A nordestina Maria do Carmo Ferreira da Silva (Carolina Dieckmann), abandonada pelo marido, parte com seus cinco filhos do interior de Pernambuco rumo ao Rio de Janeiro. Vestida de enfermeira, Nazaré (Adriana Esteves) sequestra sua filha recém-nascida, Lindalva. Na segunda fase da novela, a menina é batizada como Isabel (Carolina Dieckmann) e criada como filha por Nazaré (Renata Sorrah).
Maria do Carmo (Susana Vieira) é uma mulher forte e bem-sucedida, mãe dedicada de Reginaldo (Eduardo Moscovis), Leandro (Leonardo Vieira), Viriato (Marcello Antony) e Plínio (Dado Dolabella), e dona da loja de material de construções Do Carmo. É querida e respeitada em Vila São Miguel por sua ética e generosidade.
Reginaldo (Eduardo Moscovis), virou um político ambicioso que quer se tornar prefeito de Vila São Miguel e faz campanha pela emancipação da localidade. É casado com Leila (Maria Luisa Mendonça), com quem tem dois filhos, mas mantém um caso com sua assessora parlamentar Viviane (Letícia Spiller).
Giovanni Improtta (José Wilker) é presidente da escola de samba Unidos de Vila São Miguel. Uma de suas características é a inseparável gravata borboleta, além do esforço para falar bonito. Seu modo de falar caiu nas graças do público, que reproduzia nas ruas expressões como “felomenal”. O ex-bicheiro é apaixonado por Maria do Carmo, e disputa seu amor com o rival Dirceu (José Mayer).
A atriz Renata Sorrah foi eleita melhor atriz de televisão de 2004 pela Associação Paulista de Críticos de Arte (APCA), por sua atuação como Nazaré, que entrou para a história da dramaturgia nacional como uma das maiores vilãs de todos os tempos. A escada da casa da personagem e sua tesoura viraram símbolos da sua personalidade psicótica.
'Senhora do Destino' traz referências biográficas de Aguinaldo Silva, um nordestino que também deixou sua cidade natal (Carpina, em Pernambuco), para viver na região Sudeste do país. O nome da protagonista, Maria do Carmo Ferreira da Silva, e o do personagem Sebastião são homenagens à sua mãe e a um tio, irmão dela.
Canções de artistas como Djavan, Ivan Lins, Simone, Rita Lee, Gal Costa e Zélia Duncan embalaram a trilha sonora de 'Senhora do Destino'.