekretorischen alkalischen Phosphatase oder der β-Galaktosidase gemessen wird. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the amount the reporter split off with luciferase, green fluorescent protein or a Derivative thereof, the secretory alkaline phosphatase or the β-galactosidase is measured.   11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des abgespaltenen Reporters indirekt nachgewiesen wird.11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the Amount of the reporter split off is indirectly detected. 12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des abgespaltenen Reporters indirekt nachgewiesen wird, indem eine abgespaltene Reporterdomäne in den Nukleus wandert, dort an eine weitere Reporterdomäne eines Reporterkonstruktes bindet und die Expression des Reporters aktiviert wird.12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the Amount of reporter split off is indirectly detected by one cleaved reporter domain migrates to the nucleus, there to another Reporter domain of a reporter construct binds and the expression of the reporter is activated. 13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des abgespaltenen Reporters Gal4 indirekt nachgewiesen wird, indem Gal4 im Nukleus an die Gal4DNA-Bindungsdomäne eines weiteren Reporterkonstruktes bindet und die Expression von Luziferase aktiviert wird.13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the Amount of the rejected Gal4 reporter is indirectly detected by Gal4 in the Nucleus binds to the Gal4DNA binding domain of another reporter construct and the expression of luciferase is activated. 14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des abgespaltenen Reporters direkt nachgewiesen wird.14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the Amount of the reporter split off is detected directly. 15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen neuronalen oder glialen Ursprungs sind.15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the cells are of neural or glial origin. 16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen H4-Zellen sind.16. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that the cells H4 cells are. 17. Hochdurchsatzmusterungstest zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ- Sekretase inhibieren können, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) man H4 Zellen, die besagte γ-Sekretase-Aktivität endogen aufweisen sowie das membran-assoziierte rekombinante Fusionsprotein Aβ-KKK/Gal4 exprimieren, kultiviert,
  • b) diese Zellen mit einer Testsubstanz inkubiert,
  • c) man mittels der Höhe der Luziferaseexpression die Menge des abgespaltenen und an die Gal4-DNA Bindungsdomäne des Luziferasekonstruktes bindenden Transaktivators Gal4 mißt und
  • d) der erhaltene Wert mit dem Wert verglichen wird, der in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wird.
17. High throughput patterning test for finding substances which can specifically inhibit γ-secretase, characterized in that
  • a) one cultivates H4 cells which have said γ-secretase activity endogenously and which express the membrane-associated recombinant fusion protein Aβ-KKK / Gal4,
  • b) these cells are incubated with a test substance,
  • c) the amount of the cleaved transactivator Gal4, which binds to the Gal4-DNA binding domain of the luciferase construct, is measured by means of the level of luciferase expression, and
  • d) the value obtained is compared with the value obtained in the absence of the test substance.
18. Verwendung eines Verfahrens oder Hochdurchsatzmusterungstestes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch γ-Sekretase inhibieren können. 18. Use of a method or high throughput patterning test according to one of the Claims 1 to 17 for finding substances which specifically inhibit γ-secretase can.   19. Verwendung eines Verfahrens oder Hochdurchsatzmusterungstestes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zum Auffinden von Substanzen, die spezifisch Presenilinase inhibieren können.19. Use of a method or high throughput patterning test according to one of the Claims 1 to 17 for finding substances that specifically presenilinase can inhibit. 20. Substanz auffindbar mit einem Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstest gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die proteolytische Spaltung eines γ-Sekretase-Substrats inhibiert.20. Substance can be found using a method or high throughput pattern test according to one of claims 1 to 17, characterized in that it specifically the inhibited proteolytic cleavage of a γ-secretase substrate. 21. Substanz auffindbar mit einem Verfahren oder Hochdurchsatzmusterungstest gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die proteolytische Spaltung eines Presenilinase-Substrats inhibiert.21. Substance detectable using a method or high throughput screening test according to one of claims 1 to 17, characterized in that it specifically the inhibited proteolytic cleavage of a presenilinase substrate. 22. Verwendung einer Substanz gemäß Anspruch 20 oder 21 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer-Krankheit.22. Use of a substance according to claim 20 or 21 for the manufacture of a Medicament for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular the Alzheimer's disease. 23. Pharmazeutische Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Substanz gemäß Anspruch 20 oder 21 sowie übliche pharmazeutische Trägersubstanzen enthält.23. Pharmaceutical formulation, characterized in that it is a substance according to Claim 20 or 21 and customary pharmaceutical carriers.
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