Enzymatisk sekventering bygger på den naturlige DNA-kopieringsmekanisme, der foregår i cellen under DNA-replikationen. Vha. oprenset DNA-polymerase får man i et prøverør dannet kopier af en DNA-streng. Metoden kræver, at det DNA, der ønskes sekventeret, er enkeltstrenget (ssDNA). Hvis det er dobbeltstrenget, er det nødvendigt, at strengene på forhånd adskilles (denatureres) ved behandling med base eller ved opvarmning.
Da DNA-polymerase ikke kan starte syntesen af en ny DNA-streng, men udelukkende er i stand til at forlænge et eksisterende DNA-stykke, må der kemisk syntetiseres et kort stykke ssDNA på 15-20 nukleotider, en såkaldt sekvensprimer. Dennes sekvens er komplementær til et DNA-område, der ligger tæt op ad det DNA, der skal analyseres. DNA-fragmentet og sekvensprimeren blandes i et prøverør, og pga. komplementariteten vil det lange fragment og den korte primer binde sig til hinanden. Der tilsættes en blanding af de fire byggesten i DNA-syntesen (deoxynukleosidtrifosfaterne dATP, dGTP, dCTP og dTTP), som skal fungere som substrater for DNA-polymerasen. For at man senere kan analysere produkterne fra reaktionen, bliver en del af nukleotiderne forinden mærket med detekterbare komponenter, som normalt er radioaktive isotoper som fx 32P eller 35S, eller fluorescerende grupper.
Blandingen opdeles mellem fire prøverør, som hver tilsættes en lav koncentration af en af fire forskellige unaturlige kædestoppere (dideoxyribonukleosidtrifosfater: ddATP, ddGTP, ddCTP eller ddTTP), der også fungerer som substrat for DNA-polymerasen og indsættes i positioner komplementært til nukleotiderne i den modsatte streng. Når DNA-polymerase tilsættes, starter syntesen af nye DNA-strenge, men med mellemrum indsætter enzymet en kædestopper i det nydannede molekyle, og så kan syntesen af DNA-strengen ikke fortsætte. Da kædestopperne indsættes i tilfældige positioner, bliver resultatet en blanding af DNA-strenge af forskellig længde. Ved at vælge det rigtige forhold mellem de naturlige byggesten og kædestopperne kan man opnå, at sandsynligheden for, at en kædestopper indsættes, er så lav, at polymeriseringen ofte fortsætter mange hundrede nukleotider hen ad DNA-strengen. Resultatet bliver en blanding af syntetiserede DNA-strenge, der alle indeholder den oprindelige sekvensprimer i den ene ende og en for hvert prøverør specifik kædestopper i den anden ende. Længden af strengen vil være et mål for nukleotidpositionen i det sekventerede DNA.
Når polymeriseringsprocessen er færdig, adskilles DNA-fragmenterne efter størrelse vha. gelelektroforese, og de enkelte fragmenter visualiseres ved eksponering af en røntgenfilm. DNA-sekvensen kan direkte aflæses ved at undersøge rækkefølgen af bånd i det alternerende mønster på røntgenfilmen.
Større sekventeringsprojekter bygger næsten udelukkende på den enzymatiske metode. Vha. denne metode kan man under optimale betingelser opnå sekvensinformation for op til ca. 800-1000 nukleotider i ét forsøg. Siden begyndelsen af 1990'erne har man forsket intensivt i automatisering af sekventeringsprocessen for at muliggøre sekventering af hele genomer. Der er udviklet en række forbedringer af metoden, der alle bygger på det samme grundprincip. Fx er det muligt at bestemme alle fire nukleotider i én reaktionsblanding ved at koble fluorescerende grupper med forskellige farver til de fire forskellige kædestoppere. Ligeledes har polymerasekædereaktionen (PCR) gjort det muligt at sekventere DNA-molekyler direkte, hvilket overflødiggør tidskrævende kloningsprocedurer, og pyrosekventering kan bruges ved større sekventeringsopgaver. Ved pyrosekventering kan man sekventere 100 mio. nukleotider på én maskine på nogle få timer.
Kommentarer (2)
skrev Niels Foldager
Der synes at mangle noget i sætningen:
" Ligeledes har polymerasekædereaktionen (PCR) gjort det muligt at sekventere DNA-molekyler direkte, hvilket overflødiggør tidskrævende kloningsprocedurer, og pyrosekventering kan ved større sekventeringsopgaver"
skrev Suzanne Rindom
Kære Niels Foldager
Tak for din kommentar. Du har ganske ret, men vi har ikke været i stand til at genskabe sætningen. Når vi får knyttet en fagansvarlig med den rette baggrund til området, vil vi lade vedkommende tage stilling til, hvad der skal ændres i artiklen, herunder at rette op på den ufuldstændige formulering.
Med venlig hilsen
Suzanne Rindom
Kommentarer til artiklen bliver synlige for alle. Undlad at skrive følsomme oplysninger, for eksempel sundhedsoplysninger. Fagansvarlig eller redaktør svarer, når de kan.
Du skal være logget ind for at kommentere.