Imunoassay

Imunoassay je metoda podobná chromatografii na tenké vrstvě, ale podstatně přesnější. Tato metoda je založena na imunologické reakci antigenu (analyt) s protilátkou (činidlo). V podstatě jde o sledování základní imunitní reakce proti zvolené droze nebo metabolitu, ale problém je, že drogy nebo metabolity imunitní reakci v organismu běžně nevyvolávají.

Získání protilátky

Běžný postup

Běžnou cestou je výroba protilátek hypersenzibilizací zvířete (typicky králíka, nebo slepic – protilátka pak je ve vejcích) drogou spojenou s proteinem mnohdy tisíckrát větším než je droga sama. Droga navázaná na protein se nazývá hapten a vzniklému komplexu říkáme imunogen. Po vstupu imunogenu do organismu a po určité inkubační době se odebere krev zvířete a protilátky se z krve vyizolují a pročistí, čímž vznikne antisérum. Čím silnější je reakce antiséra s antigenem, tím je vyšší titr séra. Ten udává, do jakého zředění bude reakce zhruba průkazná, takže titr běžných antisér 1:500 značí, že budou reagovat na imunogen zhruba do zředění 1:500. Antisérum vyprodukované touto cestou není tvořeno jednou čistou protilátkou, ale spíše směsí rozdílných protilátek specifických proti různým oblastem imunogenu a takováto antiséra se označují jako polyklonální a mohou se lišit, dokonce i když pocházejí ze stejného zvířete. Pro důvěryhodnou analýzu je toto zásadní problém.

Aby se alespoň částečně zamezilo možnosti chyb, tak se například sportovcům odebírá vzorků víc a testují se postupně s různými časovými intervaly. V případě, že dva sportovci dopovali stejnou dávkou nandrolonu, ale půl roku po sobě a na analýzu se použijí dvě odlišné šarže protilátek, tak jednou sportovci doping dokáží, ale druhému ne.

Vylepšený postup

Určitým krokem ke zlepšení byl vynález produkce monoklonálních protilátek. Tento postup je obdobný jako u běžného postupu. Prvním krokem je vložení imunogenu do zvířete, ale zvíře se po inkubační době zabije a odeberou se mu buňky sleziny. Tyto buňky produkují protilátky. Jejich spojením s rakovinnými buňkami vzniknou téměř nesmrtelné buňky. Nakonec se vyberou ty nejlepší z nich (produkují protilátky, které se na antigen vážou nejúčinněji) a udržují se v konstantních podmínkách. Takové buňky neustále produkují vysoce specifická antiséra s vysokým titrem. Přesto i tyto takřka dokonalé protilátky mohou reagovat s látkami se strukturami podobnými analytu. (např. neškodný efedrin reaguje s antisérem proti amfetaminu/metamfetaminu)

I přes některé výhody se může stát, že protilátka bude reagovat i s látkou, proti níž není určena, což občas vede k falešně pozitivním výsledkům, a proto se imunoassay používá jen jako přibližná metoda k odlišení vzorků. Její výhodou je její snadná automatizace, takže je možné současně analyzovat desítky či stovky vzorků.

Literatura

Berson S. A., Yalow R. S., Bauman A., Rothschild M. A. and Newerly K., Insulin-I131 metabolism in human subjects: demonstration of insulin binding globulin in the circulation of insulin treated subjects, Journal of Clinical Investigation, vol. 35, no. 2, 170-190 (1956)
Yalow R. S. and Berson S. A., Immunoassay of endogenous plasma insulin in man, Journal of Clinical Investigation, vol. 39, no. 7,1157-1175 (1960)
Yalow R. S. and Berson S. A., Immunoassay of plasma insulin in man, Diabetes, vol. 10, no. 5, 339-344 (1961)
Wide L. and Porath J., Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies, Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, vol. 130, no. 1, 257-260 (1966)
Nakane P. K. and Pierce G. B. Jr., Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens, Journal of Cell Biology, vol. 33, no. 2, 307-318 (1967)
Avrameas S., Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies, Immunochemistry, vol. 6, no. 1, 43-52 (1969)
Engvall E. and Perlmann P., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G, Immunochemistry, vol. 8, no. 9, 871-874 (1971)
van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M., Immunoassay using antigen-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 15, no. 3, 232-236 (1971)
van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M., Immunoassay using hapten-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 24, no. 1, 77-81 (1972)
Pittman J. A. Jr., RIA: An historical note, Clinical Chemistry, vol. 19, no. 7, 793 (1973)
van Weemen B. K. and Schuurs A. H. W. M,, Immunoassay using antibody-enzyme conjugates, FEBS letters, vol. 43, no. 2, 215-218 (1974)
Voller A., Bidwell D. E. and Engvall E., A microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay and its application to malaria, Bulletin of the World Health Organization, vol. 51, no. 2, 209-211 (1974)
Voller A., Bidwell D. E. and Bartlett A., Enzyme immunoassays in diagnostic medicine, Bulletin of the World Health Organization, vol. 53, no. 1, 55-65 (1976)
Yalow R. S., Citation Classic, Current Contents, 14, 98 (1977)
Yalow R. S., Radioimmunoassay: a probe for the fine structure of biologic systems, Science, vol. 200, no. 4347, 1236-1245 (1978)
Engvall E., Citation Classic, Current Contents, 12, 16 (1987)
Voller A. and Bidwell D. E., Better health care with microplate ELISA, Citation Classic, Current Contents, 17, 14 (1989)
Mujumdar R. B., Ernst L. A., Mujumdar S. R. and Waggoner A. S., Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups, Cytometry, vol. 10, no. 1, 11-19 (1989)
Yalow R. S., Remembrance project: origins of RIA, Endocrinology, vol. 129, no. 4, 1694-1695 (1991)
Engvall E., Perspective on the historical note on EIA/ELISA by Dr. R. M. Lequin, Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2225 (2005)
van Weemen B. K., The rise of EIA/ELISA, Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2226 (2005)
Lequin R. M., Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry, vol. 51, no. 12, 2415-2418 (2005)
Avrameas S., Historical background of the invention of EIA and ELISA, Clinical Chemistry, vol. 52, no. 7, 1430-1431 (2006)
Hammarström S., Berzins K., Biberfeld P., Engvall E., Hammarström M.-L., Holm G., Troye-Blomberg M. and Wahlgren M., Peter Perlmann 1919-2005, Scandinavian Journal of Immunology, vol. 63, no. 6, 487-489 (2006)

Externí odkazy

Obrázky, zvuky či videa k tématu Imunoassay na Wikimedia Commons
Seriál o detektivní chemii v brožuře KSICHTu