Gramfarging

Her vert Gram-farginga nytta til å skilja Gram-positive bakteriar ut frå omliggande celler i menneskevev.

Gramfarging er ein mikrobiologisk arbeidsmetode der ein på relativt enkelt vis kan dela opp bakteriar i to grupper: Gram-positiv og Gram-negativ. Prosessen vart utvikla i 1884 av den danske mikrobiologen Hans Christian Gram for å skilja mellom Pneumococcus (ein streptokokk) og Klebsiella pneumoniae.

Teknikken vert først og fremst brukt på bakteriar, men ulike arkar kan òg reknast som Gram-positive eller negative. Dette er derimot av andre grunnar enn bakteriane.

Celleveggar i bakteriar

Bakteriar får ulik farge ved Gram-farging på grunn av skilnadar i den kjemiske oppbygnaden av celleveggen. Den utslagsgjevande faktoren er kor tjukt lag cella har av peptidoglykan.

Peptidoglykan eller murein er ein polymer av to sakkarid; N-acetylglukosamin (NAG) og N-acetylmuraminsyre (NAM). Dei ligg parvis i lange kjeder som bind seg til kvarandre via aminosyrer i sidekjedene til NAM. Ein finn desse kjedene rundt plasmamembranen i nesten alle ekte bakteriar (arkar har noko annleis struktur).

Gram-negative bakteriar har i tillegg eit ytre lag av lipopolysakkarid, (lipid og polysakkarid) og protein. Dette liknar litt på ein plasmamembran, og vert difor gjerne kalla den ytre membranen.

Teknikk

1) Prøver som skal gramfargast må først tørkast og fikserast på eit objektglas. Dette gjer ein oftast med ei flamme, men ein må vera forsiktig så ikkje ein drep cellene heilt.

2) Vidare tilset ein fargestoffet krystallfiolett.

3) Grams jod-løysing (jod, kaliumjodin KI og destillert vatn) vert tilsett for å danna kompleks med krystallfiolett. Produktet av dette er ikkje løyseleg i vatn.

4) Det fjerde steget er avfarginga av prøva. Ein vaskar ho i alkohol for å fjerna fargen frå dei Gram-negative bakteriane. Det er viktig å rekna passeleg med tid her; viss prøva vert utsett for alkohol i nokre få sekund for mykje vert både dei Gram-positive og dei Gram-negative cellene avfarga.

5) Som eit eventuelt femte steg set ein til eit andre fargestoff, gjerne safranin eller nøytralt raudt. Dette er svakare enn krystallfiolett og vil berre visa seg i dei avfarga, Gram-negative bakteriane.

Korleis det fungerer

Krystallfiolettstoffet trengjer seg inn gjennom celleveggen og -membranen til cella og fargar ho lilla. Når jodet vert tilsett bind det seg med krystallfiolett og dannar store kompleks, både i dei indre og dei ytre laga til cella.

Alkoholen som vert brukt i avfarginga samhandlar først og fremst med lipida i plasmamembranen. Gram-negative celler mister den ytre membranen sin (LPS-laget) og med den dei store krystallfiolett/jod-kompleksa. Dei Gram-positive cellene vert derimot dehydrerte av handsaminga. På grunn av dei tjukke peptidoglykan-laga kjem ikkje krystallfiolettfargen seg ut av cella.