BR112021016149A2 - Terapias de combinação e estratificação de pacientes com anticorpos biespecíficos anti-egfr/c-met - Google Patents

Terapias de combinação e estratificação de pacientes com anticorpos biespecíficos anti-egfr/c-met Download PDF

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Smruthi Vijayaraghavan
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Janssen Biotech, Inc.
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Abstract

terapias de combinação e estratificação de pacientes com anticorpos biespecíficos antiegfr/c-met. a presente invenção refere-se a terapias de combinação e estratificação de pacientes com anticorpos biespecíficos anti-egfr/c-met.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIAS DE COMBINAÇÃO E ESTRATIFICAÇÃO DE PACIENTES COM ANTI- CORPOS BIESPECÍFICOS ANTI-EGFR/C-MET".
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a terapias de combinação e estratificação de pacientes com anticorpos biespecíficos anti-EGFR/c- Met.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] Este pedido contém uma Listagem de Sequências apresen- tada via EFS-Web, cujo teor total está aqui incorporado por referência. O arquivo de texto ASCII, criado em 13 de fevereiro de 2020, é nomeado JBI6051WOPCT1ST25.txt e tem 19 quilobytes de tamanho.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] As funções individuais tanto de EGFR quanto de c-Met em câncer estão bem estabelecidas, tornando estes alvos atrativos para te- rapia de combinação. Ambos os receptores sinalizam através das mes- mas vias de sobrevivência e antiapoptótica (ERK e AKT); dessa forma, a inibição do par em combinação pode limitar o potencial para ativação de via compensatória otimizando assim a eficácia total.
[0004] A recidiva ou resistência a terapêuticas existentes é comum. Portanto, existe uma necessidade por terapêuticas ou combinações de te- rapêuticas e biomarcadores de estratificação de pacientes aprimoradas para desenvolver um tratamento mais eficaz de uma doença, como câncer positivo para EGFR ou c-Met.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] A divulgação fornece um método de tratamento de um indi- víduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met, que compre- ende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo biespecífico isolado do receptor do fator de crescimento antiepi- dérmico (EGFR)/receptor do fator de crescimento de hepatócito (c-Met)
ao indivíduo em combinação com um agente que acentua a atividade de macrófago no indivíduo.
[0006] A divulgação também fornece um método de diagnóstico e tratamento de um indivíduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met que é responsivo ao tratamento com um anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met, que compreende: fornecer uma amostra biológica do indi- víduo; medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; diagnosticar o indivíduo que tem o câncer que expressa EGFR ou c-Met que é responsivo ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou de monócitos da amos- tra biológica são mais altos que um valor-limite; e administrar ou fornecer a administração do anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo diagnosticado como responsivo ao tratamento com o anticorpo anti- EGFR/c-Met.
[0007] A divulgação também fornece um método de tratamento de um indivíduo suspeito de ter ou que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, que compreende: determinar que o indivíduo tem teores de macrófagos ou monócitos maiores que um valor-limite; e administrar ou fornecer a ad- ministração do anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo determinado como tendo teores de macrófagos ou monócitos maiores que o valor-limite.
[0008] A divulgação também fornece um método de prevenção da resposta de um indivíduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c- Met para o tratamento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, que compreende fornecer uma amostra biológica do indivíduo; medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; prever o indiví- duo como um respondedor quando os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica são mais altos que um valor-limite.
[0009] A divulgação também fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met que é responsivo ao tratamento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c- Met, que compreende fornecer uma amostra biológica do indivíduo; me- dir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; tratar o indivíduo com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met quando os teo- res de macrófagos ou de monócitos da amostra biológica são mais altos que um valor-limite.
[0010] A divulgação também fornece um método para determinar se um indivíduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met é respon- sivo ao tratamento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met e de- cidir se deve tratar o indivíduo, que compreende: fornecer uma amostra biológica do indivíduo; medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; diagnosticar o indivíduo com o câncer que expressa EGFR ou c-Met em resposta ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou monócitos da amos- tra biológica são mais altos que um valor-limite ou diagnosticar o indivíduo com o câncer que expressa EGFR ou c-Met como não responsivo ao tra- tamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou de monócitos da amostra biológica estão abaixo do va- lor-limite; e administrar o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ao indiví- duo diagnosticado como responsivo ao tratamento com o anticorpo bies- pecífico anti-EGFR/c-Met ou abster-se de administrar o anticorpo biespe- cífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo diagnosticado como não responsivo ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0011] A Figura 1 mostra a inibição mediada por JNJ-372 da proli- feração de células NCI-H1975 marcadas com NucLight Red na pre- sença de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs - "pe- ripheral blood mononuclear cell") nas concentrações indicadas de JNJ-
372 em culturas de até 120 horas, conforme medido com o uso de con- tagem de células de NucLight Red/mm2.
[0012] A Figura 2 mostra o efeito mediado por JNJ-372 sobre a proliferação de células NCI-H1975 marcadas com NucLight Red na au- sência de PBMCs nas concentrações indicadas de JNJ-372 em cultu- ras de até 120 horas, conforme medido com o uso de contagem de células de NucLight Red/mm2.
[0013] A Figura 3 mostra a inibição mediada por JNJ-372, JNJ-
372.IgG2sigma, JNJ-372.NF ou controle de isótipo de proliferação de células NCI-H1975 marcadas com NucLight Red na presença de PBMCs. A proliferação não foi inibida na ausência de PBMCs ou pelo controle de isótipo ou por um efetor de Fc silencioso JNJ-
372.IgG2sigma. JNJ-372. NF cultivado na presença de PBMCs inibi- ram parcialmente a proliferação. Iso: controle de isótipo; IgG2s: JNJ-
372.IgG2sigma; EGFRxMet NF: JNJ-372.NF.
[0014] A Figura 4 mostra a apoptose mediada por JNJ-372, JNJ-
372.IgG2sigma, JNJ-372.NF ou controle de isótipo de células NCI- H1975 marcadas com NucLight Red na presença de PBMCs após 48 horas de cultura. A apoptose não foi induzida na ausência de PBMCs ou pelo controle de isótipo ou de um efetor de Fc silencioso JNJ372.IgG2sigma. JNJ-372.NF cultivado na presença de apoptose parcialmente mediada por PBMCs. Iso: Controle de isótipo; IgG2s: JNJ-372.IgG2sigma; EGFRxMet NF: JNJ-372.NF.
[0015] A Figura 5 mostra a imagem de eletroforese com base capi- lar (Simple Western com o uso de PeggySue) mostrando proteínas de EGFR, c-Met e pEGFR em amostras de NCI-H1975 tratadas com con- trole de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs por 4, 24, 48 ou 72 horas conforme indicado na figura. A pre- sença de PBMCs potencializou a regulação negativa mediada por JNJ- 372 de proteínas de EGFR e c-Met e a inibição de pEGFR.
[0016] A Figura 6 mostra a quantidade relativa de EGFR (normalizada para actina de controle de carregamento) em amostras de NCI-H1975 tra- tadas com controle de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas na presença ou au- sência de PBMCs por 4, 24, 48 ou 72 horas conforme indicado na figura. A presença de PBMCs potencializou a regulação negativa mediada por JNJ-372 de EGFR.
[0017] A Figura 7 mostra a quantidade relativa de pEGFR (pY1173) (normalizada para actina de controle de carregamento) em amostras de NCI-H1975 tratadas com controle de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs por 4, 24, 48 ou 72 horas, conforme in- dicado na figura. A presença de PBMCs potencializou a regulação nega- tiva mediada por JNJ-372 de pEGFR.
[0018] A Figura 8 mostra a quantidade relativa de c-Met (normalizada para actina de controle de carregamento) em amostras de NCI-H1975 tra- tadas com controle de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas na presença ou au- sência de PBMCs por 4, 24, 48 ou 72 horas conforme indicado na figura. A presença de PBMCs potencializou a regulação negativa mediada por JNJ-372 de c-Met.
[0019] A Figura 9 mostra a imagem de eletroforese capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) mostrando proteínas EGFR, c-Met e pEGFR em amostras NCI-H1975 tratadas com controle de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs de sete doadores diferentes conforme indicado na figura.
[0020] A Figura 10 mostra a quantidade relativa de EGFR (normali- zada para actina de controle de carregamento) em amostras de NCI- H1975 tratadas com controle de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs de sete doadores diferentes, conforme indicado na figura.
[0021] A Figura 11 mostra a quantidade relativa de pEGFR (pY1173) (normalizada para actina de controle de carregamento) em amostras de NCI-H1975 tratadas com controle de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs de sete doadores diferentes, conforme indicado na figura.
[0022] A Figura 12 mostra a quantidade relativa de c-Met (normali- zada para actina de controle de carregamento) em amostras de NCI- H1975 tratadas com controle de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs de sete doadores diferentes conforme indicado na figura.
[0023] A Figura 13 mostra a correlação entre a porcentagem (%) de monócitos na amostra de PBMC de cada doador e a porcentagem (%) de alteração na inibição de EGFR com JNJ-372 na presença de PBMCs (alteração em potência de dez relativa sobre nenhuma PBMC), conforme medido pela quantidade de proteína de EGFR (normalizada para actina de controle de carregamento) em células NCI-H1975.
[0024] A Figura 14 mostra a correlação entre a porcentagem (%) de monócitos na amostra de PBMC de cada doador e a porcentagem (%) de alteração na inibição de pEGFR Y1173 com JNJ-372 na pre- sença de PBMCs (alteração em potência de dez relativa sobre nenhuma PBMC), conforme medido pela quantidade de proteína de pEGFR (nor- malizada para actina de controle de carregamento) em células NCI- H1975.
[0025] A Figura 15 mostra a correlação entre a porcentagem (%) de monócitos na amostra de PBMC de cada doador e a porcentagem (%) de alteração na inibição de c-Met com JNJ-372 na presença de PBMCs (alte- ração em potência de dez relativa sobre nenhuma PBMC), conforme me- dido pela quantidade de proteína de c-Met (normalizada para actina de controle de carregamento) em células NCI-H1975.
[0026] A Figura 16 mostra a imagem de eletroforese com base ca- pilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detectando os teores de proteína de EGFR, c-Met e pEGFR em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs depletadas de células NK ou PBMCs (mono) depletadas de monócitos de um doador conforme indicado na figura.
[0027] A Figura 17 mostra a quantidade relativa de EGFR (norma- lizada para actina de controle de carregamento) em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs depletadas de células NK ou PBMCs (mono) depletadas de monócitos de um doador conforme indicado na figura.
[0028] A Figura 18 mostra a quantidade relativa de pEGFR (pY1173) (normalizada para actina de controle de carregamento) em NCI-H1975 tratada com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivada du- rante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs depletadas de cé- lulas NK ou PBMCs (mono) depletadas de monócitos de um doador conforme indicado na figura.
[0029] A Figura 19 mostra a quantidade relativa de c-Met (norma- lizada para actina de controle de carregamento) em NCI-H1975 trata- das com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs depletadas de células NK ou PBMCs (mono) depletadas de monócitos de um doador conforme indi- cado na figura.
[0030] A Figura 20 mostra a imagem de eletroforese capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detectando os teores de proteína de EGFR, c-Met e pEGFR em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou controle de isótipo por 48 horas na presença ou ausência de PBMCs, células NK isoladas, monócitos isolados, macrófa- gos M1 diferenciados por MCSF ou macrófagos M1 diferenciados por GMCSF do mesmo doador conforme indicado na figura.
[0031] A Figura 21 mostra a quantidade relativa de EGFR (normali- zada para actina de controle de carregamento) em células NCI-H1975 tra- tadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou controle de isótipo durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs, monócitos, macrófagos M1 diferenciados com MCSF ou macrófagos M1 diferenciados com GMCSF isolados do mesmo doador conforme indicado na figura.
[0032] A Figura 22 mostra a quantidade relativa de pEGFR (pY1173) (normalizada para actina de controle de carregamento) em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou con- trole de isótipo por 48 horas na presença ou ausência de PBMCs, mo- nócitos, macrófagos M1 diferenciados com MCSF ou macrófagos M1 diferenciados com GMCSF isolados do mesmo doador conforme indi- cado na figura.
[0033] A Figura 23 mostra a quantidade relativa de c-Met (normali- zada para actina de controle de carregamento) em células NCI-H1975 tra- tadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou controle de isótipo durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs, monócitos, macrófagos M1 diferenciados com MCSF ou macrófagos M1 diferenciados com GMCSF isolados do mesmo doador conforme indicado na figura.
[0034] A Figura 24 mostra a imagem de eletroforese com base ca- pilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detectando os teores de proteína de EGFR, c-Met e pEGFR em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou controle de isótipo e cultivadas na presença de macrófagos M1 (M1) ou macrófagos M2a (M2a) con- forme indicado na figura. ISO: controle de isótipo, 372: JNJ-372, IgG2sigma: JNJ-372.IgG2sigma.
[0035] A Figura 25 mostra a imagem de eletroforese com base ca- pilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detectando os teores de proteína de EGFR, c-Met e pEGFR em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de macrófagos M2c (M2c) conforme indicado na figura. ISO: controle de isótipo, 372: JNJ-372, IgG2sigma: JNJ-372.IgG2sigma.
[0036] A Figura 26 mostra a imagem de eletroforese com base capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detectando os teores de prote- ína de EGFR, c-Met, pEGFR e pMet em células SNU-5 tratadas com JNJ- 372 ou controle de isótipo e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura.
[0037] A Figura 27 mostra a quantidade relativa de EGFR (norma- lizada para actina de controle de carregamento) em células SNU-5 tra- tadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura.
[0038] A Figura 28 mostra a quantidade relativa de pEGFR (pY1173) (normalizada para actina de controle de carregamento) em células SNU-5 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultiva- das durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura.
[0039] A Figura 29 mostra a quantidade relativa de c-Met (norma- lizada para actina de controle de carregamento) em amostras de cul- tura de células SNU-5 cultivadas durante 48 horas na presença ou au- sência de JNJ-372, controle de isótipo ou PBMCs conforme indicado na figura.
[0040] A Figura 30 mostra a quantidade relativa de pMet (pY1234/1235) (normalizada para carregamento de actina) em células SNU-5 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas du- rante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura.
[0041] A Figura 31 mostra volumes de tumor de tumores xenoen- xertados de linhagem de células H1975 injetados subcutaneamente tratados com 10 mg/kg de controle de isótipo (n=8), JNJ-372 (n=8) ou
JNJ-372.IgG2sigma (IgG2σ na figura) (n=8) durante 3 semanas duas vezes por semana (BIW - "twice a week"). A % de TGI foi calculada no dia 24.
[0042] A Figura 32 mostra volumes de tumor de tumores de xeno- enxerto de linhagem de células SNU5 injetados subcutaneamente tra- tados com veículo (PBS) (n=8), 5 mg/kg de JNJ-372 (n=8) ou JNJ-
372.IgG2sigma (IgG2σ na Figura) (n=8) durante 3 semanas BIW. A % de TGI foi calculada no dia 34. Todos os dados representados como média ± E.P.M (desvio padrão da média) dentro de cada grupo de tra- tamento.
[0043] A Figura 33 mostra células H1975 carregadas com BATDA tratadas por 2 horas com JNJ-372 na presença de PBMCs, células NK ou monócitos isolados do mesmo doador em razões de E:T de 25:1, 5:1, e 5:1, respectivamente, e lise de ADCC medida pela liberação de európio.
[0044] A Figura 34 mostra o número de macrófagos associados ao tumor usando análise de citometria de fluxo multicolorida de amostras de tumor H1975 isoladas 24 horas após duas doses de 10 mg/kg de isótipo, tratamento com JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma (n=5 camun- dongos/tratamento) para examinar a porcentagem (%) de macrófagos (CD45+ CD11b+ Ly6G- Ly6C- F4/80+) dentro do tumor após a depleção com anticorpo CSF1R anticamundongo.
[0045] A Figura 35 mostra volumes de tumor de tumores xenoen- xertados de linhagem de células H1975 injetados subcutaneamente tra- tados com 10 mg/kg de JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou isótipo (n=8 camundongos por grupo de tratamento) durante 3 semanas BIW em combinação com CSF1R anticamundongo ou seu controle de isótipo três vezes por semana para esvaziar os macrófagos. A % de TGI foi calculada no dia 21 e ****, valor de p < 0,0001 foi calculado por ANOVA de 2 vias no dia 17 (quando todos os grupos tinham todos os camun- dongos no estudo)
[0046] A Figura 36 mostra gráficos de barras que representam a alteração em potência de dez relativa das quimiocinas e citocinas indi- cadas produzidas por células H1975 após tratamento de 4 horas com JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma em relação ao isótipo na presença de PBMCs.
[0047] A Figura 37 mostra gráficos de barras que representam a alteração em potência de dez relativa das quimiocinas e citocinas indi- cadas produzidas por células H1975 após tratamento de 72 horas com JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma em relação ao isótipo na presença de PBMCs.
[0048] A Figura 38 mostra a alteração em potência de dez relativa da produção de MCP-1 em relação ao produto não tratado em células H1975 tratadas com uma faixa de dose indicada de JNJ-372 durante 4 horas na presença de PBMCs (E:T=10:1) (primeiras 5 barras da es- querda), células NK (barras 6 a 10 da esquerda) ou monócitos (primei- ras 5 barras da direita) na razão entre efetor:alvo de 5:1 (E:T=5:1).
[0049] A Figura 39 mostra as curvas de resposta à dosagem da análise de citocina com base em MSD medindo a alteração em potência de dez (em comparação com os controles não tratados) em teores de MCP-3 mediante o tratamento de células H1975 com JNJ-372 na pre- sença de PBMCs, células NK ou monócitos. A linha pontilhada cinza indica o valor do controle não tratado.
[0050] A Figura 40 mostra a alteração em potência de dez relativa de produção de IL1-RA (ILRA mostrada na figura) em relação ao pro- duto não tratado em células H1975 tratadas com uma faixa de dose indicada de JNJ-372 durante 4 horas na presença de PBMCs (E:T=10:1) (primeiras 5 barras da esquerda), células NK (barras 6 a 10 da esquerda) ou monócitos (primeiras 5 barras da direita) na razão en- tre efetor:alvo de 5:1 (E:T=5:1).
[0051] A Figura 41 mostra as curvas de resposta à dosagem da análise de citocina com base em MSD medindo a alteração em potência de dez (em comparação com os controles não tratados) em teores de MIP-1β mediante o tratamento de células H1975 com JNJ-372 na pre- sença de PBMCs, células NK ou monócitos. A linha pontilhada cinza indica o valor do controle não tratado.
[0052] A Figura 42 mostra as curvas de resposta à dosagem da análise de citocina com base em MSD medindo a alteração em potência de dez (em comparação com os controles não tratados) em teores de MIP-1β mediante o tratamento de células H1975 com JNJ-372, JNJ-
372.IgG2sigma (IgG2σ na Figura) ou controle de isótipo na presença de macrófagos M1 (macs M1). A linha pontilhada cinza indica o valor do controle não tratado.
[0053] A Figura 43 mostra as curvas de resposta à dosagem da análise de citocina com base em MSD medindo a alteração em potência de dez (em comparação com os controles não tratados) em teores de MIP-1β mediante o tratamento de células H1975 com JNJ-372, JNJ-
372.IgG2sigma (IgG2σ na Figura) ou controle de isótipo na presença de macrófagos M2 (macs M2). A linha pontilhada cinza indica o valor do controle não tratado.
[0054] A Figura 44 mostra as curvas de resposta à dosagem da análise de citocina com base em MSD medindo a alteração em potência de dez (em comparação com os controles não tratados) em teores de MIP-1 mediante o tratamento de células H1975 com JNJ-372, JNJ-
372.IgG2sigma (IgG2σ na Figura) ou controle de isótipo na presença de macrófagos M1 (macs M1). A linha pontilhada cinza indica o valor do controle não tratado.
[0055] A Figura 45 mostra as curvas de resposta à dosagem da análise de citocina com base em MSD medindo a alteração em potência de dez (em comparação com os controles não tratados) em teores de MIP-1 mediante o tratamento de células H1975 com JNJ-372, JNJ-
372.IgG2sigma (IgG2σ na Figura) ou controle de isótipo na presença de macrófagos M2 (macs M2). A linha pontilhada cinza indica o valor do controle não tratado.
[0056] A Figura 46 mostra a curva de resposta à dosagem do en- saio de trogocitose com base em citometria de fluxo medindo a porcen- tagem (%) do marcador AF488 dentro de macrófagos M1 positivos para CD11b mediante opsonização de células H1975 com isótipo marcado, JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma (IgG2σ na Figura) durante 3 horas. O tratamento com JNJ-372 mas não com isótipo ou IgG2 induziu a trogo- citose dose-dependente com macrófagos M1.
[0057] A Figura 47 mostra a curva de resposta à dosagem do ensaio de trogocitose com base em citometria de fluxo medindo a porcentagem (%) do marcador AF488 dentro de macrófagos M2 positivos para CD11b mediante opsonização de células H1975 com isótipo marcado, JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma (IgG2σ na Figura) durante 3 horas. O tratamento com JNJ-372 mas não com isótipo ou IgG2 induziu a trogocitose dose- dependente com macrófagos M2.
[0058] A Figura 48 mostra imagens representativas de microscopia confocal de alto teor mostrando trogocitose de macrófagos M2 marca- dos com FITC-CD11b (marcação da membrana plasmática de macrófa- gos) e Hoechst (marcação dos núcleos) em cultura concomitante (razão de E:T = 5:1) com células H1975 marcadas com NucLight Red opsoni- zadas com JNJ-372 marcado com AF647 (painel superior) ou JNJ-
372.IgG2sigma (painel inferior) 11 minutos (min) ou 44 minutos após a opsonização. As setas brancas representam os eventos de trogocitose medidos por transferência de anticorpo JNJ-372 marcado com AF647 das células-alvo para macrófagos M2. Nenhuma trogocitose ficou evi- dente com a barra de escala JNJ-372.IgG2sigma = 20 µm. M: macró- fago; T: células H1975;
[0059] A Figura 49 (LEGENDA PARA a escala de tons de cinza WOPCT1)) mostra imagens representativas de microscopia confocal de alto teor mostrando trogocitose de macrófagos M2 marcados com FITC-CD11b (marcação da membrana plasmática de macrófagos), e Hoechst (marcadores de núcleos) em cultura concomitante (razão de E:T = 5:1) com células H1975 marcadas com NucLight Red opsoniza- das com JNJ-372 marcado com AF647 (painel superior) ou JNJ-
372.IgG2sigma (painel inferior) 77 minutos ou 110 minutos após a op- sonização. As setas brancas representam os eventos de trogocitose medidos por transferência de anticorpo JNJ-372 marcado com AF647 das células-alvo para macrófagos M2. Nenhuma trogocitose ficou evi- dente com a barra de escala JNJ-372.IgG2sigma = 20 µm. M: macró- fago; T: células H1975;
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0060] Todas as publicações, incluindo, mas não se limitando a, patentes e pedidos de patente, citadas neste relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência como se fossem descritas na íntegra.
[0061] Deve-se entender que a terminologia usada na presente in- venção tem o propósito de descrever apenas modalidades particulares e não se destina a ser limitadora. Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence.
[0062] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática dos testes da presente invenção, são descritos aqui materiais e métodos exempli- ficadores. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a ter- minologia a seguir será usada.
[0063] Quando uma lista é apresentada, exceto onde especificado em contrário, deve-se entender que cada elemento individual daquela lista e toda combinação daquela lista é uma modalidade separada. Por exemplo, uma lista de modalidades apresentadas como "A, B ou C" será interpretada como incluindo as modalidades "A", "B", "C", "A ou B", "A ou C", "B ou C" ou "A, B ou C".
[0064] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "uma", "um", "o" e "a" incluem referências no plural, a menos que o teor claramente determine de outro modo. Dessa forma, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma combinação de duas ou mais células, e similares.
[0065] O termo conjuntivo "e/ou" entre múltiplos elementos mencio- nados é entendido como abrangendo ambas as opções individuais e combinadas. Por exemplo, quando dois elementos são co-unidos por "e/ou", uma primeira opção se refere à aplicabilidade do primeiro ele- mento sem o segundo. Uma segunda opção se refere à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção se refere à apli- cabilidade do primeiro e do segundo elementos juntos. Entende-se que qualquer uma dessas opções se enquadra no significado, e portanto sa- tisfazem o requisito do termo "e/ou" conforme usado na presente inven- ção. Também se entende que a aplicabilidade simultânea de mais de uma das opções se enquadra no significado e, portanto, atende ao requi- sito do termo "e/ou".
[0066] Os termos transicionais "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" se destinam a conotar seus significados geralmente aceitos no vernáculo de patentes; ou seja, (i)
"compreendendo", o qual é sinônimo de "incluindo", "contendo" ou "ca- racterizado por", é inclusivo ou não limitante, e não exclui elementos ou etapas de método adicionais ou não mencionados; (ii) "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação; e (iii) "consistindo essencialmente em" limita o es- copo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados e àqueles que não afetam materialmente as uma ou mais características básicas e inovadoras da invenção reivindicada. As modalidades des- critas em termos da frase "compreendendo" (ou seus equivalentes) também fornece, como modalidades, aquelas independentemente descritas em termos de "consistindo em" e "consistindo essencial- mente em".
[0067] Os termos "coadministração", "administração com", "ad- ministração em combinação com", "em combinação com" ou simila- res, abrangem a administração dos agentes terapêuticos ou fármacos selecionados a um único paciente, e destinam-se a incluir regimes de tratamento nos quais os agentes terapêuticos ou fármacos são adminis- trados por vias de administração iguais ou diferentes ou ao mesmo tempo ou em tempos diferentes.
[0068] "Isolado" se refere a uma população homogênea de moléculas (como polinucleotídeos sintéticos, vetores de polipeptídeos ou vírus) que foram substancialmente separadas e/ou purificadas de outros componen- tes do sistema que as moléculas são produzidas, como uma célula recom- binante, bem como uma proteína que foi submetida a ao menos uma etapa de purificação ou de isolamento. "Isolado" se refere a uma molécula que está substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos quími- cos e abrange moléculas que são isoladas com uma pureza mais elevada, como 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de pureza.
[0069] "Tratar", "tratando" ou "tratamento" de uma doença ou distúr- bio, como câncer, se refere à realização de um ou mais dos seguintes: redução da gravidade e/ou duração do distúrbio, inibição da piora dos sin- tomas característicos do distúrbio sendo tratado, limitação ou prevenção da recorrência do distúrbio em indivíduos que tiveram anteriormente o dis- túrbio, ou limitação ou prevenção da recorrência de sintomas em indiví- duos que foram anteriormente sintomáticos para o distúrbio.
[0070] "Prevenir", "prevenindo", "prevenção" ou "profilaxia" de uma doença ou distúrbio significa prevenir que um distúrbio ocorra no indivíduo.
[0071] "Diagnosticar" ou "diagnóstico" se refere a métodos para determinar se um indivíduo está sofrendo de uma determinada doença ou condição ou pode desenvolver uma determinada doença ou condição no futuro ou tem probabilidade de responder ao tratamento para uma doença ou condição diagnosticada anterior, isto é, estratificar uma população de pacientes com probabilidade de responder ao tratamento. O diagnóstico é tipicamente realizado por um médico com base nas diretrizes gerais da doença a ser diagnosticada ou em outros critérios que indicam que um indivíduo provavelmente responde a um tratamento específico.
[0072] "Responsivo", "responsividade" ou "provável de res- ponder" se refere a qualquer tipo de melhora ou resposta positiva, como alívio ou melhora de um ou mais sintomas, diminuição da exten- são da doença, estado estabilizado (isto é, não piora) da doença, pre- venção da disseminação da doença, atraso ou desaceleração da pro- gressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e remis- são (seja parcial ou total), detectável ou indetectável.
[0073] "Recentemente diagnosticado" se refere a um indivíduo que foi diagnosticado com câncer que expressa EGFR ou c-Met mas que ainda não recebeu tratamento para mieloma múltiplo.
[0074] "Quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em doses e durante períodos de tempo necessários, para se alcançar um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar dependendo de fatores, como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e da habilidade da terapia ou uma combinação de terapias, para induzir uma resposta de- sejada no indivíduo. Indicadores exemplificadores de uma terapêutica eficaz ou combinação de agentes terapêuticos que incluem, por exem- plo, bem-estar aprimorado do paciente.
[0075] "Refratária" se refere a uma doença que não responde a um tratamento. Uma doença refratária pode ser resistente a um trata- mento antes ou no início do tratamento ou uma doença refratária pode se tornar resistente durante um tratamento.
[0076] "Recidiva" se refere ao retorno de uma doença ou aos sinais e sintomas de uma doença após um período de melhora após o trata- mento prévio com um agente terapêutico.
[0077] "Indivíduo" inclui qualquer ser humano ou animal não hu- mano. "Animais não-humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis. Os termos "indivíduo" e "paciente" são usados de maneira intercambiá- vel na presente invenção.
[0078] "Cerca de" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor específico conforme determinado pelo versado na técnica, que de- penderá em parte de como o valor é medido ou determinado, isto é, as limitações do sistema de medição. Exceto onde explicitamente indicado em contrário dentro dos Exemplos ou em outro local do Relatório Descri- tivo no contexto de um ensaio específico, resultado específico ou modali- dade específica, "cerca de" significa dentro de um desvio padrão por prá- tica na técnica, ou uma faixa de até 5%, qualquer que for maior.
[0079] "Câncer" se refere a um crescimento anormal de células que tendem a se proliferar de maneira descontrolada e, em alguns casos, a metastatizar (espalhar) para outras áreas do corpo de um paciente.
[0080] "Câncer que expressa EGFR ou c-Met" se refere a câncer que tem expressão detectável de EGFR ou de c-Met ou tem mutação ou amplificação de EGFR ou de c-Met. A expressão, amplificação e estado da mutação de EGFR ou c-Met podem ser detectados com o uso de métodos conhecidos, como sequenciamento, hibridização fluo- rescente in situ, imuno-histoquímica, citometria de fluxo ou western blotting.
[0081] "Receptor do fator de crescimento epidérmico" ou "EGFR" se refere ao EGFR humano (também conhecido como HER1 ou ErbB1 (Ullrich et al., Nature 309:418-425, 1984) que tem a sequên- cia de aminoácidos mostrada no número de acesso ao GenBank NP_005219, bem como variantes de ocorrência natural dos mesmos.
[0082] "Receptor de fator de crescimento de hepatócito" ou "c- Met" como usado aqui se refere a c-Met humano que tem a sequência de aminoácidos mostrada no número de acesso ao GenBank NP_001120972 e suas variantes naturais.
[0083] "Anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met" ou "anticorpo biespecífico EGFR/c-Met" se refere a um anticorpo biespecífico que tem um primeiro domínio que se liga especificamente ao EGFR e um segundo domínio que se liga especificamente ao c-Met. Os domínios que se ligam especificamente ao EGFR e ao c-Met são tipicamente pa- res de VH/VL, e o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met é monova- lente em termos de ligação ao EGFR e ao c-Met.
[0084] Os termos "ligação específica", "se liga especificamente", "que se liga especificamente" ou "se liga" se referem a um anticorpo que se liga a um antígeno ou a um epítopo no antígeno com maior afini- dade que a outros antígenos. Tipicamente, o anticorpo se liga a um antí-
geno ou ao epítopo dentro do antígeno com uma constante de dissocia- ção de equilíbrio (KD) de cerca de 5x10-8 M ou menos, por exemplo, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, ou cerca de 1x10-12 M ou menos, tipicamente com a KD que é ao menos cem vezes menor que sua KD para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína). A constante de dissociação pode ser medida com o uso de protocolos conhecidos. Anticorpos que se ligam ao antígeno ou ao epítopo no antígeno podem, no entanto, apre- sentar reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exem- plo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogas), como hu- manos ou macacos, por exemplo Macaca fascicularis (cinomolgo) ou Pan troglodytes (chimpanzé). Enquanto um anticorpo monoespecífico se liga a um antígeno ou a um epítopo, um anticorpo biespecífico se liga a dois antígenos diferentes ou dois epítopos distintos.
[0085] "Anticorpos" tem significado em um sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina que incluem anticorpos monoclonais, in- cluindo anticorpos monoclonais murinos, humanos, humanizados e qui- méricos, fragmentos de ligação ao antígeno, anticorpos multiespecífi- cos, como anticorpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos, etc., anticorpos diméricos, tetraméricos ou multiméricos, anticorpos de ca- deia única, anticorpos de domínio e qualquer outra configuração modifi- cada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de liga- ção ao antígeno da especificidade requerida. Os "anticorpos de compri- mento completo" são compreendidos de duas cadeias pesadas (HC) e duas cadeias leves (LC) interconectadas por ligações de dissulfeto, bem como por multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pe- sada é compreendida de uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (compreendida dos domínios CH1, dobradiça CH2 e CH3). Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de complemen- taridade (CDR), intercaladas com regiões de framework (ou de arca- bouço) (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro segmen- tos de FR, dispostos do terminal amino para o terminal carboxila na se- guinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.
[0086] "Regiões determinantes de complementaridade" (CDR - "complementarity determining regions") são as regiões do anticorpo que se ligam a um antígeno. As CDRs podem ser definidas com o uso de várias delineações, como Kabat (Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211- 50) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., EUA, 1991), Chothia (Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17), IMGT (Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77) e AbM (Martin and Thornton (1996) J Bmol Biol 263: 800-15). A correspondência entre as várias delineações e a numeração de região variável são descritas (con- sulte, por exemplo, Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77; Honegger and Pluckthun, (2001) J Mol Biol 309:657-70; base de dados do International ImMunoGeneTics (IMGT); recursos da Web, http://www_imgt_org). Programas disponíveis como abYsis junto à UCL Business PLC podem ser utilizados para delinear as CDRs. Os termos "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" e "LCDR3", conforme utilizados aqui, incluem as CDRs definidas por qualquer um dentre os métodos descritos acima, Kabat, Chothia, IMGT ou IMGT, a menos que explicitamente indicado de outro modo no relatório descritivo
[0087] As imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes principais, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequência de aminoácidos de domínio constante da cadeia pesada. IgA e IgG são, ainda, subclassificados como os isótipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente dis- tintos, a saber, kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.
[0088] "Fragmento de ligação ao antígeno" se refere a uma por- ção de uma molécula de imunoglobulina que se liga a um antígeno. Os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser polipeptídeos sintéticos obteníveis enzimaticamente ou manipulados geneticamente e incluem a VH, a VL, a VH e a VL, Fab, F(ab')2, e fragmentos de Fd e Fv, anti- corpos de domínio (dAb) consistindo em um domínio VH ou um domínio VL, domínios variáveis de IgNAR de tubarão, domínios VH camelizados, unidades mínimas de reconhecimento consistindo nos resíduos de ami- noácido que mimetizam as CDRs de um anticorpo, como as porções de FR3-CDR3-FR4, a HCDR1, a HCDR2 e/ou a HCDR3 e a LCDR1, a LCDR2 e/ou a LCDR3. Os domínios VH e VL podem ser unidos por um conector sintético para formar diversos tipos de designs de anticorpo de cadeia única onde os domínios VH/VL podem emparelhar de forma in- tramolecular ou intermolecular, nos casos em que os domínios VH e VL são expressos por construtos separados de anticorpo de cadeia única, para formar um sítio de ligação de antígeno monovalente, como a ca- deia única Fv (scFv) ou diacorpo; descrito, por exemplo, nas publica- ções de patente internacionais n°. WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804 e WO1992/01047.
[0089] "Anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de moléculas de anticorpo, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a popula- ção são idênticos exceto quanto a possíveis alterações bem conheci- das, como remoção de lisina carbóxi-terminal da cadeia pesada do an- ticorpo ou modificações pós-traducionais como isomerização ou desa- midação de aminoácidos, oxidação de metionina, ou desamidação de asparagina ou glutamina. Os anticorpos monoclonais tipicamente se li- gam a um epítopo antigênico. Os anticorpos monoclonais biespecíficos se ligam a dois epítopos antigênicos diferentes. Os anticorpos monoclo- nais podem ter glicosilação heterogênea dentro da população de anti- corpo. O anticorpo monoclonal pode ser monoespecífico ou multiespe- cífico, como biespecífico, monovalente, bivalente ou multivalente.
[0090] "Anticorpo humanizado" se refere a um anticorpo no qual ao menos uma CDR é derivada de espécies não humanas, e ao menos um arcabouço é derivado das sequências de imunoglobulinas humanas. O anticorpo humanizado pode incluir substituições nos frameworks de modo que os frameworks podem não ser cópias exatas da imunoglobu- lina humana expressa ou das sequências gênicas da linhagem germi- nativa da imunoglobulina humana.
[0091] "Anticorpo humano" se refere a um anticorpo que é otimi- zado para ter o mínimo de resposta imunológica quando administrado a um indivíduo humano. Regiões variáveis de anticorpo humano são de- rivadas de sequências de imunoglobulina humana. Se o anticorpo hu- mano contiver uma região constante ou uma porção da região cons- tante, a região constante também é derivada das sequências de imuno- globulina humana. O anticorpo humano compreende regiões variáveis da cadeia pesada e leve que são "derivadas de" sequências de origem humana se as regiões variáveis do anticorpo humano são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina da linhagem germinativa hu- mana ou genes de imunoglobulina rearranjados. Esses sistemas exem- plificadores são bibliotecas de genes de imunoglobulina humana exibi- das em fago e de animais transgênicos não humanos, como camundon- gos ou ratos, que carregam loci de imunoglobulina humana. O "anti- corpo humano" tipicamente contém diferenças de aminoácidos em com- paração com as imunoglobulinas expressas em seres humanos devido a diferenças entre os sistemas utilizados para obter o anticorpo humano e loci de imunoglobulina humana, introdução de mutações somáticas, introdução intencional de substituições nos arcabouços ou CDRs, ou ambos. Tipicamente, o "anticorpo humano" é ao menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na sequência de ami- noácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por genes de imu- noglobulina de linhagem germinativa humana ou genes de imunoglobu- lina rearranjados. Em alguns casos, o "anticorpo humano" pode conter sequências de consenso do arcabouço derivadas da análise da sequên- cia do arcabouço humano, por exemplo, como descrito em Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86, HCDR3 sintético incorporado a biblio- tecas de gene da imunoglobulina humana expresso em fago, por exem- plo, como descrito em Shiet al., (2010) J Mol Biol 397:385-96, e na pu- blicação de patente internacional n° WO2009/085462. Os anticorpos nos quais ao menos uma CDR é derivada de uma espécie não humana não são incluídos na definição de "anticorpo humano".
[0092] "Recombinante" se refere ao DNA, anticorpos e outras pro- teínas que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes quando segmentos de diferentes fontes são unidos para produzir DNA, anticorpos ou proteínas recombinantes.
[0093] "Biespecífico" se refere a um anticorpo que se liga especi- ficamente a dois antígenos distintos ou a dois epítopos distintos dentro do mesmo antígeno. O anticorpo biespecífico pode ter reatividade cru- zada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogos), como humanos ou maca- cos, por exemplo, Macaca cynomolgus(cinomolgo, cino), Pan troglo- dytes, ou pode ser ligar a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos distintos.
[0094] "Multiespecífico" se refere a um anticorpo que se liga es- pecificamente a dois ou mais antígenos distintos ou a dois ou mais epítopos distintos no mesmo antígeno. O anticorpo biespecífico pode ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exem- plo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogos), como hu- manos ou macacos, por exemplo, Macaca cynomolgus (cinomolgo, cino) ou Pan troglodytes, ou pode se ligar a um epítopo que é compar- tilhado entre dois ou mais antígenos distintos.
[0095] "Macrófago" designa uma célula de origem mieloide. Os ma- crófagos são grandes leucócitos, ocorrendo principalmente no tecido con- juntivo e na corrente sanguínea ou residentes em um tecido ou microam- biente tumoral. Eles ingerem partículas estranhas e micro-organismos in- fecciosos por fagocitose e têm a capacidade de apresentação de antígeno. Os macrófagos inativados derivados de precursores sofrem diferenciação específica dependendo do ambiente do tecido local. Eles respondem a in- dicações ambientais dentro de tecidos, como células danificadas, linfócitos ativados ou produtos microbianos, para se diferenciar em fenótipos funci- onais distintos. Por exemplo, monócitos no sangue podem entrar no tecido durante a inflamação ou insulto e são, dependendo do microambiente lo- cal, polarizados em direção a um fenótipo de M1 ou M2. O fenótipo de macrófago M1 é caracterizado pela produção de altos teores de citocinas pró-inflamatórias, uma capacidade de mediar a resistência a patógenos, fortes propriedades microbicidas, alta produção de intermediários de nitro- gênio e oxigênio reativo, promoção de respostas de Th1 e extermínio de patógenos e células tumorais. Em contraste, os macrófagos M2 são ca- racterizados por seu envolvimento no controle de parasitas, remodelagem tecidual, regulação imunológica, promoção de tumor e atividade fagocítica eficiente. Os macrófagos M2 são adicionalmente subcategorizados em quatro subtipos diferentes chamados de M2a, M2b, M2c e M2d. "Macró- fago" inclui todos os subtipos de macrófagos.
[0096] "Monócito" se refere aos leucócitos mononucleares
CD14+CD34-, pertencente a um tipo de leucócitos envolvidos nos me- canismos defensivos de primeira linha e é reconhecido como capaz de se diferenciar em uma célula dendrítica ou precursor de macrófago. Os monócitos normalmente se movem no sistema sanguíneo. Em res- posta aos sinais de estimulação externos, os monócitos secretam mui- tas citocinas imunorreguladoras, se movem para o local de infecção no tecido ou para um local de tumor, e se diferenciam em macrófagos. Em particular, um monócito expressa teores elevados do marcador de an- tígeno de superfície CD14, e pode expressar ao menos um biomarca- dor selecionado dentre CD64, CD93, CD180, CD328, CD329 ou prote- ína aglutinina de amendoim (PNA - "peanut agglutinin protein").
[0097] "Acentuar" ou "induzir" se refere à potencialização de uma ou mais funções ou atividade de um macrófago por mais de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, ou de uma maneira estatisticamente significativa quando comparado a um controle (por exemplo, potencialização na presença ou ausência de um agente que acentua a atividade de ma- crófagos).
[0098] "Acentuar a atividade de macrófagos" se refere a uma po- tencialização de uma ou mais atividades de macrófagos, indução de uma mudança fenotípica em monócitos e/ou diferenciação de macrófa- gos de monócitos para macrófagos, ou ativação de macrófagos não ati- vados.
[0099] "Atividade de macrófagos" se refere a qualquer funcionali- dade de macrófagos, como fagocitose, apresentação de antígeno, produ- ção de IL-12, IL-1, TNF ou produção de quimiocinas inflamatórias como CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, CCL11, CCL17, CCL22.
[0100] "Agente que acentua a atividade de macrófagos" pode ser uma molécula pequena, um peptídeo, um oligopeptídeo, um polipeptí- deo, uma proteína, um anticorpo, uma molécula de ligação sintética, um aptâmero, uma molécula de RNA, uma molécula de DNA, um oligômero, um polímero, um lipídeo ou um lipossoma. Agentes exemplificadores que acentuam a função de macrófagos incluem citocinas, quimiocinas, ligantes do receptor de reconhecimento de partem, hormônios, agonis- tas adrenérgicos e colinérgicos, ácidos graxos, fosfolipídeos, imunoglo- bulinas ou porções dos mesmos, domínios Fc de imunoglobulinas, lipo- polissacarídeos (LPS), ligantes do receptor do tipo Toll (TLR), histami- nas e ligantes do receptor ativado por proliferador de peroxissoma.
[0101] "Trogocitose" se refere a um processo caracterizado pela transferência de uma porção de uma membrana celular de uma célula doadora para uma célula receptora. As células receptoras típicas in- cluem macrófagos e monócitos. Células receptoras adicionais incluem células NK, células dendríticas, células T, células B e neutrófilos. A transferência mediada por trogocitose de uma porção de uma mem- brana celular pode incluir a transferência de proteínas de membrana, por exemplo, como EGFR ou c-Met, ou complexos de anticorpo-antí- geno em que um anticorpo está ligado à molécula de superfície celular. A trogocitose mediada por anticorpo pode ocorrer através da ligação da porção Fc do anticorpo ao receptor Fcγ (FcγR) expresso em células receptoras.
[0102] "Trogocitose mediada por anticorpo Anti-EGFR/c-Met" se refere à trogocitose de porções contendo EGFR e/ou c-Met de uma membrana celular de uma célula doadora para uma célula receptora mediada pelo anticorpo anti-EGFR/c-Met ligado à membrana celular doadora de EGFR e/ou c-Met.
[0103] "Limiar" se refere ao teor de macrófagos ou monócitos que é cerca do valor de 30° percentil ou acima de macrófagos ou monócitos ob- servados na amostra biológica de uma população de indivíduos tendo o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
[0104] "Agonista" se refere a uma molécula que, quando ligada a uma proteína celular, induz ao menos uma reação ou atividade que é induzida por um ligante natural da proteína. Uma molécula é um ago- nista quando a ao menos uma reação ou atividade é induzida em ao menos cerca de 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% mais do que a ao menos uma reação ou atividade induzida na ausência do agonista (por exemplo, controle negativo), ou quando a indução é estatisticamente significativa quando comparada com a indução na ausência do agonista.
[0105] "Antagonista" ou "inibidor" se refere a uma molécula que, quando ligada a uma proteína celular, suprime ao menos uma reação ou atividade que é induzida por um ligante natural da proteína. Uma molécula é um antagonista quando a ao menos uma reação ou atividade é suprimida em ao menos cerca de 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% mais do que ao menos uma reação ou atividade suprimida na ausência do antagonista (por exemplo, controle ne- gativo), ou quando a supressão é estatisticamente significativa quando comparada à supressão na ausência do antagonista.
[0106] "Inibidor de eixo de PD-(L)1" se refere a uma molécula que inibe a sinalização a jusante de PD-1. O inibidor do eixo de PD-(L)1 pode ser uma molécula que se liga a PD-1, PD-L1 ou PD-L2.
[0107] "Amostra biológica" se refere a uma coleção de fluidos, célu- las ou tecidos similares isolados de um indivíduo, bem como fluidos, célu- las ou tecidos presentes em um indivíduo. Amostras exemplificadoras são fluidos biológicos como sangue, soro e fluidos serosos, plasma, linfa, urina, saliva, fluido cístico, gotas de lágrima, fezes, escarro, secreções mucosais dos tecidos e órgãos secretores, secreções vaginais, fluidos de ascite, flu- idos das cavidades pleurais, pericardiais, peritoneais, abdominais e outras cavidades corporais, fluidos coletados por lavagem brônquica, fluido sino- vial, soluções líquidas em contato com um indivíduo ou fonte biológica, por exemplo, meio de cultura de célula ou de órgão incluindo meio condicio- nado de célula ou de órgão, fluidos de lavagem e similares, biópsias de tecido, biópsias de tecido tumoral, amostras de tecido tumoral, aspirações de agulha fina, tecido ressecado cirurgicamente, culturas de órgãos ou cul- turas celulares.
[0108] "Fucose baixa" ou "baixo teor de fucose" como usado no pe- dido de patente se refere aos anticorpos com teor de fucose de cerca de 1% a 15%.
[0109] "Fucose normal" ou "teor normal de fucose" como usado aqui, se refere aos anticorpos com teor de fucose superior a cerca de 50%, tipicamente, superior a cerca de 80% ou superior a 85%. Métodos da divulgação
[0110] JNJ-61186372 (JNJ-372) é um anticorpo biespecífico para IgG1 anti-EGFR/c-Met descrito na patente US n° 9.593.164. Estudos anteriores indicaram que JNJ-372 inibiu o crescimento e a progressão do tumor por três mecanismos distintos: inibição da ativação induzida por ligante através do bloqueio da ligação do ligante a cada receptor, inativação do receptor através da degradação e extermínio de tumores expressando EGFR e c-Met mediados por Fc por ADCC e ADCP (Mo- ores et al., Cancer Research 76(13), 2016.; publicado on-line em 23 de maio de 2016; DOI: 10.1158/0008-5472).
[0111] A invenção se baseia, ao menos em parte, na surpreen- dente descoberta de que a interação Fc de JNJ-372 não apenas me- deia ADCC e ADCP, mas também potencializa a inibição de sinaliza- ção EGFR/c-Met mediada por JNJ-372, e que monócitos ou macrófa- gos são suficientes e necessários para os efeitos antitumorais media- dos por JNJ-372 através de trogocitose.
[0112] Sem se ater à teoria, pode-se esperar, com base nos resul- tados surpreendentes aqui divulgados, que os teores de monócitos no sangue do paciente podem se correlacionar positivamente com os teo- res de macrófagos em seus tumores, o que pode prever melhor resposta ao JNJ-372. De modo similar, pode-se esperar que as amostras de te- cido tumoral com teores aumentados de macrófagos ou teores aumen- tados de FcγRI ou FcγRIIIa por IHC ou assinatura de gene imune res- ponderiam melhor a JNJ-372 fornecendo mais interações de células imunes. Além disso, pode-se esperar que, com base nos resultados aqui descritos, os tratamentos que acentuam a atividade de macrófagos usa- dos em combinação com JNJ-372 aumentariam a eficácia geral de JNJ-
372. Por exemplo, o tratamento com GM-CSF direcionaria a diferencia- ção de monócitos circulantes em macrófagos associados ao tumor, o que pode aumentar a eficácia de JNJ-372. O tratamento com terapia anti-CD47 pode bloquear a inibição negativa de macrófagos, desse modo, ativando-os para acentuar a atividade de JNJ-372. De modo si- milar, a inibição do eixo de PD-(L)1, a inibição de HDAC ou agnozização de CD11b podem mudar a polarização de macrófagos associados ao tumor de modo que eles sejam mais ativos e, dessa forma, sinergizem com o tratamento de JNJ-372 para acentuar o extermínio tumoral.
[0113] A identificação desse novo mecanismo fornece base para selecionar pacientes para o tratamento que podem ser mais responsivos a JNJ-372 com base na quantidade relativa ou absoluta de monócitos e/ou macrófagos do paciente na amostra de sangue ou tumor e para métodos de tratamento de combinação que usam moléculas que acen- tuam a atividade de macrófagos em combinação com JNJ-372.
[0114] A divulgação fornece um método de tratamento de um indi- víduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met, que compre- ende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti-
corpo biespecífico isolado do receptor do fator de crescimento epidér- mico (EGFR)/receptor do fator de crescimento de hepatócito (c-Met) ao indivíduo em combinação com um agente que acentua a atividade de macrófago no indivíduo.
[0115] A divulgação também fornece um método de diagnóstico e tratamento de um indivíduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met que é responsivo ao tratamento com um anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met, que compreende: fornecer uma amostra biológica do indi- víduo; medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; diagnosticar o indivíduo que tem o câncer que expressa EGFR ou c-Met que é responsivo ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou de monócitos da amos- tra biológica são mais altos que um valor-limite; e administrar ou fornecer a administração do anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo diagnosticado como responsivo ao tratamento com o anticorpo anti- EGFR/c-Met.
[0116] A divulgação também fornece um método de tratamento de um indivíduo suspeito de ter ou que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, que compreende: determinar que o indivíduo tem teores de macrófagos ou monócitos maiores que um valor-limite; e administrar ou fornecer a ad- ministração do anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo determinado como tendo teores de macrófagos ou monócitos maiores que o valor-limite.
[0117] A divulgação também fornece um método de prevenção da resposta de um indivíduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c- Met para o tratamento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, que compreende fornecer uma amostra biológica do indivíduo; medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; prever o indiví- duo como um respondedor quando os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica são mais altos que um valor-limite.
[0118] A divulgação também fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met que é respon- sivo ao tratamento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, que compreende fornecer uma amostra biológica do indivíduo; medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; tratar o indivíduo com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou de monócitos da amostra biológica são mais altos que um valor-limite.
[0119] A divulgação também fornece um método para determinar se um indivíduo que tem um câncer que expressa EGFR ou c-Met é respon- sivo ao tratamento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met e de- cidir se deve tratar o indivíduo, que compreende: fornecer uma amostra biológica do indivíduo; medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; diagnosticar o indivíduo com o câncer que expressa EGFR ou c-Met em resposta ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou monócitos da amos- tra biológica são mais altos que um valor-limite ou diagnosticar o indivíduo com o câncer que expressa EGFR ou c-Met como não responsivo ao tra- tamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou de monócitos da amostra biológica estão abaixo do va- lor-limite; e administrar o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ao indiví- duo diagnosticado como responsivo ao tratamento com o anticorpo bies- pecífico anti-EGFR/c-Met ou abster-se de administrar o anticorpo biespe- cífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo diagnosticado como não responsivo ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met.
[0120] O "teor" de macrófagos ou monócitos pode ser qualitativo (por exemplo, presença ou ausência) ou quantitativo (por exemplo, nú- meros absolutos de células, números relativos, porcentagem (%) de uma contagem total de células ou porcentagem positiva de células em um campo). Em algumas modalidades, macrófagos ou monócitos es- tão ausentes na amostra biológica.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos está acima do valor médio de macrófagos ou monócitos observados em uma amostra biológica de um indivíduo saudável.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monóci- tos é cerca do valor de 30° percentil de macrófagos ou monócitos ob- servados na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 35° percentil de macrófagos ou mo- nócitos observados na amostra biológica de indivíduos que têm o cân- cer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 40° percentil de macró- fagos ou monócitos observados na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 45° percentil de macrófagos ou monócitos observados na amostra biológica de indi- víduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 50° percentil de macrófagos ou monócitos observados na amostra bi- ológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 60° percentil de macrófagos ou monócitos observados na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monóci- tos é cerca do valor de 65° percentil de macrófagos ou monócitos ob- servados na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 70° percentil de macrófagos ou mo- nócitos observados na amostra biológica de indivíduos que têm o cân- cer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 75° percentil de macró- fagos ou monócitos observados na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met. Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 80° percentil de macrófagos ou monócitos observados na amostra biológica de indi- víduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met. Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 85° percentil de macrófagos ou monócitos observados na amostra bi- ológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met. Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 90° percentil de macrófagos ou monócitos observados na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met. Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monóci- tos é cerca do valor de 95° percentil de macrófagos ou monócitos ob- servados na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met. Em algumas modalidades, o teor de macrófagos ou monócitos é cerca do valor de 100° percentil de macrófagos ou mo- nócitos observados na amostra biológica de indivíduos que têm o cân- cer positivo para EGFR ou c-Met.
[0121] O teor de macrófagos ou monócitos em indivíduos que têm câncer que expressa EGFR ou c-Met pode também ser comparado em relação aos teores de macrófagos ou monócitos na amostra biológica de indivíduos saudáveis. O teor aumentado de macrófagos ou monó- citos pode, por exemplo, ser de cerca de 1,5 vez, cerca de 2 vezes, cerca de 2,5 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 3,5 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 4,5 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 5,5 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 6,5 vezes, cerca de 7 vezes, cerca de 7,5 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 8,5 vezes, cerca de 9 vezes ou cerca de 10 vezes mais alto quando comparado aos teores de macrófagos ou mo- nócitos na amostra biológica de indivíduos saudáveis.
[0122] Os macrófagos podem ser identificados, por exemplo, a par- tir de biópsias de tecido tumoral obtidas a partir de indivíduos que têm o tumor que expressa EGFR ou c-Met com o uso de imuno-histoquímica usando CD68, iNOS (sintase de óxido nítrico induzível) e CD163 como marcadores para macrófagos em geral, macrófagos M1 ou macrófagos M2, respectivamente e avaliar a porcentagem de área de coloração po- sitiva e comparar com tecido não tumoral (consulte, por exemplo, Alma- toodi et al., Cancer Micreoenvironment 9:1-11, 2016 em que foi descrito que a % de área de coloração positiva de CD68 foi aumentada 2 vezes em não tumor versus adenocarcinoma, células escamosas ou carci- noma de células grandes). Os macrófagos podem ser identificados, por exemplo, a partir de biópsias de tecido tumoral obtidas a partir de indi- víduos que têm o tumor que expressa EGFR ou c-Met com o uso de uma assinatura de gene imune.
[0123] Os monócitos podem ser identificados a partir de amostras de sangue dos indivíduos que têm tumores que expressam EGFR ou c-Met com o uso de seleção de células fluorescentes usando o marcador de mo- nócitos CD14.
[0124] Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de sangue.
[0125] Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma bióp- sia de tecido tumoral.
[0126] De modo similar, os teores de FcγRI ou FcγRIIIa podem ser usados para prever a resposta do paciente a JNJ-372 fornecendo mais interações de células imunes.
[0127] Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa está acima do valor médio do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado em uma amostra biológica de um indivíduo saudável. Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 30° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 35° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 40° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 45° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 50° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 60° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 65° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 70° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 75° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 80° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 85° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met. Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 90° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met. Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 95° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met. Em algumas modalidades, o teor de FcγRI ou FcγRIIIa é de cerca do valor de 100° percentil do teor de FcγRI ou FcγRIIIa observado na amostra biológica de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR ou c-Met.
[0128] O teor de FcγRI ou FcγRIIIa pode ser medido com o uso de imuno-histoquímica em amostras de tecido tumoral (como seções de te- cido tumoral frescas congeladas ou embebidas em parafina). O teor de FcγRI ou FcγRIIIa pode ser expresso como porcentagem (%) de células FcγRI ou FcγRIIIa dentro de um campo de microscópio. O teor de FcγRI ou FcγRIIIa pode também ser medido no teor de expressão gênica com o uso de RNA isolado de amostras de tecido tumoral, como parte de um painel de assinatura de gene imune, ou como genes individuais.
[0129] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met compreende: um primeiro domínio que se liga ao EGFR que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) da SEQ ID NO: 1, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR3 da SEQ ID NO: 3, uma região determinante de complementa- ridade de cadeia leve 1 (LCDR1) da SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 da SEQ ID NO: 6; e um segundo domínio que se liga a c-Met que compreende a HCDR1 da SEQ ID NO: 7, a HCDR2 da SEQ ID NO: 8, a HCDR3 da SEQ ID NO: 9, a LCDR1 da SEQ ID NO: 10, a LCDR2 da SEQ ID NO: 11, e a LCDR3 da SEQ ID NO: 12.
[0130] Em algumas modalidades, o primeiro domínio que se liga ao EGFR compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 13 e um domínio variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 14; e o segundo domínio que se liga ao c-Met compreende a VH da SEQ ID NO: 15 e a VL da SEQ ID NO: 16.
[0131] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met é um isótipo de IgG1. Existe alguma variação dentro do do- mínio constante de IgG1 (por exemplo, alótipos bem conhecidos), com va- riação nas posições 214, 356, 358, 422, 431, 435 ou 436 (numeração de resíduos de acordo com a numeração EU) (consulte, por exemplo, fontes do site da IMGT; IMGT Repertoire (IG and TR); Proteins and alleles; allotypes). O anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met pode ser de qualquer alótipo de IgG1, como G1m17, G1m3, G1m1, G1m2, G1m27 ou G1m28.
[0132] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met compreende uma primeira cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 17, uma primeira cadeia leve (LC1) da SEQ ID NO: 18, uma segunda cadeia pesada (HC2) da SEQ ID NO: 19, e uma segunda ca- deia leve (LC2) da SEQ ID NO: 20.
[0133] Em algumas modalidades, o agente que acentua a atividade de macrófagos é GM-CSF, um antagonista de CD47, um anticorpo anti- CD47, um inibidor de HDAC, um inibidor do eixo de PD-(L)1 ou um ago- nista de CD11b.
[0134] Em algumas modalidades, o agente que acentua a atividade de macrófagos é GM-CSF.
[0135] Em algumas modalidades, o agente que acentua a atividade de macrófagos é o antagonista de anti-CD47.
[0136] Em algumas modalidades, o agente que aumenta a atividade de macrófagos é o anticorpo anti-CD47.
[0137] Em algumas modalidades, o agente que acentua a atividade de macrófagos é o inibidor de HDAC.
[0138] Em algumas modalidades, o agente que acentua a atividade de macrófagos é o inibidor do eixo de PD-(L)1.
[0139] Em algumas modalidades, o agente que acentua a atividade de macrófagos é o agonista de CD11b.
[0140] Em algumas modalidades, o inibidor de HDAC é um inibidor de HDAC2.
[0141] Antagonistas de CD47 exemplificadores são fusões de ligante de CD47-Fc, como fusões de SIRP-Fc, como anticorpos TTI621 e ani- CD47.
[0142] Exemplos de anticorpos anti-CD47 são anticorpos Hu5F9-G4, TI-061, TTI-622, AO-176, IBI-188, ALX-148, SRF-231, CC-90002 e anti- CD47 divulgados na publicação de patente internacional n° WO2016/081423.
[0143] Os inibidores de HDAC exemplificadores são vorinostad, romi- depsina, quitamida, panobinostato, belinostat, prainostat, abexinostat, en- tinostato, vafidenstato, GSK-2879552, ricolinostato, iadademstato, doma- tinostato, resminostato, AZD-9468, nanatinostato, CG-200745, mocetinos- tato, INCB-59872, IMG-7289, tinostamustina, RDN-929, YM-753, HG-146, NBM-BMX, TAK-418, seclidenstato, CKD-504, CKD-506, CC-90011, KA- 2507 e citarinostato.
[0144] Inibidores do eixo de PD-(L)1 exemplificadores são anticorpos que se ligam a PD-1 como nivolumabe (OPDIVO®), pembrolimumabe (KEYTRUDA®), sintilimabe, cemiplimabe (LIBTAYO®), tripolibamabe, tis- lelizumabe, espartalizumabe, camrelizumabe, dostralimabe, genolimzu- mabe ou cetrelimabe, ou anticorpos que se ligam a PD-L1, como anticor- pos PD-L1 são envafolimabe, atezolizumabe (TECENTRIQ®), durvalu- mabe (IMFINZI®) e avelumabe (BAVENCIO®).
[0145] Os anticorpos comercializados podem ser comprados atra- vés de distribuidor autorizado ou farmácia. As estruturas de sequên- cias de aminoácidos das moléculas pequenas podem ser encontradas a partir de submissões de USAN e/ou INN pelas companhias de regis- tro CAS.
[0146] Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c- Met está associado a um EGFR do tipo selvagem, uma mutação de ativa- ção de EGFR, uma amplificação do gene de EGFR, teores aumentados de HGF circulante, um c-Met do tipo selvagem, uma mutação de ativação de c-Met, uma amplificação do gene de c-Met ou um KRAS mutante.
[0147] As mutações de ativação de EGFR exemplificadoras que po- dem estar associadas ao câncer incluem mutações pontuais, mutações de deleção, mutações de inserção, inversões ou amplificações gênicas que levam a um aumento em ao menos uma atividade biológica do EGFR, como elevada atividade de tirosina quinase, formação de homo- dímeros e heterodímeros de receptores, ligação de ligante acentuada, etc. As mutações podem estar situadas em qualquer porção de um gene de EGFR ou região reguladora associada a um gene de EGFR e incluem mutações no éxon 18, 19, 20 ou 21 ou mutações no domínio quinase. Outros exemplos de mutações de ativação de EGFR são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, a publicação de patente US n° US2005/0272083). Informações sobre EGFR e outros receptores de ErbB incluindo homo e heterodímeros do receptor, ligantes de receptor, sítios de autofosforilação e moléculas de sinalização envolvidas na sina- lização mediada por ErbB são conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Hynes and Lane, Nature Reviews Cancer 5: 341-354, 2005).
[0148] Em algumas modalidades, a mutação de ativação de EGFR é a substituição L718Q, G719A, G719X (X sendo qualquer aminoácido), L861X (X sendo qualquer aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, C797S, L858P ou T790M, deleção de E746 a A750, deleção de R748 a P753, inserção de Ala (A) entre M766 e A767, inserção de Ser, Val e Ala (SVA) entre S768 e V769, inserção de Asn e Ser (NS) entre P772 e H773, inserção de um ou mais aminoácidos entre
D761 e E762, A763 e Y764, Y764 e Y765, M766 e A767, A767 e V768, S768 e V769, V769 e D770, D770 e N771, N771 e P772, P772 e H773, H773 e V774, V774 e C775, ou uma ou mais deleções ou uma ou mais inserções no éxon 20 de EGFR.
[0149] As mutações de ativação de c-Met exemplificadoras incluem mutações pontuais, mutações de deleção, mutações de inserção, inver- sões ou amplificações gênicas que levam a um aumento em ao menos uma atividade biológica de uma proteína de c-Met, como elevada ativi- dade de tirosina quinase, formação de homodímeros e heterodímeros de receptores, ligação de ligante acentuada, etc. As mutações podem estar situadas em qualquer porção do gene de c-Met ou em regiões re- guladoras associadas ao gene, como mutações no domínio quinase de c-Met. As mutações de ativação de c-Met exemplificadoras são muta- ções nas posições de resíduo N375, V13, V923, R175, V136, L229, S323, R988, S1058/T1010 e E168. Os métodos para detectar as muta- ções de EGFR e c-Met ou amplificações de genes são bem conhecidos.
[0150] Em algumas modalidades, o KRAS mutante tem uma subs- tituição G12V, G12C ou G12A.
[0151] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer que ex- pressa EGFR ou c-Met recém-diagnosticado.
[0152] Em algumas modalidades, o indivíduo que tem o câncer que expressa EGFR ou c-Met recém-diagnosticado tem uma ou mais muta- ções no éxon 20 de EGFR. As mutações no éxon 20 (inserção de um ou mais aminoácidos são geralmente resistentes aos inibidores de tirosina quinase do EGFR (TKI) (consulte, por exemplo, a publicação de patente internacional n° WO2018/094225).
[0153] Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou ad- quiriu resistência ao tratamento com uma terapia anticâncer anterior.
[0154] Em algumas modalidades, a terapia anticâncer anterior é quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada ou um inibidor de qui- nase.
[0155] Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HER4, VEGFR ou AXL.
[0156] Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, vandetanibe, afatinibe, osimertinibe, lazertinibe, pozi- otinibe, criotinibe, cabozantinibe, capmatinibe, axitinibe, lenvatinibe, ninte- danibe, regorafenibe, pazopanibe, sorafenibe ou sunitinibe.
[0157] Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou adqui- riu resistência a um inibidor de EGFR. Os inibidores de EGFR exempli- ficadores para os quais o câncer pode adquirir resistência são anticor- pos anti-EGFR cetuximabe (ERBITUX®), pantinumumabe (VECTI- BIX®), matuzumabe, nimotuzumabe, inibidores de EGFR de molécula pequena erlotinibe (TARCEVA®), gefitinibe (IRESSA®), EKB-569 (peli- tinibe, EGFR TKI irreversível), pan-ErbB e outros inibidores de tirosina quinase do receptor, lapatinibe (inibidor de EGFR e HER2), pelitinibe (inibidor de EGFR e HER2), vandetanibe (ZD6474, ZACTIMA™, EGFR, VEGFR2 e RET TKI), PF00299804 (dacomitinibe, pan-ErbB TKI irrever- sível), CI-1033 (pan-erbB TKI irreversível), afatinibe (BIBW2992, pan- ErbB TKI irreversível), AV-412 (inibidor duplo de EGFR e ErbB2), EXEL- 7647 (inibidor de EGFR, ErbB2, GEVGR e de EphB4), CO-1686 (EGFR TKI seletivo com mutante irreversível), AZD9291 (EGFR TKI seletivo com mutante irreversível) e HKI-272 (neratinibe, inibidor de EGFR/ErbB2 irreversível).
[0158] Vários métodos qualitativos e/ou quantitativos podem ser usados para determinar se um indivíduo é resistente, se desenvolveu ou se é suscetível a desenvolver resistência ao tratamento com uma terapia anticâncer. Os sintomas que podem estar associados à resis- tência a uma terapia anticâncer incluem um declínio ou platô do bem- estar do paciente, aumento no tamanho do tumor, declínio interrompido ou atrasado no crescimento de um tumor e/ou disseminação de células de câncer de um local para outros órgãos, tecidos ou células no corpo. O restabelecimento ou a piora de vários sintomas associados ao cân- cer também pode ser uma indicação de que um indivíduo desenvolveu ou é suscetível ao desenvolvimento de resistência a uma terapia anti- câncer, como anorexia, disfunção cognitiva, depressão, dispneia, fa- diga, distúrbios hormonais, neutropenia, dor, neuropatia periférica e disfunção sexual. Os sintomas associados a câncer podem variar de acordo com o tipo de câncer. Por exemplo, os sintomas associados ao câncer cervical podem incluir sangramento anormal, descarga vaginal pesada incomum, dor pélvica que não está relacionada ao ciclo mens- trual normal, dor na bexiga ou dor durante a urinação, e sangramento entre períodos menstruais regulares, após relação sexual, duplicação, ou exame pélvico. Sintomas associados ao câncer de pulmão podem incluir tosse persistente, tosse com sangue, falta de ar, dor no peito e dificuldade para respirar, perda de apetite, perda de peso não intenci- onal e fadiga. Os sintomas para câncer de fígado podem incluir perda de apetite e peso, dor abdominal, especialmente na parte superior di- reita do abdômen que pode se estender para dentro das costas e do ombro, náusea e vômito, fraqueza e fadiga gerais, um fígado aumen- tado, inchaço abdominal (ascite) e uma descoloração amarela da pele e das partes claras dos olhos (icterícia). Um versado em oncologia pode prontamente identificar os sintomas associados a um tipo espe- cífico de câncer.
[0159] Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met inclui câncer de células epiteliais, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma pulmonar, câncer de pulmão de células pe- quenas, câncer colorretal, câncer anal, câncer de próstata, câncer renal,
câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de faringe, cân- cer de nariz, câncer pancreático, câncer de pele, câncer oral, câncer de língua, câncer esofágico, câncer vaginal, câncer cervical, câncer do baço, câncer testicular, câncer gástrico, câncer do timo, câncer de có- lon, câncer de tireoide, câncer de fígado, carcinoma hepatocelular (HCC) ou carcinoma de células renais papilares esporádico ou heredi- tário (PRCC).
[0160] Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é um câncer de célula epitelial. Em algumas modalidades, o cân- cer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de mama. Em algumas mo- dalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de pulmão. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é adenocarcinoma de pulmão. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de pulmão de células pequenas. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer colorretal. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer anal. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de próstata. Em algumas modalidades, o cân- cer que expressa EGFR ou c-Met é câncer renal. Em algumas modali- dades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de cabeça e pescoço. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de faringe. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer do nariz. Em algumas modalida- des, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer pancreático. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de pele. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-
Met é câncer oral. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer da língua. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de esôfago. Em algumas moda- lidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer vaginal. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer cervical. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c- Met é câncer do baço. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer testicular. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer gástrico. Em algumas modalida- des, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer do timo. Em algu- mas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é câncer de cólon. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c- Met é câncer de tireoide. Em algumas modalidades, o câncer que ex- pressa EGFR ou c-Met é câncer de fígado. Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c-Met é carcinoma hepatocelular (HCC). Em algumas modalidades, o câncer que expressa EGFR ou c- Met é carcinoma de células renais papilares esporádico (PRCC).
[0161] Em algumas modalidades, o NSCLC inclui carcinoma de célu- las escamosas, adenocarcinoma e carcinoma de células grandes. Em al- gumas modalidades, as células de NSCLC têm um fenótipo epitelial. Em algumas modalidades, o NSCLC adquiriu resistência ao tratamento com um ou mais inibidores de EGFR.
[0162] No NSCLC, as mutações específicas no gene de EGFR estão associadas a altas taxas de resposta (70 a 80%) aos inibidores de tirosina quinase de EGFR (EGFR-TKIs). Uma deleção de 5 aminoácidos no éxon 19 ou a mutação pontual L858R no EGFR estão associadas com a sensi- bilidade ao EGFR-TKI (Nakata e Gotoh, Expert Opin Ther Targets 16:771- 781, 2012). Essas mutações resultam em uma ativação independente do ligante da atividade de quinase de EGFR. As mutações de ativação de
EGFR ocorrem em 10 a 30% de pacientes com NSCLC e são significati- vamente mais comuns em mulheres asiáticas do Leste, não fumantes e pacientes com histologia de adenocarcinoma (Janne e Johnson Clin Can- cer Res 12(14 Suppl): 4416s-4420s, 2006). A amplificação do gene de EGFR também está fortemente correlacionada com a resposta após o tra- tamento com EGFR-TKI (Cappuzzo et al., J Natl Cancer Inst 97:643-55, 2005). As inserções do éxon 20 de EGFR têm sido associadas com a re- sistência ao EGFR TKI.
[0163] Embora a maior parte dos pacientes com NSCLC com muta- ções de EGFR inicialmente responda à terapia com EGFR TKI, virtual- mente todos adquirem resistência que evita uma resposta durável. De 50 a 60% dos pacientes adquirem resistência devido a uma mutação pontual do segundo sítio no domínio quinase de EGFR (T790M). Quase 60% de todos os tumores que se tornam resistentes aos inibidores de EGFR tirosina quinase aumentam a expressão de c-Met, amplificam o gene de c-Met, ou aumentam apenas seu ligante conhecido, HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17:77 a 88, 2010).
[0164] Em algumas modalidades, o indivíduo é homozigoto para fenilalanina na posição 158 de CD16 ou heterozigoto para valina e fe- nilalanina na posição 158 de CD16.
[0165] O indivíduo homozigoto para fenilalanina na posição 158 de CD16 tem um genótipo FcγRIIIa-158F/F O indivíduo heterozigoto para valina e fenilalanina na posição 158 de CD16 tem um genótipo FcγRIIIa-158F/V. CD16 também é conhecido como o Fc gama receptor IIIa (FcγyRIIIa) ou a isoforma do receptor Fc gama da região do recep- tor IIIa de imunoglobulina de baixa afinidade O polimorfismo de va- lina/fenilalanina (V/F) na posição 158 de resíduo de proteína FcγRIIIa foi mostrado por afetar a afinidade de FcγyRIIIa com IgG humano. O receptor com polimorfismos FcγyRIIIa-158F/F ou FcγRIIIa-158F/V de- monstra envolvimento reduzido do Fc e portanto ADCC reduzido quando comparado ao FcγRIIIa-158V/V. A falta de ou baixa quantidade de fucose em oligossacarídeos N-ligados humanos melhora a capaci- dade dos anticorpos para induzir ADCC devido a ligação melhorada dos anticorpos ao FcγRIIIa humano (CD16) (Shields et al, J Biol Chem 277:26.733 a 26.740, 2002).
[0166] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met tem teor reduzido de fucose de cerca de 1% a cerca de 10%. O anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met tendo teor reduzido de fucose pode ser mais eficaz no tratamento de pacientes com genótipos FcγRIIIa- 158F/F ou FcγRIIIa-158F/V. Os pacientes podem ser analisados por ser polimorfismo FcγyRIIIa usando métodos de rotina.
[0167] Os anticorpos com teor reduzido de fucose podem ser pro- duzidos com o uso de diferentes métodos relatados por levar à expres- são bem-sucedida de anticorpos relativamente altamente defucosilados com o tipo de complexo biantenário de oligossacarídeos de Fc como controle da osmolalidade da cultura (Konno et al., Cytotechnology 64(:249 a 265, 2012), aplicação de uma linhagem CHO variante Lec13 como a linhagem de células hospedeira (Shields et al., J Biol Chem 277:26.733a 26.740, 2002), aplicação de uma linhagem CHO variante EB66 como a linhagem de células hospedeira (Olivier et al., MAbs;2(4), 2010; publicado eletronicamente antes da impressão; PMID:20562582), aplicação de uma linhagem celular de hibridoma de rato YB2/0 como a linhagem celular hospedeira (Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466- 3473, 2003), introdução de RNA interferente pequeno especificamente contra o gene  1,6-fucosiltrasferase (FUT8) (Mori, et al. Biotechnol Bi- oeng88:901-908, 2004), ou coexpressão de β-1,4-N-acetilglucosaminil- transferase III e α-manosidase II de Golgi ou um inibidor potente de alfa- manosidase I, kifunensina (Ferrara et al., J Biol Chem281:5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652 a 665, 2008).
[0168] Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado, adi- cionalmente, com uma terceira terapia anticâncer.
[0169] Em algumas modalidades, a terceira terapia anticâncer é qui- mioterapia, uma terapia anticâncer direcionada ou um inibidor de qui- nase.
[0170] Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HER4, VEGFR ou AXL. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de EGFR. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de c-Met. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de HER2. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de HER3. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de HER4. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de VEGFR. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é um inibidor de AXL.
[0171] Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, vandetanibe, afatinibe, osimertinibe, lazertinibe, poziotinibe, criotinibe, cabozantinibe, capmatinibe, axitinibe, lenvati- nibe, nintedanibe, regorafenibe, pazopanibe, sorafenibe ou sunitinibe.
[0172] Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é erlotinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é gefitinibe. Em algu- mas modalidades, o inibidor de quinase é lapatinibe. Em algumas mo- dalidades, o inibidor de quinase é vandetanibe. Em algumas modalida- des, o inibidor de quinase é afatinibe. Em algumas modalidades, o inibi- dor de quinase é osimertinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é lazertinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é poziotinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é criotinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é cabozantinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é capmatinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é axitinibe. Em algumas modalida- des, o inibidor de quinase é lenvatinibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é nintedanibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é regorafenibe. Em algumas modalidades, o inibidor de qui- nase é pazopanibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é sorafenibe. Em algumas modalidades, o inibidor de quinase é sunitinibe.
[0173] As terapias anticâncer que podem ser administradas em combinação com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met nos méto- dos da divulgação incluem qualquer um ou mais dentre os fármacos quimioterápicos ou outros agentes terapêuticos anticâncer conhecidos pelos versados na técnica. Os agentes quimioterápicos são compostos químicos úteis no tratamento do câncer e incluem agentes inibidores do crescimento ou outros agentes citotóxicos e incluem agentes alquilan- tes, antimetabólitos, inibidores antimicrotúbulos, inibidores da topoiso- merase, inibidores da tirosina quinase receptora, inibidores da angiogê- nese e similares. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agen- tes alquilantes como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquila como busulfan, improsulfan e pipossulfan; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metila- melaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenofosfora- mida, trietilenotiofosfaoramida e trimetilolomelamina; mostardas de ni- trogênio como clorambucil, clornafazina, cholofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, mel- falano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mos- tarda de uracila; nitrosureias como carmustina, clorozotocina, fotemus- tina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomisi- nas, actinomicina, autenticicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleu- cina, doxorrubicina, epirrubicina, esorubicina, idarubicina, marcellomi- cina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, pe-
plomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estrep- tonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos como metotrexato e 5-FU; análogos de ácido fólico, como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; aná- logos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andró- genos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, como aminoglutetimida, mito- tano, trilostano; restaurador de ácido fólico, como ácido frolínico; ace- glatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazi- quona; elfornitina; acetato de elipitínio; etoglucid; nitrato de gálio; hidro- xiureia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; ácido podofinílico; 2- etel-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermâ- nio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2′,2″-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobro- mano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; mem- bros da família taxano ou taxoide, como paclitaxel (TAXOL®docetaxel (TAXOTERE®) e análogos dos mesmos; clorambucil; gencitabina; 6-ti- oguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, como a cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo, (VP-16); ifos- famida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina: vinorelbina; navelbine; novantrone; teniposídeo; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandro- nato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometil orni- tina (DMFO); ácido retinoico esperamicinas; capecitabina; os inibidores de receptores de tirosina quinases e/ou de angiogênese, incluindo so- rafenibe (NEXAVAR®), sunitinibe (SUTENT®), pazopanibe (VOTRI-
ENT™), toceranibe (PALLADIA™), vandetanibe (ZACTIMA™), cedira- nibe (RECENTIN®), regorafenibe (BAY 73-4506), axitinibe (AG013736), lestaurtinibe (CEP-701), erlotinibe (TARCEVA®), gefitinibe (IRESSA®), afatinibe (BIBW 2992), lapatinibe (TYKERB®), neratinibe (HKI-272)e si- milares, e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dentre os mencionados acima. Também estão incluídos nesta definição os agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em tumores, como antiestrogênios, incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, inibidores 4(5) -imidazólicos de aroma- tase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY 117018, onapristona (FARESTON®); e antiandrogênicos, como flutamida, nilutamida, bicalu- tamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuti- camente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. Outros compostos químicos citotóxicos convencionais como os descritos em Wiemann et al., 1985, in Medical Oncology (Calabresi et aL, eds.), Capítulo 10, McMillan Publishing, também são aplicáveis aos métodos da presente invenção. Administração
[0174] O anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met e o agente de ati- vação de macrófagos podem ser administrados ao indivíduo juntos em uma mistura, simultaneamente como agentes únicos ou sequencial- mente como agentes únicos em qualquer ordem.
[0175] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met é administrado antes da administração do agente de ati- vação de macrófagos.
[0176] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met é administrado após a administração do agente de ativa- ção de macrófagos.
[0177] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met é administrado simultaneamente à administração do agente de ativação de macrófagos.
[0178] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met é administrado antes da administração do terceiro agente anticâncer.
[0179] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met é administrado após a administração do terceiro agente anticâncer.
[0180] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met é administrado simultaneamente à administração do terceiro agente anticâncer.
[0181] O período de tempo entre as administrações do anticorpo bi- específico anti-EGFR/c-Met e do agente de ativação de macrófagos ou da terceira terapia anticâncer pode ser de alguns minutos, como cerca de 1, 2, 5, 10, 30 ou 660 minutos ou várias horas, como cerca de 2, 4, 6, 10, 12, 24 ou 36 horas, ou como cerca de 2, 4, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 dias ou mais.
[0182] O anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met e o agente de ati- vação de macrófagos ou o terceiro agente anticâncer podem ser admi- nistrados em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual o anticorpo da invenção é administrado. Tais veículos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, ve- getal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, solução salina 0,4% e glicina a 0,3% podem ser usadas para formular o anticorpo biespecífico anti- EGFR/c-Met. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particulada. As mesmas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtração). Para preparações orais sólidas, assim como pós, cápsulas e comprimi- dos, aditivos e veículos adequados incluem gomas, açúcares, diluentes,
agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desinte- gração e similares. As preparações orais sólidas podem também ser re- vestidas com substâncias como açúcares, ou com um revestimento en- térico para modular o principal sítio de absorção. Para administração pa- renteral, o veículo pode compreender água estéril e outros excipientes podem ser adicionados para aumentar a solubilidade ou conservação. Suspensões ou soluções injetáveis podem também ser preparadas utili- zando veículos aquosos juntamente com aditivos adequados. Veículos adequados e formulações adequadas, inclusive de outras proteínas hu- manas, por exemplo, albumina sérica humana, são descritos, por exem- plo, em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21a Edição, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, EUA, Parte 5, "Pharmaceutical Manufacturing" páginas 691 a 1092, con- sulte especialmente as páginas 958 a 989.
[0183] As composições podem conter substâncias auxiliares farma- ceuticamente aceitáveis conforme exigido para aproximá-las das condi- ções fisiológicas, como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e agentes corantes, etc. A concentração do anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met e o agente de ativação de macrófagos na formulação farmacêutica pode variar, de me- nos que cerca de 0,5%, geralmente a ao menos cerca de 1% a tanto quanto 15%, 20%, 30%, 40% ou 50% em peso e pode ser selecionado com base principalmente na dose necessária, nos volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado. As composições farmacêuticas que compreendem formas sólidas podem conter de cerca de 0,1 mg a cerca de 2000 mg, como cerca de 1 mg, cerca de 5 mg, cerca de 10 mg, cerca de 25 mg, cerca de 50 mg, cerca de 100 mg, cerca de 150 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg ou cerca de 1000 mg de ingrediente ativo.
[0184] O modo de administração pode ser qualquer via adequada que libere o anticorpo ao hospedeiro, como administração parenteral, por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou sub- cutânea, pulmonar, transmucosa(oral, intranasal, intravaginal, retal), usando uma formulação em comprimido, cápsula, solução, pó, gel, partí- cula; e contida dentro de uma seringa, um dispositivo implantado, uma bomba osmótica, um cartucho, uma microbomba; ou outro meio reconhe- cido pela pessoa versada na técnica, como é bem conhecido na técnica. A administração sítio-específica pode ser realizada, por exemplo, por apli- cação intratumoral, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracap- sular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracere- broventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intra- cardíaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intra- pleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intra- vesical, intralesional, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou trans- dérmica. Geração de anticorpos biespecíficos anti-EGFR/c-Met usados nos méto- dos da divulgação
[0185] Um anticorpo anti-EGFR/c-Met exemplificador que pode ser usado nos métodos das divulgações é JNJ-372. JNJ-273 é caracteri- zado pelas seguintes sequências de aminoácidos: Braço de ligação ao EGFR >SEQ ID NO: 1 (HCDR1, braço de ligação ao EGFR)
TYGMH >SEQ ID NO: 2 (HCDR2, braço de ligação ao EGFR)
VIWDDGSYKYYGDSVKG >SEQ ID NO: 3 (HCDR3, braço de ligação ao EGFR)
DGITMVRGVMKDYFDY >SEQ ID NO: 4 (LCDR1, braço de ligação ao EGFR)
RASQDISSALV >SEQ ID NO: 5 (LCDR2, braço de ligação ao EGFR)
DASSLES >SEQ ID NO: 6 (LCDR3, braço de ligação ao EGFR)
QQFNSYPLT >SEQ ID NO: 7 (HCDR1, braço de ligação ao c-Met)
SYGIS >SEQ ID NO: 8 (HCDR2, braço de ligação ao c-Met)
WISAYNGYTNYAQKLQG >SEQ ID NO:9 (HCDR3, braço de ligação ao c-Met)
DLRGTNYFDY >SEQ ID NO: 10 (LCDR1, braço de ligação ao c-Met)
RASQGISNWLA >SEQ ID NO: 11 (LCDR2, braço de ligação ao c-Met)
AASSLLS >SEQ ID NO: 12 (LCDR3, braço de ligação ao c-Met)
QQANSFPIT >SEQ ID NO: 13 (VH, braço de ligação ao EGFR) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVR- QAPGKGLEWVAVIWDD-
GSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDG
ITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS >SEQ ID NO: 14 (VL, braço de ligação ao EGFR) AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQK- PGKAPKLLIYDASSLESGVPS-
RFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK >SEQ ID NO: 15 (VH, braço de ligação ao c-Met) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVR- QAPGHGLEWM-
GWISAYNGYTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY
YCARDLRGTNYFDYWGQGTLVTVSS >SEQ ID NO: 16 (VL, braço de ligação ao c-Met) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHK- PGKAPKLLIYAASSLLSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIK >SEQ ID NO: 17 HC1 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVR- QAPGKGLEWVAVIWDD-
GSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDG ITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP- SSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG- PSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE- PQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK >SEQ ID NO: 18 LC1 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQK- PGKAPKLLIYDASSLESGVPS-
RFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >SEQ ID NO: 19 HC2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVR- QAPGHGLEWM-
GWISAYNGYTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARDLRGTNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP- SSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG- PSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE- PQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK >SEQ ID NO: 20 LC2 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHK- PGKAPKLLIYAASSLLSGVPS-
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK- DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0186] Outros anticorpos biespecíficos anti-EGFR/c-Met publica- mente disponíveis podem também ser usados nos métodos da divulgação desde que demonstrem características similares quando comparados com JNJ-372, conforme descrito na patente US n° 9.593.164. Os anticorpos biespecíficos anti-EGFR/c-Met que podem ser usados nos métodos da di- vulgação podem também ser gerados pela combinação dos domínios de VH/VL que se ligam ao EGFR e dos domínios de VH/VL que se ligam ao c-Met que estão publicamente disponíveis e testam os anticorpos biespe- cíficos resultantes para suas características, conforme descrito na patente US n° 9.593.164.
[0187] Os anticorpos biespecíficos anti-EGFR/c-Met usados nos mé- todos da divulgação podem ser gerados, por exemplo, com o uso de troca de braço Fab (ou troca de metade da molécula) entre dois anticorpos bi- valentes monoespecíficos por meio da introdução de substituições na in- terface CH3 de cadeia pesada em cada metade da molécula para favo- recer a formação de heterodímero das duas metades de moléculas do anticorpo tendo especificidade distinta tanto no ambiente isento de célu- las in vitro como usando coexpressão.
A reação de troca do braço Fab é o resultado de uma reação de isomerização de ponte dissulfeto e disso- ciação-associação de domínios CH3. As pontes dissulfetos de cadeia pe- sada nas regiões de dobradiça dos anticorpos monoespecíficos parentais são reduzidas.
As cisteínas livres resultantes de um dos anticorpos mo- noespecíficos parentais formam uma ponte de dissulfeto intercadeias-pe- sadas com resíduos de cisteína de uma segunda molécula de anticorpo monoespecífico parental, e, simultaneamente, domínios CH3 dos anticor- pos parentais liberam e reformam por dissociação-associação.
Os domí- nios CH3 dos braços Fab podem ser manipulados para favorecer a hete- rodimerização em relação à homodimerização.
O produto resultante é um anticorpo biespecífico tendo dois braços Fab ou metades de moléculas que, se ligam, cada um(a), a um epítopo diferente, isto é, um epítopo em EGFR e um epítopo em c-Met.
Por exemplo, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser gerados com o uso da Tecnologia descrita na publicação de patente internacional n° WO2011/131746. A mutação F405L em uma cadeia pesada e a mutação K409R na outra cadeia pe- sada podem ser usadas no caso de anticorpos IgG1. Para anticorpos IgG2, uma IgG2 de tipo selvagem e um anticorpo IgG2 com as substitui- ções de F405L e R409K podem ser usadas.
Para anticorpos IgG4, uma IgG4 de tipo selvagem e um anticorpo IgG4 com as substituições de F405L e R409K podem ser usadas.
Para gerar anticorpos biespecíficos, o primeiro anticorpo bivalente monoespecífico e o segundo anticorpo bi- valente monoespecífico são manipulados para terem a mutação anterior- mente mencionada na região Fc, os anticorpos são incubados juntos sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sejam submetidas à isomerização da ligação de dissulfeto; gerando, assim, o anticorpo biespecífico pela troca do braço do Fab. As condições de incubação param ser idealmente restauradas para não re- dutoras. Agentes redutores exemplificadores que podem ser usados são 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), gluta- tiona, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína e beta-mercaptoetanol. Por exemplo, a incubação durante pelo menos 90 min, a uma tempera- tura de pelo menos 20 °C na presença de 25 mM de 2-MEA ou na pre- sença de pelo menos 0,5 mM de ditiotreitol a um pH 5-8, por exemplo pH 7,0 ou pH 7,4, pode ser usada.
[0188] Anticorpos biespecíficos anti-EGFR/c-Met usados nos mé- todos da divulgação podem também ser gerados com o uso de designs como o "Knob-in-Hole" (protuberância-em-cavidade, Genentech), CrossMAbs (Roche) e os anticorpos eletrostaticamente complementa- res (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), o LUZ-Y (Genentech), o corpo de domínio de engenharia de troca de fita (SEEDbody)(EMD Serono), e o Biclonic (Merus).
[0189] Na estratégia "knob-in-hole" ("protuberância-em-cavidade") (consulte, por exemplo, a publicação internacional n° WO 2006/028936) os aminoácidos selecionados que formam a interface dos domínios CH3 na IgG humana podem ser mutados em posições que afetam as intera- ções do domínio CH3 para promover a formação de heterodímero. Um aminoácido com uma cadeia lateral (orifício) é introduzido em uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antí- geno e um aminoácido com uma cadeia lateral grande (botão) é introdu- zido em uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno. Após a coexpressão dos dois anticorpos, um he- terodímero é formado como resultado da interação preferencial da cadeia pesada com uma "hole" (cavidade) com a cadeia pesada com uma "knob"
(protuberância). Pares de substituição de CH3 exemplificadores que for- mam uma "knob" (protuberância) e uma "hole" (cavidade) são (expressos como posição modificada no primeiro domínio CH3 da primeira cadeia pe- sada/posição modificada no segundo domínio CH3 da segunda cadeia pe- sada): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S e T366W/T366S_L368A_Y407V.
[0190] A tecnologia CrossMAbs, em adição ao uso da estratégia "knob-in-hole" ("protuberância-em-cavidade") para promover a troca de braço Fab utiliza as trocas de domínios CH1/CL em um meio-braço para assegurar o correto emparelhamento das cadeias leves do anti- corpo biespecífico resultante (consulte, por exemplo, a patente US n°
8.242.247).
[0191] Outras estratégias de entrecruzamento ("cross-over") podem ser usadas para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total da invenção pela troca de domínios variáveis ou constantes, ou de ambos os domínios, entre a cadeia pesada e a cadeia leve ou dentro da cadeia pesada nos anticorpos biespecíficos, em um braço ou em ambos os bra- ços. Estas permutações incluem por exemplo VH-CH1 com VL-CL, VH com VL, CH3 com CL e CH3 com CH1 conforme descrito nas publica- ções de patentes internacionais n° WO2009/080254, WO2009/080251, WO2009/018386 e WO2009/080252.
[0192] Podem ser utilizadas outras estratégias, como favorecimento da heterodimerização da cadeia pesada com o uso de interações ele- trostáticas pela substituição de resíduos positivamente carregados em uma superfície CH3 e de resíduos negativamente carregados em uma segunda superfície CH3, conforme descrito na publicação de patente US n° US2010/0015133; publicação de patente US n° US2009/0182127; publicação de patente US n° US2010/028637, ou pu- blicação de patente US n° US2011/0123532. Em outras estratégias, a heterodimerização pode ser favorecida pelas seguintes substituições (expressas como posições modificadas no primeiro domínio CH3 da pri- meira posição da cadeia pesada/posição modificada no segundo domí- nio CH3 da segunda cadeia pesada): L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, ou T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W con- forme descrito na publicação de patente US n° US2012/0149876 ou pu- blicação de patente US n° US2013/0195849.
[0193] A tecnologia SEEDbody pode ser utilizada para gerar anticor- pos biespecíficos da invenção. SEEDbodies têm, em seus domínios cons- tantes, resíduos de IgG selecionados substituídos por resíduos de IgA para favorecer a heterodimerização conforme descrito no pedido de patente US n° 20070287170.
[0194] As mutações são tipicamente realizadas ao teor de DNA em uma molécula como o domínio constante do anticorpo com o uso de mé- todos-padrão.
[0195] A presente invenção será agora descrita com relação aos se- guintes exemplos específicos não limitadores. Materiais e métodos PBMCs e isolamento de células NK e monócitos a partir de PBMCs
[0196] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e as células imunes isoladas (células NK e monócitos) foram adquiridas junto à Hemacare. As PBMCs foram isoladas de leucopaks coletados em centros de coleta registrados pela FDA da HemaCare seguindo as diretrizes de coleta de cGMP e cGTP de doadores humanos saudáveis autorizados pelo IRB. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram purificadas por centrifugação por gradiente de densidade e adquiridas junto à HemaCare em formato criopreservado e armazenadas em nitrogê- nio líquido até o uso.
[0197] Para alguns dos doadores, os leucopaks foram divididos em três maneiras de isolar PBMCs, células NK e monócitos do mesmo leucopak doador. As células NK foram isoladas com o uso de seleção negativa para CD56 e os monócitos foram isolados com o uso de se- leção negativa para CD14. As células NK isoladas e os monócitos fo- ram adquiridos junto à Hemacare em formato criopreservado e arma- zenados em nitrogênio líquido até o uso. Diferenciação de monócitos em macrófagos M1, M2a e M2c
[0198] Os monócitos (adquiridos junto à Hemacare) foram desconge- lados no meio XVIVO 15 suplementado com FBS a 10% e plaqueados em frascos T75 tratados com cultura de tecido. No dia 0, os monócitos foram plaqueados em meio com 50 ng/ml de M-CSF (n° de catálogo 216-MC- 025/CF adquirido junto à R&D Systems) para obter macrófagos M0. Para polarizar os macrófagos M0 em macrófagos M2a, no dia 5, o meio foi mu- dado com 50 ng/ml de M-CSF e 20 ng/ml de IL-4 (n° de catálogo 204-IL- 020/CF adquirido junto à R&D Systems) e 20 ng/ml de IL-13 (n° de catá- logo 213-ILB-025/CF adquirido junto à R&D Systems) e incubado durante 48 horas. Para polarizar os macrófagos M0 em macrófagos M2c, no dia 5, o meio foi trocado por 50 ng/ml de M-CSF e 20 ng/ml de IL-10 (n° de catá- logo 217-IL-025/CF adquirido junto à R&D Systems) e incubado por 48 horas. Para obter os macrófagos M1, no dia 6, o meio foi mudado com 50 ng/ml de M-CSF e 100 ng/ml de IFN-g (n° de catálogo 285-IF-100/CF ad- quirido junto à R&D Systems) e incubado em 24 horas. Os macrófagos M1, M2a e M2c diferenciados foram, então, removidos do frasco com o uso de Accutase e utilizados para os ensaios. Depleção de células NK e monócitos de PBMCs
[0199] A depleção de células NK foi realizada com o uso do kit II de seleção positiva de CD56 humano EasySep (n° de catálogo 17855)
junto à STEMCell Technologies e a depleção de monócitos foi realizada com o uso do kit II de seleção positiva de CD14 humano II (n° de catá- logo 17858) junto à STEMCell Technologies. As PBMCs (adquiridas junto à Hemacare) foram descongeladas em meio X-VIVO-15 com FBS a 10% e contadas. As PBMCs (10 milhões de células por depleção) fo- ram ressuspensas no tampão EasySep na concentração desejada de 100 milhões de células/ml. A depleção para as células NK e monócitos foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 50 µl do respectivo coquetel de seleção de anticorpos foram adiciona- dos e incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. As partí- culas magnéticas foram submetidas a vórtice por 30 segundos e 50 µl foram adicionados ao coquetel de anticorpos PBMCs+. Este foi incu- bado durante 3 minutos à temperatura ambiente e completado até 2,5 ml com o uso do tampão EasySep. Os tubos foram, então, colocados no EasySep Magnet (n° de catálogo 18000 junto à STEMCell Technolo- gies) e incubados durante 3 minutos. O sobrenadante foi, então, cuida- dosamente transferido para um novo tubo. A etapa de separação mag- nética foi repetida duas vezes para se obter PBMCs depletadas de cé- lulas NK e depletadas de monócitos. A depleção foi verificada com o uso de citometria de fluxo (conforme descrito abaixo) e estas PBMCs foram então utilizadas para o ensaio de Simple Western para detectar os teo- res de proteína de EGFR e de Met. Determinação da composição de células imunes dentro de PBMC
[0200] As PBMCs (adquiridas junto à Hemacare) foram desconge- ladas em meio X-VIVO-15 com FBS a 10% e contadas. Após a conta- gem, ~300.000 a 400.000 células/cavidade foram plaqueadas (em tri- plicatas) e a placa foi centrifugada a 4°C a 1500 rpm durante 3 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com 150 µl/cavidade de DPBS. A placa foi novamente centrifugada até formar péletes, conforme descrito acima. A solução de estoque para o corante
Live/Dead de infravermelho (IR) próximo (Life Technologies n° de ca- tálogo L10119) foi produzida pela adição de 150 µl de DMSO ao con- teúdo de corante Live/Dead.
A solução de trabalho foi, então, composta pela adição de 50 µl de estoque a 10 ml de DPBS. 50 ul da solução de trabalho foram, então, adicionados a cada cavidade da placa e ressus- pensos.
A placa foi incubada em escuro (coberta com folha metálica) à temperatura ambiente durante 30 minutos.
Ao final da incubação, as placas foram centrifugadas durante 5 minutos a 4°C e 1500 rpm.
As células foram então lavadas com tampão de FACS/corante (BD n° 554657) pela adição de 150 µl por cavidade.
Os anticorpos para o pai- nel de citometria de fluxo multicolorido foram preparados em um co- quetel de acordo com os cálculos e 25 µl/cavidade foram adicionados.
Os anticorpos usados no painel incluíram CD19 (FITC), CD56 (BV711), Cd11b (BUV395), CD14 (PE-cy7), CD3 (BV605), CD4 (BV785), CD8 (PerCP-cy5.5), CD25 (PE) e PD-1 (APC). A placa foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
Uma placa de compen- sação foi preparada com o uso de microesferas de compensação e os anticorpos de canal único do painel acima de acordo com os cálculos e foi incubada por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente.
To- das as placas foram centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos a 4°C e lavadas duas vezes com 150 µl de tampão FACS.
A placa de ensaio foi ressuspensa em 150 µl de tampão FACS e a placa de compensa- ção, em 200 ul de tampão FACS.
As placas foram executadas em For- tessa onde a compensação foi ajustada com o uso dos valores de con- trole de canal único a partir da placa de microesfera de compensação.
A placa de ensaio foi, então, executada a uma vazão de 1,5 µl/s com a compensação aplicada.
Os dados foram então exportados e analisa- dos em FLOWJo, onde a sincronização adequada foi feita para obter a porcentagem de cada uma das populações de células imunes individu- ais dentro das PBMCs.
Ensaio de proliferação e apoptose
[0201] Células HCI-H1975 (também chamadas na presente inven- ção de células H1975) foram obtidas junto à ATCC e cultivadas em RPMI (Invitrogen, n° de catálogo 72400-047) suplementado com Hi FBS a 10%, 1X de NEAA, 1X de piruvato de sódio. Para o ensaio de prolife- ração e apoptose usando Incucyte, as células H1975 foram infectadas com reagente lentiviral Incucyte NucLight Red (n° de catálogo 4476, dis- ponível junto à Essen Biosciences) e selecionadas com 1 µg/ml de pu- romicina para gerar células H1975 NucRed. Estas células foram plaque- adas em meio isento de vermelho de RPMI-fenol, suplementado com HI FBS a 10%, 1X de NEAA, 1X de piruvato de sódio para o experimento.
[0202] As células H1975-NucRed foram dissociadas com o uso de tampão de dissociação celular Invitrogen (uma vez que a tripsina desin- tegra os receptores/moléculas de superfície celular) e contadas. As célu- las foram centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante foi removido. Os péletes foram então ressuspensos em volume adequado de meio isento de vermelho de fenol. As células NucRed (células-alvo) foram plaqueadas a 12.500 células/cavidade em 100 µl de meio de ver- melho de fenol em placas pretas de fundo plano tratadas com cultura de tecido e incubadas a 37°C e CO2 a 5% de um dia para o outro. No dia seguinte, as PBMCs (adquiridas junto à HemaCare) foram descongela- das em meio X-VIVO-10 com FBS a 10% e contadas. As PBMCs foram diluídas na concentração de 125.000 células por cavidade em 50 µl, para se obter uma razão entre efetor:alvo (E:T) de 10:1. O reagente Incucyte Anexina V Verde (n° de catálogo 4642 adquirido junto à Essen Bioscien- ces) foi ressuspenso em meio de 100 µl e usado para corar 100 cavida- des ou uma placa de 96 cavidades. O reagente de anexina diluído foi adicionado às PBMCs ou ao meio. 50 ul das PBMCs/meio (com anexina) foram adicionados às cavidades adequadas da placa de ensaio. Os anti- corpos terapêuticos foram então diluídos em série a 1:5 e preparados a uma concentração 4X de acordo com os cálculos e 50 µl do anticorpo desejado foram adicionados às cavidades adequadas da placa de en- saio. As placas de ensaio foram então colocadas nas fendas adequadas no Incucyte S3 e equilibradas no Incucyte durante 20 minutos antes da varredura. As placas foram varridas a cada 4 horas com 4 imagens/cavi- dade/varredura até 120 horas para determinar a proliferação e a apop- tose das células-alvo ao longo do tempo. A fluorescência das células-alvo (NucRed) e a fluorescência de anexina (verde) foram quantificadas com o uso da definição de processo e a área Total de NucRed H1975 (µm2/ca- vidade) foi calculada, a qual mostra a proliferação das células-alvo. A Área Total de NucRed H1975 Verde (um2/cavidade) também foi calcu- lada, a qual mostra a apoptose das células-alvo. A partir dessa análise, Graphpad Prism foi usado para calcular a área sob a curva (AUC - "area under the curve") e as curvas de resposta de dose não lineares foram geradas. Simple Western para a detecção de teores de proteína de EGFR, c- Met, pEGFR e pMet
[0203] Células H1975 e células SNU-5 foram obtidas junto à ATCC e cultivadas em RPMI (Invitrogen, n° de catálogo 72400-047) suple- mentado com Hi FBS a 10%, 1X de NEAA, 1X de piruvato de sódio. As células H1975 foram dissociadas com o uso de tampão de dissociação celular e cada suspensão celular foi colocada em um tubo cônico de 50 ml e contada. Em ensaios com SNU-5 (linhagem de células em sus- pensão), a suspensão de células foi transferida para um tubo cônico de 50 ml e contada. As células foram peletizadas a 1300 rpm durante 5 minutos a 4°C e ressuspensas em volume adequado de meio RPMI. As células-alvo foram plaqueadas a uma concentração de 100.000 cé- lulas por cavidade em placas de 6 cavidades e incubadas de um dia para o outro. No dia seguinte, as PBMCs (adquiridas junto à Heme- Care) foram descongeladas em meio X-VIVO-15 com FBS a 10% e contadas. As PBMCs foram diluídas e colocadas em placas em uma concentração de 1.000.000 células por cavidade, para se obter uma razão entre E:T de 10:1. Quando as células imunes individuais, como células NK, monócitos ou macrófagos, foram usadas, elas foram diluí- das e plaqueadas a uma concentração de 500.000 células por cavi- dade, para se obter uma razão entre E:T de 5:1. Os anticorpos tera- pêuticos foram então preparados em uma concentração 2X de acordo com os cálculos e 1,5 ml de anticorpo desejado foi adicionado às cavi- dades adequadas da placa de ensaio. As placas foram incubadas du- rante 48 horas (para a maioria dos ensaios) ou para diferentes pontos no tempo.
[0204] Ao final do período de incubação, 100 µl de tampão de lise recém-preparado foram adicionados a cada cavidade e incubados em gelo durante 5 minutos. O tampão de lise foi preparado com o uso de 10 ml de tampão RIPA (ThermoFisher; n° de catálogo 89901) com 1 pastilha de inibidor de fosfatase PhosSTOP (Sigma; n° de catálogo 4906837001) e 1 pastilha de inibidor de Protease cOmpleteTM, Mini, coquetel inibidor de Protease isento de EDTA (Sigma; n° de catálogo 04693159001). Com o uso de um raspador de placa, os lisados foram transferidos para um tubo Eppendorf de 2 ml e incubados em gelo du- rante 30 minutos com vortexação ocasional. Os lisados foram centrifu- gados a 13.200 rpm durante 25 minutos a 4°C e os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos. A concentração de proteína dos lisados foi determinada com o uso do kit de ensaio de proteína Pierce BCA (n° de catálogo 23227 obtido junto à ThermoFisher) de acordo com o pro- tocolo do fabricante. Padrões pré-diluídos de albumina sérica bovina Pi- erce padrão (n° de catálogo 23208 obtido junto à ThermoFisher) foram usados para se obter a curva padrão para o ensaio. Resumidamente, 25 µl dos padrões pré-diluídos foram adicionados em triplicatas e 25 µl das amostras (diluídas a 1:5) foram adicionados em duplicatas em uma placa de fundo plano de 96 cavidades. 200 ul do reagente de trabalho BCA preparado foram adicionados por cavidade. A placa foi misturada suavemente durante 1 minuto no agitador de placa e incubada durante 30 minutos a 37°C coberta com folha metálica. Após a incubação, a placa foi deixada resfriar à temperatura ambiente durante 5 minutos an- tes da medição da quantificação de proteína com o uso do espectrofo- tômetro SpectraMAX a 562 nm.
[0205] Para realizar a eletroforese com base em capilar com o uso de PeggySue, o módulo de separação Peggy Sue de 12 a 230 kDa (n° de catálogo SM-S001 adquirido junto à Protein Simple) foi utilizado so- zinho com o módulo de detecção anticoelho (n° de catálogo DM-001) e o anticorpo secundário anticamundongo (n° de catálogo 042-205) ambos adquiridos junto à Protein Simple. As amostras, os anticorpos e os reagentes foram preparados, e a eletroforese com base em capilar foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, os componentes de 2 pacotes padrão foram usados para preparar a escada biotinilada e a mistura mestre 5X. Os lisados de proteína foram diluídos a uma concentração de 0,25 mg/ml com o uso de tampão de amostra 0,1X de acordo com os cálculos com o uso dos valores do ensaio de proteína BCA. Quatro (4) partes de lisado preparado foram combinadas com 1 parte de mistura mestre fluorescente 5X para obter a concentração final de 0,2 mg/ml. As amostras e o somador biotinilado foram desnaturados com o uso de um termociclador de PCR a 95°C durante 5 minutos. Os anticorpos primários utilizados para o ensaio foram diluídos da seguinte forma com o uso do diluente de anticorpo: EGFR (n° de catálogo 2646, disponível junto à Cell Signaling Techno- logies) a 1:50; pEGFR (n° de catálogo AF1095, disponível junto à R&D Systems) a 1:50; c-Met (n° de catálogo 3148, disponível junto à Cell Signaling Technologies) a 1:50; pMet (n° de catálogo 3077, disponível junto à Cell Signaling Technologies) a 1:50 e actina de controle de car- regamento (n° de catálogo 4970 disponível junto à Cell Signaling Technologies) a 1:200 ou (n° de catálogo 4947, disponível junto à Cell Signaling Technologies) a 1:100. A escada biotinilada, as amostras, os anticorpos primários e secundários, as matrizes de separação e o em- pilhamento foram adicionados à placa Peggy Sue de 384 cavidades, de acordo com o layout da placa. A placa foi centrifugada a 2500 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente antes de carregá-la na má- quina. Os dados foram analisados com o uso do software Compass for SW. Os picos foram determinados com base no peso molecular das proteínas de interesse e a área sob a curva (AUC) foi calculada para cada proteína em cada uma das amostras. Os valores de densitometria para a proteína de interesse foram, então, normalizados para a actina de controle de carregamento para cada uma das amostras e, então, normalizados para o controle sem tratamento para obter alterações re- lativas com o tratamento. Ensaio de trogocitose de imageamento confocal
[0206] Os macrófagos diferenciados foram coletados e colocados em placas ultra CellCarrier96 a 1.00.000 células/cavidade (Perkin-El- mer; n° de catálogo 6055302) de um dia para o outro. Os ensaios foram realizados com o uso de células-alvo aderidas e não aderidas. Para en- saios com células-alvo aderidas, as células H1975 NucLight Red foram plaqueadas a 20.000/cavidade, aderidas durante 4 horas, então trata- das com coquetel Ab marcado durante 1 hora a 4°C. Para ensaios com células-alvo não aderidas, as células-alvo sozinhas foram coradas com JNJ-372 marcado com AF647 ou Abs de controle. Todos os estudos de imageamento ao vivo foram realizados a uma razão entre E:T de 5:1. O coquetel de anticorpos de marcação compreendia anti-CD11b (BD Pharmingen; n° de catálogo 557701), anti-CD14 (BD Pharmingen; n° de catálogo 562689), e 1:8.000 Hoechst33342 (Biotium; n° de catálogo
40046). As imagens foram obtidas em intervalos de 11 minutos em um Perkin-Elmer Phenix Opera com o uso de uma objetiva de imersão em água de 60x e analisadas com o uso de Columbus. Ensaio de ADCC
[0207] As PBMCs foram descongeladas um dia antes do ensaio em meio X-VIVO 10 (Lonza, n° de catálogo 04-380Q) suplementado com FBS a 20% inativado por aquecimento (GIBCO, n° de catálogo 16140) e descansadas de um dia para o outro sob condições de incubação padrão (37°C, CO2 a 5%, 95% de umidade). No dia do ensaio, as células-alvo NCI-H1975 foram carregadas com reagente DELFIA BATDA (PerkinEl- mer Inc., n° de catálogo C136-100) durante 30 minutos, lavadas 3 vezes e ressuspensas em meio RPMI. As PBMCs e as células-alvo carregadas com BATDA foram adicionadas a placas de 96 cavidades de fundo em U em uma razão entre células efetoras e células-alvo de 25:1 juntamente com concentrações crescentes de anticorpos de teste. O meio RPMI ou meio RPMI contendo Triton X-100 a 2% (EMD Millipore, n° de catálogo 648463) foi adicionado à cavidades de controle para medição de libera- ção espontânea e máxima de TDA, respectivamente. As placas foram incubadas durante 2 horas, após o que 20 ul do sobrenadante foram re- movidos e combinados com 200 µl de solução de európio DELPHIA (Per- kin Elmer, n° de catálogo C135-100). Após incubação à temperatura am- biente durante 15 minutos, as Unidades de Fluorescência Relativas (RFU - "Relative Fluorescence Units") foram medidas com o uso de um Leitor de Placa Multilabel EnVision 2104 (PerkinElmer, n° de catálogo 2104- 0010). O percentual de lise foi calculado como (Liberação Experimental - Liberação espontânea)/(Liberação máxima - Liberação espontânea) X
100. Diferenciação de monócitos em macrófagos M1, M2a e M2c
[0208] Monócitos (Hemacare) foram descongelados no meio XVIVO- 15 e diferenciados com 50 ng/ml de M-CSF (R&D Systems; n° de catálogo
216-MC-025/CF) durante 6 dias para obter macrófagos M0. Para obter macrófagos M1, no dia 5, os macrófagos M0 foram polarizados com 50 ng/ml de M-CSF e 100 ng/ml de IFN-γ (R&D Systems; n° de catálogo 285- IF-100/CF) durante 48 horas. Para obter macrófagos M2, no dia 5, os ma- crófagos M0 foram polarizados com 20 ng/ml de IL-4 (R&D Systems; n° de catálogo 204-IL-020/CF) e IL-13 (R&D Systems; n° de catálogo 213-ILB- 025/CF) para M2a ou 20 ng/ml de IL-10 (R&D Systems; n° de catálogo 217-IL-025/CF) para macrófagos M2c durante 48 horas. Estudos in vivo
[0209] A linhagem de células H1975 foi implantada por via subcu- tânea em camundongos BALB/c nude fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl, Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EUA). Quando os tumores estavam em média com 72 ± 8,7 mm 3, o anticorpo anti-mCSF-1R intraperitoneal (400 µg/camundongo) foi ad- ministrado três vezes por semana durante a duração do estudo, come- çando cinco dias antes do início da dosagem do composto para facilitar a depleção dos macrófagos. No dia 5 (volume médio do tumor = 102 ± 36,6 mm3), eles foram tratados duas vezes por semana por dosagem intraperitoneal com 10 mg/kg de anticorpo (Ab) de controle de isótipo, JNJ-372, ou anticorpo (Ab) EGFR/cMet IgG2σ. Os tumores foram amostrados para monitorar a infiltração de macrófagos após duas do- ses de composto. Para o estudo do modelo de tumor SNU5, as células SNU5 foram implantadas por via subcutânea em camundongos CB17/SCID de 7 a 8 semanas de idade (HFK Bio-Technology Co. Ltd., Peijing, China). Quando os tumores estavam em média com 155 ± 21,4 mm3, os camundongos foram tratados duas vezes por semana com solução salina tamponada com fosfato intraperitoneal (PBS), JNJ-372 (5 mg/kg), ou anticorpo EGFR-cMet IgG2σ (5 mg/kg), durante três se- manas. Para ambos os estudos, as medições do tumor e os pesos cor-
porais foram registrados duas vezes por semana. A inibição do cresci- mento tumoral (TGI - "tumor growth inhibition") foi calculada no dia final onde >80% de camundongos de controle permaneceram no estudo, com o uso do cálculo [1-(T/C)]*100. Todos os experimentos in vivo fo- ram realizados de acordo com o Johnson and Johnson Institutional Ani- mal Care and Use Committee (Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais Johnson e Johnson) e o Guide for Care and Use of Labo- ratory Animals (Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório). Determinação baseada em citometria de fluxo de macrófagos associados ao tumor
[0210] Os tumores foram excisados dos camundongos, pesados, sec- cionados em pedaços de 2 a 4 mm, colocados em tubos em C (Miltenyi, n° de catálogo 130-093-237) contendo 2,5 ml de RPMI e mantidos em gelo. De acordo com as instruções do fabricante, as enzimas liofilizadas contidas em um Kit de Dissociação d Tumor Humano (Miltenyi, n° de ca- tálogo 130-095-929) foram reconstituídas e um coquetel de enzimas 2x foi preparado e os tumores foram dissociados em um Dissociador Gentle- MACS Octo (Miltenyi, n° de catálogo 130-095-937) com o uso do protocolo do fabricante "h_tumor_01" seguido de dois ciclos de incubação a 37°C durante 30 minutos. As células dissociadas foram lavadas duas vezes em tampão de coloração FACS (BD Pharmingen, n° de catálogo 554657) e passadas através de um filtro de células Falcon de 40 µm (Corning, n° de catálogo 352340). As células foram incubadas em GolgiPlug (BD, n° de catálogo 555029) diluídas a 1:1000 em tampão FACS e incubadas durante 3 horas a 37°C, lavadas duas vezes, e ressuspensas em 100 µl de coque- tel de marcação de anticorpo. O coquetel de anticorpos consistiu em anti- CD45 (n° de catálogo 103138), anti-F4/80 (n° de catálogo 123137), anti- Ly6G (n° de catálogo 127639), anti-MHCII (n° de catálogo 107612), anti- EpCAM (n° de catálogo 324214), anti-PD1 (n° de catálogo 135231), anti-
PD-L1 (n° de catálogo 393606), anti-CD206 (n° de catálogo 141729) dis- ponível junto à BioLegend, anti-CD11b (n° de catálogo 563553) e anti- Ly6C (n° de catálogo 561237) disponível junto à Becton-Dickinson, anti- iNOS (n° de catálogo 25-5920-82) e corante fixável Live/Dead (n° de catá- logo L10119) disponível junto à Invitrogen. As células foram incubadas com anticorpos marcadores de superfície celular externos durante 30 mi- nutos a 4°C protegidos da luz, lavadas duas vezes com PBS, e ressuspen- sas em PBS contendo corante Live/Dead fixável, incubadas durante 30 minutos a 4°C, e lavadas duas vezes com tampão FACS (BD Pharmingen; n° de catálogo 554657). As células foram fixadas/permeabilizadas de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, n° de catálogo 88- 8824-00), incubadas com anticorpos alvos internos durante 30 minutos a 4°C, lavadas 2x com tampão FACS, e ressuspensas em 200 µl para aná- lise em BD LSR Fortessa. A compensação foi realizada com o uso de mi- croesferas UltraComp eBeads (para anticorpos; Invitrogen, n° de catálogo 01-2222-42) e microesferas reativas de amina ArC (para corante Live/Dead fixável, Invitrogen, n° de catálogo A10346). Os controles de FMO foram realizados para todos os marcadores. Para determinar a de- pleção de macrófagos associados ao tumor, os macrófagos foram defini- dos como CD45+ CD11b+ Ly6C- Ly6G- F4/80+. Ensaio de MSD Multi-plex e análise estatística
[0211] Para experimentos em PBMC, células NK e monócitos, as cé- lulas NCI-H1975 foram plaqueadas em placas de 96 cavidades e deixa- das incubar de um dia para o outro a 37°C e CO2 a 5%. No dia seguinte, as PBMCs, monócitos ou células NK foram adicionados a uma razão de 10:1, 5:1 e 5:1, respectivamente. Para os experimentos de macrófagos, os monócitos foram diferenciados conforme anteriormente descrito, dis- sociados com o uso de StemPro de Acutase (Gibco, n° de catálogo A11105-01) e colocados em placas de 96 cavidades e deixados incubar de um dia para o outro a 37°C e CO2 a 5%. No dia seguinte, as células
NCI-H1975 foram adicionadas a uma razão entre E:T de 5:1. As células foram tratadas com controle de isótipo, JNJ-61186372 ou IgG2Sigma em concentrações variadas e incubadas a 37°C e CO2 a 5% por 4 horas, 24 horas, 48 horas e/ou 72 horas. No momento designado, as placas foram centrifugadas a 1200 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e avaliado com o uso de formatos U-plex e V- plex MesoScale Discovery (MSD) para os respectivos ensaios de citocina de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, para as pla- cas em U-plex, no dia anterior ao ensaio, as placas foram revestidas com o anticorpo e os ligantes de acordo com o protocolo do fabricante e incu- badas em um agitador orbital a 4°C de um dia para o outro. No dia do experimento, as placas em U-plex ou em V-plex foram lavadas 3X com tampão de lavagem MSD e os sobrenadantes, padrões e calibradores foram adicionados às placas e testados de acordo com o protocolo do fabricante. As placas foram lidas em um instrumento MSD Sector e ana- lisadas com o uso de GTS Spotfire para obter os teores calculados (em pg/ml) para cada citocina com o uso da curva padrão.
[0212] A partir das concentrações calculadas, a área sob a curva (AUC) foi calculada pelo método trapezoidal para cada tratamento, tipo de célula e tempo de incubação a fim de comparar a magnitude da resposta. Os dados de resposta foram excluídos se o valor observado estivesse abaixo do limite de detecção inferior, e a AUC só foi calcu- lada quando houve ao menos 6 observações válidas das 8 concentra- ções de dose. Um mapa de calor foi, então, gerado para ilustrar a dis- ponibilidade de dados (nenhum dado, dados insuficientes ou dados de AUC calculáveis) em todas as citocinas e condições. Os mapas de ca- lor de AUC transformada por log foram então produzidos com o uso do tempo de incubação e limitados às citocinas com ao menos uma AUC mensurável no tipo de célula H1975+PBMC. Todos os mapas de calor foram produzidos com o uso do pacote heatmap.2 no software estatís- tico R versão 3.5.0 (R Core Team 2018; R: A language and environ- ment for statistical computing; http://www.R-project.org/). Finalmente, a alteração relativa do tratamento com JNJ-372 e IgG2σ em compara- ção com o isótipo foi calculada em cada condição e gráficos de barras ou curvas de dose foram gerados com o uso de Graphpad Prism. Exemplo 1. Os efeitos antiproliferativos e apoptóticos mediados por JNJ- 372 sobre as células tumorais são acionados por interações de Fc com as células imunes
[0213] Para avaliar o efeito da interação de Fc sobre os três meca- nismos antitumorais de JNJ-372, JNJ-372 foi manipulado em uma mo- lécula de Fc silenciosa pela substituição de IgG1 do tipo selvagem de JNJ-372 por uma IgG2sigma efetora silenciosa (IgG2sigma contendo mutações V234A G237A P238S H268A V309L A330S P331S quando comparada à IgG2 do tipo selvagem) (JNJ-372.IgG2sigma) com o uso de métodos de clonagem padrão. O anticorpo efetor silencioso manipu- lado é chamado de JNJ-372.IgG2sigma (ou IgG2s em algumas figuras). JNJ-372 é produzido em linhagens de células que incorporam baixos teores (<9%) de fucose para acentuar a ligação ao FcγRIII/ CD16 e ADCC. Portanto, como outro controle, JNJ-372 também foi expresso em uma célula CHO que incorpora o nível normal de fucose; esta molécula é chamada de JNJ-372.NF (NF: fucose normal). O extermínio de células tumorais foi avaliado com o uso de células NCI-H1975 (n° de catálogo ATCC CRL-5908); a linhagem de células expressa L858R/T790M EGFR mutante e c-Met do tipo selvagem.
[0214] Células que expressam NCI-H1975 NucLight Red foram tra- tadas com controle de isótipo, JNJ-372, JNJ-372.IgG2s ou JNJ-372.NF e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs na razão entre efe- tor:alvo de 10:1 e a proliferação de células NCI-H1975 foi avaliada ao longo de 5 dias após o início das culturas concomitantes. A presença de
PBMCs acentuou a capacidade de JNJ-372 de inibir a proliferação de células tumorais ao longo do tempo de uma maneira dose-dependente (Figura 1) enquanto que JNJ-372 não inibiu a proliferação na ausência de PBMCs nas concentrações testadas (Figura 2).
[0215] Para confirmar que o engate de Fc nas PBMCs foi respon- sável pelo efeito, as células que expressam H1975 NucLight Red foram tratadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma e JNJ-372.NF e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs na razão entre E:T de 10:1 por 4, 24, 48, 72 ou 96 horas, após o que a proliferação e a apoptose de células H1975 foram avaliadas. A presença de PBMCs intensificou os efeitos antiproliferativos dose-dependentes e a apoptose dose-depen- dente (medida por positividade de anexina) induzidos por JNJ-372 a 24,48, 72 e 96 horas. Nenhum efeito ou efeitos mínimos foram vistos com isótipo ou JNJ-372.IgG2sigma. A Figura 3 mostra a resposta à dosagem da inibição mediada por controle de isótipo, JNJ-372, JNJ-
372.IgG2sigma ou JNJ-372.NF da proliferação de células H1975 na presença ou ausência de PBMCs após 72 horas de cultura. A Figura 4 mostra a resposta à dosagem da apoptose mediada por controle de isótipo, JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou JNJ-372.NF na presença ou ausência de PBMCs após 48 horas de cultura. JNJ-372.NF teve um efeito parcial sobre a proliferação (Figura 3) e a apoptose (Figura 4) quando comparado com JNJ-372, sugerindo que FcγRIII desempenha um papel, mas não leva em conta inteiramente os efeitos mediados pela interação de Fc.
[0216] Nos ensaios, as PBMCs de sete doadores diferentes na ra- zão entre efetor:alvo de 10:1 foram usadas. Os valores de IC 50 e a % máxima de extermínio no ensaio de proliferação de NCI-H1975 são mostrados na Tabela 1 para seis doadores. As PBMCs de um doador não tiveram efeito. A variabilidade no IC50 e na % máxima de extermínio foi observada através das PBMCs obtidas de diferentes doadores.
Tabela 1. 72 horas 48 horas Número do doador IC50 (ng/ml) % máxima de extermínio IC50 (ng/ml) % máxima de extermínio 1 1,2 43,7 2,99 31,8 2 0,776 53,7 1,57 36,6 3 4,87 72,3 6,93 52,6 4 4,44 57,8 4,36 40,5 5 0,59 70,5 0,79 43,9 7 0,567 34,7 0,76 28,3 Exemplo 2. A regulação negativa mediada por JNJ-372 de proteína de EGFR e de c-Met e sua sinalização a jusante em linhagens de células tu- morais de EGFR mutante é mediada por interações de Fc com células imunes
[0217] A presença de células imunes (PBMCs) potencializou a regu- lação negativa mediada por JNJ-372 de proteína de EGFR e de c-Met e a inibição da fosforilação das mesmas.
[0218] As células NCI-H1975 foram tratadas com 10 µg/ml de isó- tipo ou JNJ-372 e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs de um doador na razão entre E:T de 10:1 durante 4, 24, 48 ou 72 horas e a quantidade de EGFR, c-Met e pEGFR (pY1173) foi medida. A actina foi usada como controle de carregamento. A presença de PBMCs potenci- alizou a regulação negativa mediada por JNJ-372 de EGFR, c-Met e pEGFR (pY1173) em todos os pontos de tempo testados. A Figura 5 mostra a imagem de eletroforese com base capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) mostrando proteínas de EGFR, c-Met e pE- GFR em amostras tratadas com controle de isótipo ou JNJ-372 e culti- vadas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura. A Figura 6 mostra a quantidade relativa de EGFR em cada amostra. A Figura 7 mostra a quantidade relativa de pEGFR pY1173 em cada amostra. A Figura 8 mostra a quantidade relativa de c-Met em cada amostra. As amostras foram normalizadas para a quantidade da actina de controle de carregamento presente em cada amostra e, então, para a amostra de controle (sem tratamento).
[0219] As PBMCs de sete doadores foram testadas quanto à sua ca- pacidade de potencializar a inibição mediada por JNJ-372 dos teores de proteína de EGFR e c-Met e de pEGFR. A variação foi observada entre as PBMCs do doador. As PBMCs dos doadores 1,3,4 e 6 foram mais potentes na potencialização dos efeitos mediados por JNJ-372. A Figura 9 mostra a imagem de eletroforese com base capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) mostrando proteínas de EGFR, c-Met e pEGFR em amostras tratadas com controle de isótipo ou JNJ-372 cultivadas na presença ou ausência de PBMCs de sete doadores diferentes conforme indicado na figura. A Figura 10 mostra a quantidade relativa de EGFR em cada amos- tra. A Figura 11 mostra a quantidade relativa de pEGFR pY1173 em cada amostra. A Figura 12 mostra a quantidade relativa de c-Met em cada amostra. As amostras foram normalizadas para a quantidade da actina de controle de carregamento presente em cada amostra e, então, para a amostra de controle (sem tratamento). Exemplo 3. A presença de monócitos ou macrófagos é suficiente e ne- cessária para a potencialização mediada por Fc do efeito inibidor de JNJ-372 sobre a sinalização de EGFR e c-Met
[0220] A composição das células imunes dentro das PBMCs de sete doadores diferentes usadas no Exemplo 2 foi avaliada com o uso de citometria de fluxo multicolorida para entender a variação na capacidade das várias amostras de PBMC para potencializar a capacidade de JNJ- 372 para regular negativamente a sinalização de EGFR e de c-Met. A variabilidade foi detectada entre os doadores na porcentagem das célu- las imunes individuais (dados não mostrados). Uma correlação foi reali- zada com a porcentagem das células imunes individuais em cada um dos 7 doadores e a capacidade de cada uma das PBMCs doadoras me- diar a regulação negativa de EGFR/ pEGFR /c-Met. Nenhuma correla- ção foi observada entre células NK, células B ou células T e a capaci- dade das PBMCs para potencializar a modulação negativa de EGFR,
pEGFR ou c-Met (dados não mostrados). Entretanto, uma correlação positiva foi identificada entre a % de monócitos nas PBMCs e a capaci- dade das PBMCs de potencializar a modulação negativa dos teores da proteína de EGFR (Figura 13), entre a % de monócitos nas PBMCs e a capacidade das PBMCs de potencializar a modulação negativa de pE- GFR (Figura 14) e entre a % de monócitos nas PBMCs e a capacidade das PBMCs de potencializar a modulação negativa de teores de prote- ína de c-Met (Figura 15). Isto sugeriu que uma porcentagem mais alta de monócitos nas PBMCs é necessária para a regulação negativa de sinal mediada por JNJ-372.
[0221] As PBMCs de um doador foram depletadas de células NK ou monócitos e o efeito das PBMC depletadas de NK- ou de monócitos na modulação negativa mediada por JNJ-372 de vias EGFR e c-Met foi avaliado. As células H1975 foram tratadas com 10 µg/ml de controle de isótipo ou JNJ-372 e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs depletadas de células NK ou PBMCs depletadas de monócitos obtidas de um doador a uma razão entre E:T de 10:1 durante 48 horas. Consis- tente com os resultados anteriores, a presença de PBMCs aumentou a regulação negativa mediada por JNJ-372 de EGFR, pEGFR e c-Met na linhagem de células H1975. Embora a depleção das células NK tivesse apenas um efeito marginal, a depleção dos monócitos das PBMCs re- verteu significativamente a capacidade das PBMCs de potencializar a modulação negativa de sinal mediada por JNJ-372. A Figura 16 mostra a imagem de eletroforese com base capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detectando os teores de proteína de EGFR, c-Met e pE- GFR em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs de- pletadas de células NK ou PBMCs (mono) depletadas de monócitos de um doador conforme indicado na figura. A Figura 17 mostra a quanti-
dade relativa de EGFR em NCI-H1975 tratadas com JNJ-372 ou con- trole de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs depletadas de células NK ou PBMCs (mono) depletadas de monócitos de um doador conforme indicado na figura. A Figura 18 mos- tra a quantidade relativa de pEGFR (pY1173) em NCI-H1975 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs depletadas de células NK ou PBMCs (mono) depletadas de monócitos de um doador conforme indicado na figura. A Figura 19 mostra a quantidade relativa de c-Met em NCI- H1975 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs depletadas de células NK ou PBMCs (mono) depletadas de monócitos de um doador conforme indicado na figura. As amostras foram normalizadas para a quantidade da actina de controle de carregamento presente em cada amostra e, então, para a amostra de controle (sem tratamento).
[0222] Para avaliar a função do compartimento de mieloide adicio- nalmente, o efeito de monócitos ou de macrófagos M1 isolados de um doador de PBMCs na regulação negativa por interação de Fc de JNJ- 372 foi avaliado. Os macrófagos M1 foram obtidos pela diferenciação dos monócitos de duas formas, com M-CSF e GM-CSF para avaliar quaisquer efeitos diferenciais potenciais. As células H1975 foram tra- tadas com 10 µg/ml de isótipo, JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma e cul- tivadas na presença ou ausência de PBMCs de um doador na razão entre E:T de 10:1 (para PBMCs) ou de 5:1 (para células imunes indivi- duais (monócitos, células NK, macrófagos MCSF M1 ou GMCSF M11) durante 48 horas. A presença de PBMCs acentuou a regulação nega- tiva mediada por JNJ-372 de proteínas EGFR, pEGFR e c-Met. Em- bora as células NK não tenham um efeito significativo, os monócitos isolados ou macrófagos M1 (diferenciados por M-CSF ou GM-CSF) do mesmo doador de PBMC acentuou significativamente a capacidade de modulação negativa de sinal mediada por JNJ-372. Isto sugeriu que a linhagem de mieloide é suficiente para interação de Fc e intensificação mediada por PBMC na regulação negativa do sinal de JNJ-372. A Fi- gura 20 mostra a imagem de eletroforese com base capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detectando os teores de proteína de EGFR, c-Met e pEGFR em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e por 48 horas na presença ou ausência de PBMCs, monócitos isolados, células NK isoladas, macrófagos M1 di- ferenciados com MCSF ou macrófagos M1 diferenciados com GMCSF do mesmo doador conforme indicado na figura. A Figura 21 mostra a quantidade relativa de EGFR em células NCI-H1975 tratadas com JNJ- 372, JNJ-372.IgG2sigma ou controle de isótipo por 48 horas na pre- sença ou ausência de PBMCs, células NK, monócitos, macrófagos MCSF M1 ou macrófagos GMCSF M1 isolados do mesmo doador, con- forme indicado na figura. A Figura 22 mostra a quantidade relativa de pEGFR (pY1173) em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372, JNJ-
372.IgG2sigma ou controle de isótipo por 48 horas na presença ou au- sência de PBMCs, células NK, monócitos, macrófagos MCSF M1 ou macrófagos GMCSF M1 isolados do mesmo doador, conforme indi- cado na figura. A Figura 23 mostra a quantidade relativa de c-Met em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou con- trole de isótipo durante 48 horas na presença ou ausência de PBMCs, células NK, monócitos, macrófagos MCSF M1 ou macrófagos GMCSF M1 isolados do mesmo doador, conforme indicado na figura. As amos- tras foram normalizadas para a quantidade da actina de controle de carregamento presente em cada amostra e, então, para a amostra de controle (sem tratamento).
[0223] O efeito dos diferentes subtipos de macrófagos na interação de Fc de JNJ-372 direcionada à regulação negativa de EGFR/c-Met foi subsequentemente avaliado. Os monócitos derivados de um doador foram diferenciados em macrófagos M1, M2a e M2c e sua capacidade de potencializar a modulação negativa por EGFR/c-Met mediada por JNJ-372 foi avaliada. As células H1975 foram tratadas com 10 µg/ml de isótipo, JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma e cultivadas na presença ou ausência de macrófagos M1, M2a ou M2c obtidos por diferenciação de monócitos de um doador na razão entre E:T de 5:1 durante 48 ho- ras. A presença de todos dentre M1, M2a e M2c acentuou significati- vamente a regulação negativa mediada por JNJ-372 de proteínas de EGFR, pEGFR e c-Met. A Figura 24 mostra a imagem de eletroforese com base capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detec- tando os teores de proteína de EGFR, c-Met e pEGFR em células NCI- H1975 tratadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou controle de isó- tipo e cultivadas na presença de macrófagos M1 (M1) ou macrófagos M2a (M2a) conforme indicado na figura. A Figura 25 mostra a imagem de eletroforese com base capilar (Simple Western com o uso de Pe- ggySue) detectando os teores de EGFR, c-Met e pEGFR em células NCI-H1975 tratadas com JNJ-372, JNJ-372.IgG2sigma ou controle de isótipo e cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de ma- crófagos M2c (M2c) conforme indicado na figura. Exemplo 4. A regulação negativa mediada por JNJ-372 de proteína de EGFR e c-Met e sua sinalização a jusante é mediada por interações de Fc em linhagens de células de tumor amplificadas por c-Met
[0224] As células SNU-5 (linhagem de células amplificada por c-Met) foram tratadas com 10 µg/ml de JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs de um doador a uma razão entre E:T de 10:1 durante 48 horas. A adição de PBMCs potencializou a capacidade de JNJ-372 para modular negativamente EGFR, pEGFR, c-Met e p-Met. A Figura 26 mostra a imagem de eletroforese com base capilar (Simple Western com o uso de PeggySue) detectando os teores de proteína de
EGFR, c-Met e pEGFR em células SNU-5 tratadas com JNJ-372 ou con- trole de isótipo e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura. A Figura 27 mostra a quantidade relativa de EGFR em células SNU-5 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura. A Figura 28 mostra a quantidade relativa de pEGFR (pY1173) em células SNU-5 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura. A Figura 29 mostra a quantidade relativa de c-Met em amostras de cultura de células SNU-5 cultivadas durante 48 horas na presença ou ausência de JNJ-372, controle de isótipo ou PBMCs conforme indicado na figura. A Figura 30 mostra a quantidade relativa de pMet (pY1234/1235) em células SNU-5 tratadas com JNJ-372 ou controle de isótipo e cultivadas na presença ou ausência de PBMCs conforme indicado na figura. As amostras foram normalizadas para a quantidade da actina de controle de carregamento presente em cada amostra e, então, para a amostra de controle (sem tratamento). Exemplo 5. Interação de Fc de JNJ-372 com inibição in vivo do cresci- mento tumoral mediado por FcγR
[0225] A função e a relevância das interações de Fc/FcγR foram, en- tão, avaliadas in vivo com o uso de modelos de xenoenxerto de linhagem de células H1975 e SNU5.
[0226] A linhagem de células NCI-H1975 foi implantada subcutanea- mente em camundongos BALB/c nude fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl, Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EUA). Quando os tumores estavam em média com 72 ± 8,7 mm3, o anti- corpo anti-mCSF-1R intraperitoneal (400 µg/camundongo) foi adminis- trado três vezes por semana durante a duração do estudo, começando cinco dias antes do início da dosagem do composto para facilitar a deple- ção dos macrófagos. No dia 5, quando os tumores estavam em média com 102 ± 36,6 mm3, eles foram tratados duas vezes por semana por dosagem intraperitoneal com anticorpo de controle de isótipo (10 mg/kg), JNJ-372 (10 mg/kg), ou JNJ-372.IgG2sigma (10 mg/kg). Os tumores foram amos- trados de uma coorte de camundongos para monitorar a infiltração de ma- crófagos após duas doses de composto. A linhagem de células SNU5 foi implantada por via subcutânea em camundongos CB17/SCID fêmeas com 7 a 8 semanas de idade (HFK Bio-Technology Co. Ltd., Peijing, China). Quando os tumores estavam em média com 155 ± 21,4 mm3, os camun- dongos foram tratados duas vezes por semana com solução salina tam- ponada com fosfato intraperitoneal (PBS), JNJ-372 (5 mg/kg), ou JNJ-
372.IgG2sigma (5 mg/kg), durante três semanas. Para ambos os estudos, as medições do tumor e os pesos corporais foram registrados duas vezes por semana durante a duração de cada estudo. A inibição do crescimento tumoral (TGI - "tumor growth inhibition") foi calculada no dia final onde >80% de camundongos de controle permaneceram no estudo, com o uso do cálculo [1-(T/C)]*100. Todos os experimentos in vivo foram reali- zados de acordo com o Johnson and Johnson Institutional Animal Care and Use Committee (Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais Johnson e Johnson) e o Guide for Care and Use of Laboratory Animals (Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório).
[0227] No modelo H1975, o tratamento com JNJ-372 resultou em inibição do crescimento tumoral (TGI) de 75% em comparação com o controle de isótipo (Figura 31). Entretanto, JNJ-372.IgG2sigma foi con- sideravelmente menos eficaz, com uma TGI de apenas 30% (Figura 31). De modo similar, o tratamento com JNJ-372 foi altamente eficaz na redução do crescimento tumoral no modelo de SNU5 amplificado com MET com uma TGI de 96%, enquanto o tratamento com JNJ-
372.IgG2sigma foi ineficaz (TGI de -17%) (Figura 32). Nenhum efeito sobre o peso corporal do camundongo foi observado com tratamentos com anticorpos em qualquer um desses modelos tumorais (Figura 32). Exemplo 6. ADCC, mas não CDC, mediada por células NK induziu a interação de Fc
[0228] A capacidade de JNJ-372 induzir diferentes funções efetoras de Fc foi examinada. A ADCC induzida por JNJ-372 foi medida com o uso de um ensaio de liberação de európio na presença de PBMCs de sete doadores diferentes. A lise de células H1975 mediada por anticorpo foi variável entre doadores, com alguns doadores exibindo ~60 a 70% de atividade de ADCC, enquanto outros não apresentaram atividade de ADCC mensurável (dados não mostrados). Para avaliar a contribuição do engate Fc/FcγR, as células H1975 foram tratadas com controle de isótipo, JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma na presença de PBMCs de 2 doadores. Embora JNJ-372 tenha induzido ADCC dose-dependente, nenhum extermínio de células foi observado com controle de isótipo ou tratamento com JNJ-372.IgG2sigma (dados não mostrados). Para de- terminar o subtipo de célula imune dentro das PBMCs responsáveis por ADCC induzida por JNJ-372, a lise de ADCC induzida na presença de PBMCs versus células NK isoladas ou monócitos isolados do mesmo doador foi avaliada. Tanto as PBMCs quanto as células NK, mas não os monócitos isolados, induziram lise de ADCC dependente de JNJ-372 (Figura 33), indicando que as células NK são responsáveis pelas ativi- dades de ADCC induzida por JNJ-372. Nenhuma atividade de CDC mensurável foi observada com JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma em re- lação às linhagens de células de NSCLC H1975 e H292 (dados não mostrados), sugerindo que JNJ-372 não induz CDC contra essas linha- gens de células de NSCLC. Exemplo 7. Efeito de macrófagos sobre o extermínio de células tumo- rais mediadas por JNJ-372 in vivo
[0229] Para examinar o papel de macrófagos in vivo, macrófagos associados a tumor foram depletados em camundongos portadores de tumores de xenoenxerto H1975 com o uso do anticorpo anti-CSF1R e a eficácia de JNJ-372 foi medida. O tratamento com anticorpo anti-CSF1R mostrou redução significativa em TAMs em comparação com o não tra- tado (**, p<0,002), com macrófagos depletados de 11 a 15% a ~2% (Fi- gura 34). Os animais foram então tratados com controle de isótipo, JNJ- 372, ou JNJ-372.IgG2sigma durante 3 semanas, sem nenhuma perda de peso corporal de camundongo observada em nenhum grupo (dados não mostrados). Conforme mostrado anteriormente, o tratamento com JNJ-372 mostrou eficácia antitumoral significativamente maior em com- paração com o controle de isótipo (***, p<0,0001) ou o tratamento com JNJ-372.IgG2sigma (**, p=0,004) em tumores não tratados com anti- corpo CSF1R (Figura 35). Surpreendentemente, a depleção de macró- fagos associados ao tumor (tratados com anti-CS1R) reduziu significa- tivamente a TGI de 72,8% para 38,5% (****, p<0,0001) (Figura 35), su- gerindo que os macrófagos desempenham um papel importante na me- diação da eficácia antitumoral de JNJ-372 in vivo.
[0230] Estes resultados demonstraram que os macrófagos são es- senciais para a eficácia antitumoral in vivo. Exemplo 8. A interação de Fc de JNJ-372 com células imunes induz a liberação de citocina e quimiocina dependente de anticorpo (ADCR)
[0231] A interação da região de Fc de anticorpos terapêuticos com FcγR em células imunes é conhecida por induzir a secreção de quimi- ocinas e citocinas (ADCR) (Kinder et al., mAbs 7:494-504, 2015). Um painel de citocina 71-plex MSD foi utilizado para avaliar quimiocinas e citocinas secretadas mediante o tratamento com controle de isótipo, JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma na presença ou ausência de PBMCs durante 4 ou 72 horas. Diferenças distintas foram observadas de várias citocinas secretadas de uma maneira dependente do ponto de tempo e do tratamento; Trinta e duas (32) das 71 citocinas e 42 das 71 citoci- nas testadas apresentaram uma resposta confiavelmente mensurável (AUC) em 4 e 72 horas respectivamente. A análise adicional focando em citocinas com >1,5 vezes de diferença entre os tratamentos mos- trou que em 4 h (Figura 36) e 72 h (Figura 37) após o tratamento, treze e sete citocinas, respectivamente, foram reguladas positivamente me- diante o tratamento com JNJ-372 em comparação com o controle de isótipo ou JNJ-372.IgG2sigma na cultura concomitante de H1975 + PBMCs. Muitas das citocinas alteradas pertencem à família de citoci- nas quimiotáticas (quimiocinas CC) (Figura 6B – MIP1β, MCP-1, MCP- 3, Eotaxina, Eotaxina-2), que são conhecidas por funcionarem como quimiotáticos para células imunes inatas, monócitos e macrófagos (Graves et al., Crit Rev Oral Biol Med 6:109-18, 1995; Uguccioni et al., Eur J Immunol 25:64-8, 1995; Balkwill, Nat Rev Cancer 4: 540-50, 2004).
[0232] Para avaliar adicionalmente essas citocinas e examinar a fun- ção das células imunes individuais em sua secreção, 23 citocinas foram selecionadas (com base em sua função ou alteração mediante tratamento com JNJ-372) e avaliadas mediante tratamento com isótipo, anticorpos JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma na presença de PBMCs versus células imunes individuais isoladas do mesmo doador. A análise de mapa de calor revelou alterações distintas nos padrões de expressão de citocina com as células imunes individuais, com as quimiocinas CC sendo a família de re- gulação positiva mais frequente mediante o tratamento com JNJ-372 em todas as células imunes. Uma análise mais focalizada nas citocinas com diferença >1,5 vezes na presença de PBMCs, revelou um padrão de regu- lação positiva mediante tratamento com JNJ-372 que foi específico para PBMCs, monócitos e macrófagos, mas não para células NK. Por exemplo, o tratamento com JNJ-372 resultou em um aumento dose-dependente nos teores de MCP-1 (Figura 38) e MCP-3 (Figura 39) na presença de PBMCs ou monócitos, mas não com isótipo ou JNJ-372.IgG2sigma ou na pre- sença de células NK. IL1-RA, que é conhecido por ser secretado por mo- nócitos e macrófagos em resposta a estímulos de ativação (Janson et al.,
J Immunol 147:4218-23, 1991; Arend et al., Ann Rheum Dis 59 Suppl 1:i60- 4, 2000) aumentou de forma dose-dependente mediante o tratamento com JNJ-372 na presença de PBMCs e monócitos, mas não de células NK (Fi- gura 40). Adicionalmente, um aumento dose-dependente nos teores de MIP1β foi observado mediante tratamento com JNJ-372, mas não medi- ante controle de isótipo ou JNJ-372.IgG2sigma na presença de células imunes (Figura 41). Ambas as proteínas da família de MIP, MIP1 e MIP1β, também foram reguladas positivamente mediante tratamento com JNJ-372 em cultura concomitante com macrófagos M1 e M2, com uma variação de expressão de magnitude maior de MIP1β vista com os macró- fagos M2c. A Figura 42 mostra a curva de resposta à dosagem dos teores de MIP-1β em células H1975 cultivadas na presença de macrófagos M1. A Figura 43 mostra a curva de resposta à dosagem dos teores de MIP-1β em células H1975 cultivadas na presença de macrófagos M2. A Figura 44 mostra a curva de resposta à dosagem dos teores de MIP-1 em células H1975 cultivadas na presença de macrófagos M1. A Figura 45 mostra a curva de resposta à dosagem dos teores de MIP-1 em células H1975 cultivadas na presença de macrófagos M2.
[0233] Para avaliar o efeito das quimiocinas secretadas sobre a re- gulação negativa de EGFR/cMet, o meio condicionado de células H1975 tratadas com controle de isótipo, JNJ-372, ou JNJ-
372.IgG2sigma na presença ou ausência de PBMCs durante 4 ou 72 horas foi transferido para células H1975 não tratadas, e as alterações na via de EGFR e cMet foram avaliadas. Nenhuma regulação negativa mensurável dos teores de proteína de EGFR, pEGFR e cMet foi obser- vada na presença de meios condicionados em qualquer ponto no tempo (dados não mostrados). Isto sugere que as citocinas e quimio- cinas secretadas não foram suficientes para induzir modulação nega- tiva acentuada de EGFR/cMet, uma vez que isso exige contato direto mediado por anticorpo entre as células tumorais e as células imunes.
Exemplo 9. A interação de Fc de JNJ-372 com monócitos e macrófagos induz a trogocitose (ADCT)
[0234] Outra função efetora de Fc importante, a trogocitose (ADCT), foi avaliada com o uso de um ensaio baseado em citometria de fluxo me- dindo a transferência do anticorpo marcado ligado em células-alvo para células efetoras (macrófagos). As células H1975 NucLight Red foram op- sonizadas com isótipo marcado com AF488, JNJ-372 ou JNJ-
372.IgG2sigma, cocultivadas com macrófagos M1 ou M2c e a porcenta- gem de macrófagos AF488+ foi avaliada. JNJ-372 marcado foi transferido de forma dose-dependente tanto para macrófagos M1 (Figura 46) quanto para macrófagos M2c (Figura 47), enquanto nem o controle de isótipo nem o anticorpo marcado com JNJ-372.IgG2sigma foram detectados em macrófagos CD11b+ (dados não mostrados). Nenhum NucLight Red+macrófago apreciável foi detectado indicando uma ausência de fa- gocitose. Isto sugere que a trogocitose é o mecanismo predominante neste ensaio.
[0235] Para confirmar visualmente a trogocitose de macrófagos in- duzida por JNJ-372, a microscopia de lapso de tempo foi realizada, onde os macrófagos foram visualizados com um coquetel de anticorpos CD11b/CD14 e coloração Hoechst para núcleos e as células-alvo H1975 foram identificadas por seus núcleos NucLight Red+. As células-alvo H1975 foram opsonizadas com isótipo marcado com AF647, anticorpos JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma, cocultivadas com macrófagos M1 ou M2c e as imagens confocais de alto teor foram obtidas. Após a cultura concomitante com células-alvo opsonizadas com JNJ-372 marcado, uma acumulação distinta de AF647+ puncta (JNJ-372) foi observada nos ma- crófagos M1 e M2, enquanto nenhuma acumulação foi observada com o isótipo marcado ou tratamento com JNJ-372.IgG2sigma. Como no ensaio anterior, fagocitose mínima foi observada nestes ensaios, indicando que o mecanismo predominante de modulação negativa do receptor por JNJ-
372 é a trogocitose. A Figura 48 mostra imagens representativas de mi- croscopia confocal de alto teor em 11 minutos a 44 minutos da cultura. A Figura 49 mostra imagens representativas de microscopia confocal de alto teor em 77 minutos e em 110 minutos da cultura.
[0236] A capacidade dos monócitos de realizar a trogocitose foi in- vestigada em seguida. Similar aos macrófagos, os monócitos coculti- vados com células-alvo opsonizadas com JNJ-372 (marcadas com AF647) demonstraram transferência específica do anticorpo JNJ-372 marcado para os monócitos (dados não mostrados). Por fim, para si- mular as interações do anticorpo dentro do microambiente tumoral, uma cultura concomitante de macrófagos M1 ou M2c e células-alvo H1975 com isótipo marcado com AF647 foram tratadas com anticorpos JNJ-372 ou JNJ-372.IgG2sigma. Sob essas condições, o controle de isótipo se ligou apenas aos macrófagos M1 e M2c, JNJ-372.IgG2sigma apenas às células-alvo, enquanto que JNJ-372 se ligou tanto às célu- las-alvo quanto aos macrófagos (dados não mostrados), confirmando assim a especificidade de ligação de cada anticorpo. A trogocitose me- diada por JNJ-372 também foi prontamente observada nas condições de cultura concomitante, medidas por uma transferência distinta do an- ticorpo JNJ-372 marcado para macrófagos, mas não do isótipo ou an- ticorpos JNJ-372.IgG2sigma.
[0237] Tomadas em conjunto, estas descobertas demonstram que JNJ-372 induz a trogocitose através de suas interações com receptores de Fcγ em macrófagos e monócitos. Discussão
[0238] Os experimentos aqui descritos demonstraram que o anti- corpo biespecífico para EGFR/cMet, JNJ-372, tinha múltiplos mecanis- mos dependentes de Fc que contribuíram para sua eficácia antitumo- ral. Além de induzir ADCC mediada por células NK, a interação de JNJ-
372 com receptores de Fcγ nas células imunes também mediou a mo- dulação negativa do receptor EGFR e cMet de tirosina quinases e suas formas fosforiladas através da trogocitose. Esta nova função de Fc foi facilitada por monócitos e macrófagos, que também são necessários para a eficácia antitumoral in vivo.
[0239] Foi demonstrado que as interações de Fc de JNJ-372 com cé- lulas imunes foram necessárias para os efeitos antiproliferativos e apoptó- ticos in vitro e para a eficácia antitumoral in vivo. Dado que o efeito anti- proliferativo máximo foi observado em 48 horas ou mais tarde e a ADCC ocorre cedo (~2 a 4 horas (29)) in vitro, postulou-se que a contribuição da ADCC para o extermínio de células tumorais total pode ser mínima. Em- bora a atividade de CDC não tenha sido observada nas linhagens de cé- lulas avaliadas, sabe-se que as linhagens de células de NSCLC expres- sam proteínas inibidoras de complemento, CD46, CD55 e CD59 (Varsano et al., Clin Exp Immunol 113: 173-82, 1998). Isto sugeriu que embora JNJ- 372 não tenha induzido CDC nas células testadas, o anticorpo biespecífico pode ser capaz de induzir a atividade de CDC em outras linhagens de cé- lulas ou tipos de tumor. Finalmente, embora tenha sido relatado anterior- mente que JNJ-372 induziu ADCP in vitro (Moores et al., Cancer Res 76: 3942-53, 2016), sob as condições usadas para os ensaios de trogocitose com base em microscópio confocal neste estudo, foi observada de mínima a nenhuma ADCP. Esses resultados sugeriram que JNJ-372 funciona através de múltiplos mecanismos de ação e que a contribuição de cada uma dessas funções efetoras de Fc pode variar entre os pacientes.
[0240] Também foi demonstrado que JNJ-372 induziu a ADCR e a exploração das funções das citocinas reguladas positivamente por JNJ- 372 revelou que a maioria pertence à família de citocinas quimiotáticas chamadas quimiocinas, especificamente, quimiocinas CC (Graves et al., Crit Rev Oral Biol 6: 109-18, 1995; Balkwill, Nat Rev Cancer 4: 540-50,
2004). As quimiocinas CC são compreendidas de duas subfamílias prin- cipais, proteína quimiotática para monócitos (MCP - "monocyte chemo- attract protein") e proteína inflamatória para macrófagos (MIP - "ma- crophage inflammatory protein"), que são conhecidas por funcionarem como quimiotáticos para células imunes inatas, como monócitos e ma- crófagos (Uguccioni et al., Eur J Immunol 25: 64-8, 1995; Loetscher et al., FASEB J 8: 1055-60, 1994). Os membros da família de MCP, o MCP-1 (CCL2) e o MCP-3 (CCL7), mostraram aumentar o recrutamento de monócitos inflamatórios e linfócitos T CD8+ (Uguccioni et al., Eur J Immunol 25: 64-8, 1995; Loetscher et al., FASEB J 8: 1055-60, 1994; Jia et al., J Immunol 180: 6846-53, 2008). Foi relatado também que MCP-1 e MIP1β (CCL4) induzem o recrutamento de monócitos e ma- crófagos no microambiente tumoral (TME - "tumor microenvironment") de NSCLC (Uguccioni et al., Eur J Immunol 25: 64-8, 1995; Arenberg et al., Cancer Immunol Immunother 49: 63-70, 2000).
[0241] Embora essas citocinas possam atrair células imunes no TME e ativá-las, a necessidade de contato celular mediado por anti- corpo e a indução de trogocitose sugeriu que o mecanismo pelo qual a interação de Fc de JNJ-372 mediou a modulação negativa da sinali- zação de EGFR e cMet foi através da trogocitose mediada por monó- citos ou macrófagos. Vários relatórios recentes mostraram que uma transferência similar de receptores de Her2 para células imunes como macrófagos e neutrófilos por trogocitose levam ao extermínio de célu- las tumorais opsonizadas por anticorpo terapêutico (Velmurugan et al., Mol Cancer Ther 15: 1879-89, 2016; Matlung et al., Cell Rep 23: 3946- 59, 2018). Isso sugeriu que, embora acredite-se que a trogocitose an- teriormente seja um mecanismo de resistência para anticorpos como rituximabe, ela também pode servir como uma função efetora de Fc para mediar os efeitos antitumorais (Taylor e Lindofer, Blood 125: 762- 6, 2015; Pham et al., PLoS One 6:e14498, 2011).
[0242] Concluindo, foi demonstrado que JNJ-372 exibe múltiplos mecanismos distintos de ações com várias funções dependentes de Fc e independentes de Fc que contribuem para sua atividade antitumoral.
Modelos in vitro e in vivo demonstraram que a interação de JNJ-372 com FcγRs em monócitos e macrófagos foi necessária para a eficácia antitumoral e modulação negativa de EGFR/Met, sugerindo que os te- ores dessas células imunes podem ser preditivos da eficácia de JNJ- 372 em ambientes clínicos.

Claims (70)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar um indivíduo que tem câncer que ex- pressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met, caracterizado por compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo bi- específico isolado do receptor do fator de crescimento anti-epidérmico (EGFR)/receptor do fator de crescimento de hepatócito (c-Met) ao indiví- duo em combinação com um agente que acentua a atividade de macró- fago no indivíduo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met compreender a) um primeiro domínio que se liga ao EGFR, sendo que o primeiro domínio compreende uma região determinante de comple- mentaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1) da SEQ ID NO: 1, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR3 da SEQ ID NO: 3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) da SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 da SEQ ID NO: 6; e b) um segundo domínio que se liga a c-Met, sendo que o segundo domínio compreende a HCDR1 da SEQ ID NO: 7, a HCDR2 da SEQ ID NO: 8, a HCDR3 da SEQ ID NO: 9, a LCDR1 da SEQ ID NO: 10, a LCDR2 da SEQ ID NO: 11, e a LCDR3 da SEQ ID NO: 12.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a) o primeiro domínio que se liga ao EGFR compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 14; e b) o segundo domínio que se liga a c-Met compreende a VH da SEQ ID NO: 15 e a VL da SEQ ID NO: 16.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ser um isótipo de IgG1.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met compre- ender uma primeira cadeia pesada (HC1) da SEQ ID NO: 17, uma primeira cadeia leve (LC1) da SEQ ID NO: 18, uma segunda cadeia pesada (HC2) da SEQ ID NO: 19, e uma segunda cadeia leve (LC2) da SEQ ID NO: 20.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o agente que acentua a atividade de macrófagos ser GM-CSF, um anticorpo anti-CD47, um inibidor de HDAC2, um inibidor do eixo PD-(L)1 ou um agonista de CD11b.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o câncer que expressa EGFR ou c-Met estar associado a um EGFR do tipo selvagem, uma mutação de ativação de EGFR, uma amplificação gênica de EGFR, teores aumentados de HGF circulante, um c-Met do tipo selvagem, uma mutação de ativação de c- Met, uma amplificação gênica de c-Met ou um KRAS mutante.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a mutação de ativação de EGFR compreender a substituição L718Q, G719A, G719X (X sendo qualquer aminoácido), L861X (X sendo qualquer aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, C797S, L858P ou T790M, deleção de E746 a A750, deleção de R748 a P753, inserção de Ala (A) entre M766 e A767, inserção de Ser, Val e Ala (SVA) entre S768 e V769, inserção de Asn e Ser (NS) entre P772 e H773, inserção de um ou mais aminoácidos entre D761 e E762, A763 e Y764, Y764 e Y765, M766 e A767, A767 e V768, S768 e V769, V769 e D770, D770 e N771, N771 e P772, P772 e H773, H773 e V774, V774 e C775, uma ou mais deleções no éxon 20 de EGFR, ou uma ou mais inserções no éxon 20 de EGFR, ou qualquer combinação dos mes- mos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o KRAS mutante compreender uma substituição G12V, G12C, G12A ou G12D, ou qualquer combinação das mesmas.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o indivíduo ter um câncer que expressa EGFR, c- Met ou EGFR e c-Met recém-diagnosticado.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o indivíduo ser resistente ou ter adquirido resistência ao tratamento com uma terapia anticâncer anterior.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteri- zado por a terapia anticâncer anterior ser quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada ou um inibidor de quinase.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado por o inibidor de quinase ser um inibidor de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HER4, VEGFR ou AXL.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o inibidor de quinase ser erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, vandetanibe, afatinibe, osimertinibe, lazertinibe, poziotinibe, criotinibe, cabozantinibe, capmatinibe, axitinibe, lenvatinibe, nintedanibe, regorafenibe, pazopanibe, sorafenibe ou sunitinibe.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado por o câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met ser um câncer de células epiteliais, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma pulmonar, câncer de pulmão de células pequenas, câncer colorretal, câncer anal, câncer de próstata, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de faringe, câncer de nariz, câncer pancreático, câncer de pele, câncer oral, câncer de língua, câncer esofágico, câncer vaginal, câncer cervi- cal, câncer do baço, câncer testicular, câncer gástrico, câncer do timo,
câncer de cólon, câncer de tireoide, câncer de fígado, carcinoma he- patocelular (HCC) ou carcinoma de células renais papilares esporádico ou hereditário (PRCC).
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender adicionalmente administrar uma ou mais terapias anticâncer ao indivíduo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a uma ou mais terapias anticâncer compreender quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada ou um inibidor de quinase.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado por o inibidor de quinase ser um inibidor de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HER4, VEGFR ou AXL.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o inibidor de quinase ser erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, vandetanibe, afatinibe, osimertinibe, lazertinibe, poziotinibe, criotinibe, cabozantinibe, capmatinibe, axitinibe, lenvatinibe, nintedanibe, regorafenibe, pazopanibe, sorafenibe ou sunitinibe.
20. Método para diagnosticar e tratar um indivíduo que tem câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met que é responsivo ao tratamento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, caracterizado por compreender: a) fornecer uma amostra biológica proveniente do indivíduo, b) medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; c) diagnosticar o indivíduo que tem o câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met que é responsivo ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met quando os teores de macrófa- gos ou de monócitos da amostra biológica são mais altos que um valor- limite; e d) administrar ou fornecer a administração do anticorpo bies- pecífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo diagnosticado como responsivo ao tratamento com o anticorpo anti-EGFR/c-Met.
21. Método para tratar um indivíduo suspeito de ter ou que tem câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, caracterizado por compreende: a) determinar que o indivíduo tem teores de macrófagos ou mo- nócitos maiores que um valor-limite; e b) administrar ou fornecer a administração do anticorpo bies- pecífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo determinado como tendo teores de macrófagos ou monócitos maiores que o valor-limite.
22. Método para prevenir a resposta de um indivíduo que tem câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met para o trata- mento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, caracterizado por compreender: a) fornecer uma amostra biológica proveniente do indivíduo, b) medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; c) prever o indivíduo como um respondedor quando os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica são mais altos que um valor-limite.
23. Método para tratar um indivíduo que tem câncer que ex- pressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met que é responsivo ao tratamento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met, caracterizado por compreender: a) fornecer uma amostra biológica proveniente do indivíduo, b) medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; c) tratar o indivíduo com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-
Met quando os teores de macrófagos ou de monócitos da amostra bioló- gica são mais altos que um valor-limite.
24. Método para determinar se um indivíduo que tem um cân- cer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met é responsivo ao trata- mento com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met e decidir se deve tratar o indivíduo, caracterizado por compreender: a) fornecer uma amostra biológica proveniente do indivíduo, b) medir os teores de macrófagos ou monócitos da amostra biológica; c) diagnosticar o indivíduo com câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met em resposta ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou de monócitos da amostra biológica são mais altos que um valor-limite ou diagnosticar o indivíduo com câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met como não responsivo ao tratamento com o anticorpo bi- específico anti-EGFR/c-Met quando os teores de macrófagos ou monó- citos da amostra biológica estão abaixo do valor-limite; e d) administrar o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo diagnosticado como responsivo ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ou abster-se de administrar o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ao indivíduo diagnosticado como não res- ponsivo ao tratamento com o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met com- preender: a) um primeiro domínio que se liga ao EGFR, sendo que o primeiro domínio compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 1, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR3 da SEQ ID NO: 3, uma LCDR1 da SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 da SEQ ID NO: 6; e b) um segundo domínio que se liga a c-Met, sendo que o segundo domínio compreende a HCDR1 da SEQ ID NO: 7, a HCDR2 da SEQ ID NO: 8, a HCDR3 da SEQ ID NO: 9, a LCDR1 da SEQ ID NO: 10, a LCDR2 da SEQ ID NO: 11, e a LCDR3 da SEQ ID NO: 12.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a) o primeiro domínio que se liga ao EGFR compreende uma VH da SEQ ID NO: 13 e uma VL da SEQ ID NO: 14; e b) o segundo domínio que se liga a c-Met compreende a VH da SEQ ID NO: 15 e a VL da SEQ ID NO: 16.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ser um isótipo de IgG1.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met compreender uma HC1 da SEQ ID NO: 17, uma LC1 da SEQ ID NO: 18, uma HC2 da SEQ ID NO: 19 e uma LC2 da SEQ ID NO: 20.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 20 a 28, caracterizado por o valor-limite ser o 30° valor de per- centil ou acima de macrófagos ou monócitos observados na amostra biológica de uma população de indivíduos que têm o câncer positivo para EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 29, caracterizado por a amostra biológica ser uma amostra de san- gue.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 29, caracterizado por a amostra biológica ser uma biópsia de tecido tumoral.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 31, caracterizado por o câncer que expressa EGFR, c-Met ou
EGFR e c-Met estar associado com um EGFR do tipo selvagem, uma mutação de ativação de EGFR, uma amplificação gênica de EGFR, te- ores aumentados de HGF circulante, um c-Met do tipo selvagem, uma mutação de ativação de c-Met, uma amplificação gênica de c-Met ou um KRAS mutante, ou qualquer combinação dos mesmos.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a mutação de ativação de EGFR compreender a substituição L718Q, G719A, G719X (X sendo qualquer aminoácido), L861X (X sendo qualquer aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, C797S, L858P ou T790M, deleção de E746 a A750, deleção de R748 a P753, inserção de Ala (A) entre M766 e A767, inserção de Ser, Val e Ala (SVA) entre S768 e V769, inserção de Asn e Ser (NS) entre P772 e H773, inserção de um ou mais aminoácidos entre D761 e E762, A763 e Y764, Y764 e Y765, M766 e A767, A767 e V768, S768 e V769, V769 e D770, D770 e N771, N771 e P772, P772 e H773, H773 e V774, V774 e C775, uma ou mais deleções no éxon 20 de EGFR, ou uma ou mais inserções no éxon 20 de EGFR, ou qualquer combinação dos mes- mos.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteri- zado por o KRAS mutante compreender uma substituição G12V, G12C ou G12A.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 34, caracterizado por o indivíduo ser suspeito de ter ou ter um câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met recém diagnosticado.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 20 a 34, caracterizado por o indivíduo ser resistente ou ter adqui- rido resistência ao tratamento com uma terapia anticâncer anterior.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteri- zado por a terapia anticâncer anterior ser quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada ou um inibidor de quinase.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteri- zado por o inibidor de quinase ser um inibidor de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HER4, VEGFR ou AXL.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o inibidor de quinase ser erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, vandetanibe, afatinibe, osimertinibe, lazertinibe, poziotinibe, criotinibe, cabozantinibe, capmatinibe, axitinibe, lenvatinibe, nintedanibe, regorafenibe, pazopanibe, sorafenibe ou sunitinibe.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 20 a 39, caracterizado por o câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met ser um câncer de células epiteliais, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma pulmonar, câncer de pulmão de células pequenas, câncer colorretal, câncer anal, câncer de próstata, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de faringe, câncer de nariz, câncer pancreático, câncer de pele, câncer oral, câncer de língua, câncer esofágico, câncer vaginal, câncer cervi- cal, câncer do baço, câncer testicular, câncer gástrico, câncer do timo, câncer de cólon, câncer de tireoide, câncer de fígado, carcinoma he- patocelular (HCC) ou carcinoma de células renais papilares esporádico ou hereditário (PRCC).
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 40, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ser administrado em combinação com um agente que acentua a atividade de macrófagos no indivíduo.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteri- zado por o agente que acentua a atividade de macrófagos no indivíduo ser GM-CSF, um antagonista de CD47, um anticorpo anti-CD47, um inibidor de HDAC2, um inibidor do eixo PD-(L)1 ou um agonista de CD11b.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 42, caracterizado por compreender adicionalmente administrar uma ou mais terapias anticâncer ao indivíduo.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado por a uma ou mais terapias anticâncer compreender quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada ou um inibidor de quinase.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por o inibidor de quinase ser um inibidor de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HER4, VEGFR ou AXL.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por o inibidor de quinase ser erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, vandetanibe, afatinibe, osimertinibe, lazertinibe, poziotinibe, criotinibe, cabozantinibe, capmatinibe, axitinibe, lenvatinibe, nintedanibe, regorafenibe, pazopanibe, sorafenibe ou sunitinibe.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ter um teor de fucose de cerca de 15% ou menos.
48. Método de indução de trogocitose de EGFR ou c-Met, ou de EGFR e de c-Met a partir de uma célula doadora para uma célula receptora, caracterizado por compreender colocar a célula doadora em contato com um anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met durante um tempo suficiente para induzir trogocitose da célula doadora para a célula receptora.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por a célula doadora ser uma célula de câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met.
50. Método, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, carac- terizado por a célula receptora ser um macrófago ou um monócito.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
48 a 50, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met com- preender: a) um primeiro domínio que se liga ao EGFR, sendo que o primeiro domínio compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 1, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 2, uma HCDR3 da SEQ ID NO: 3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1) da SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 da SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 da SEQ ID NO: 6; e b) um segundo domínio que se liga a c-Met, sendo que o se- gundo domínio compreende a HCDR1 da SEQ ID NO: 7, a HCDR2 da SEQ ID NO: 8, a HCDR3 da SEQ ID NO: 9, a LCDR1 da SEQ ID NO: 10, a LCDR2 da SEQ ID NO: 11, e a LCDR3 da SEQ ID NO: 12.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por: a) o primeiro domínio que se liga ao EGFR compreende uma VH da SEQ ID NO: 13 e uma VL da SEQ ID NO: 14; e b) o segundo domínio que se liga a c-Met compreende a VH da SEQ ID NO: 15 e a VL da SEQ ID NO: 16.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met ser um isótipo de IgG1.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 53, caracterizado por o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met compreender uma HC1 da SEQ ID NO: 17, uma LC1 da SEQ ID NO: 18, uma HC2 da SEQ ID NO: 19 e uma LC2 da SEQ ID NO: 20.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 49 a 54, caracterizado por a célula de câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met estar associada a um EGFR do tipo selvagem, uma mutação de ativação de EGFR, uma amplificação gê- nica de EGFR, teores aumentados de HGF circulante, um c-Met do tipo selvagem, uma mutação de ativação de c-Met, uma amplificação gê- nica de c-Met ou um KRAS mutante.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por a mutação de ativação de EGFR compreender a substituição L718Q, G719A, G719X (X sendo qualquer aminoácido), L861X (X sendo qualquer aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, C797S, L858P ou T790M, deleção de E746 a A750, deleção de R748 a P753, inserção de Ala (A) entre M766 e A767, inserção de Ser, Val e Ala (SVA) entre S768 e V769, inserção de Asn e Ser (NS) entre P772 e H773, inserção de um ou mais aminoácidos entre D761 e E762, A763 e Y764, Y764 e Y765, M766 e A767, A767 e V768, S768 e V769, V769 e D770, D770 e N771, N771 e P772, P772 e H773, H773 e V774, V774 e C775, uma ou mais deleções no éxon 20 de EGFR, ou uma ou mais inserções no éxon 20 de EGFR, ou qualquer combinação dos mes- mos.
57. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracteri- zado por o KRAS mutante compreender uma substituição G12V, G12C ou G12A.
58. Método, de acordo qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado por a etapa de contato ser feita in vitro.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado por a etapa de contato compreender administrar o anticorpo biespecífico anti-EGFR/c-Met a um indivíduo.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por o indivíduo ter um câncer que expressa EGFR, c-Met, ou EGFR e c- Met.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, carac- terizado por o indivíduo ter um câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met recém-diagnosticado.
62. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou 60, carac- terizado por o indivíduo ser resistente ou ter adquirido resistência ao tratamento com uma terapia anticâncer anterior.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracteri- zado por a terapia anticâncer anterior ser quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada ou um inibidor de quinase.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracteri- zado por o inibidor de quinase ser um inibidor de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HER4, VEGFR ou AXL.
65. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por o inibidor de quinase ser erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, vandetanibe, afatinibe, osimertinibe, lazertinibe, poziotinibe, criotinibe, cabozantinibe, capmatinibe, axitinibe, lenvatinibe, nintedanibe, regorafenibe, pazopanibe, sorafenibe ou sunitinibe.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 65, caracterizado por a célula de câncer que expressa EGFR, c-Met ou EGFR e c-Met ser derivada de câncer de célula epitelial, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, NSCLC, adenocarcinoma pulmonar, câncer de pulmão de células pequenas, câncer colorretal, cân- cer anal, câncer de próstata, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de faringe, câncer de nariz, câncer pancreá- tico, câncer de pele, câncer oral, câncer de língua, câncer esofágico, cân- cer vaginal, câncer cervical, câncer do baço, câncer testicular, câncer gástrico, câncer do timo, câncer de cólon, câncer de tireoide, câncer de fígado, HCC ou carcinoma de células renais papilares esporádico ou he- reditário (PRCC).
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 66, caracterizado por compreender adicionalmente administrar uma ou mais terapias anticâncer ao indivíduo.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado por a uma ou mais terapias anticâncer compreender quimioterapia, uma terapia anticâncer direcionada ou um inibidor de quinase.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracteri- zado por o inibidor de quinase ser um inibidor de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HER4, VEGFR ou AXL.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado por o inibidor de quinase ser erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, vandetanibe, afatinibe, osimertinibe, lazertinibe, poziotinibe, criotinibe, cabozantinibe, capmatinibe, axitinibe, lenvatinibe, nintedanibe, regorafenibe, pazopanibe, sorafenibe ou sunitinibe.
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