Restrikcijski encim

Restrikcijski encim (ali restrikcijska endonukleaza) je encim, ki razreže dvojnovijačno DNA na specifičnih mestih nukleotidnih sekvenc, imenovanih restrikcijska mesta. Ti encimi so se razvili v bakterijah in v arhejah kot obrambni mehanizem pred virusi.V bakterijski celici kot gostiteljici virusa restrikcijski encim razreže oz. razcepi virusno DNA v procesu, ki se imenuje restrikcija. Do restrikcije bakterijske DNA ne pride, saj je le-ta metilirana (z encimom metilaza). Restrikcijski encim in metilaza skupaj tvorita restrikcijski modifikacijski sistem. Restrikcijski encim razreže DNA na dveh mestih – na vsaki verigi dvojne vijačnice po enkrat. Proučevali so preko 3000 restrikcijskih encimov, več kot 600 jih je komercialno dostopnih in se rutinsko uporabljajo pri delu z DNA v laboratorijih.

Struktura dimera restrikcijskega encima EcoRI (modro in zeleno), vezanega na molekulo DNA (rjavo). Na vsakem monomeru je prikazan en ion magnezija (roza), ki ima katalitično funkcijo.

ZGODOVINA

Prvi izolaciji restrikcijskega encima leta 1970 (Hindll) so sledila odkritja in karakterizacije številnih restrikcijskih endonukleaz, leta 1978 so na tem področju raziskovalci Daniel Nathans, Werner Arber in Hamilton O. Smith prejeli Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino. Njihovo odkritje je vodilo v razvoj tehnologije rekombinantne DNA, ki na primer omogoča produkcijo humanega inzulina za zdravljene diabetesa z uporabo bakterije E. Coli.

PREPOZNAVNO MESTO

Palindromsaka prepoznavna mesta - dušikove baze se berejo enako v obe smeri.

Restrikcijski encimi prepoznajo specifično sekvenco nukleotidov in naredijo rez v obeh verigah DNA. Prepoznavna mesta ponavadi obsegajo 4 do 8 nukleotidov. Mnoga prepoznavna mesta so palindromska, kar pomeni da se dušikove baze berejo enako v obe smeri. V teoriji obstajata dva tipa palindromskih sekvenc: ogledalu podoben (mirror-like) in obratno ponovljen (inverted repeat). Za "mirror-like" palindrom je značilno, da se sekvenca bere enako znotraj ene verige v molekuli DNA, na primer GTAATG. "Inverted repeat" palindrom se prav tako bere enako v obe smeri, le da se takšne sekvence nahajajo na komplementarnih verigah molekule DNA, na primer GTATAC (kar je komplementarno CATATG). Bolj pogosti so obratno ponovljeni palindromi, ki imajo pomembnejšo biološko vlogo kot pa ogledalu podobni.

EcoRI razcepi verigo tako, da dobimo lepljive ("sticky") konce,

medtem ko SmaI restrikcijski encim razcepi do topih ("blunt") koncev:

Sekvence DNA, ki jih restrikcijski encim prepozna, se od encima do encima razlikujejo, in sicer v dolžini in vrsti sekvence ter v orientaciji verige lepljivih koncev (5’ ali 3’ konec).

Neošizomere so različni restrikcijski encimi, ki prepoznajo isto sekvenco, a razcepijo DNA na različnih mestih znotraj prepoznane sekvence. Izošizomere pa so različni restrikcijski encimi, ki prepoznajo in tudi razcepijo na enakih mestih molekule DNA.

DELITEV

Restrikcijke endonukleaze rezdelimo v tri ali štiri osnovne skupine (tip I, II in III, tudi IV). Vse vrste encimov specifično prepoznajo kratko sekvenco DNA in jo endonukleazno razcepijo, tako da nastanejo dvojnoverižni fragmenti DNA s terminalnim 5'-fosfatom. Posamezne skupine se razlikujejo v zgradbi, potrebi po encimskem kofaktorju, po naravi sekvence, ki jo prepoznajo ter po poziciji razcepitvenega mesta glede na mesto prepoznave v molekuli DNA. Osnovne značilnosti posameznih tipov so:

• Encimi tipa I (EC 3.1.21.3) razcepijo na predelu, ki je oddaljen od prepoznavnega mesta; za delovanje potrebujejo ATP in S-adenozil-L-metionin; protein je multifunkcionalen, z restrikcijsko in metilazno (EC 2.1.1.72) aktivnostjo.
• Encimi tipa II (EC 3.1.21.4) razcepijo znotraj prepoznavnega mesta ali blizu njega; večinoma za delovanje potrebujejo magnezij; imajo samo restrikcijsko funkcijo.
• Encimi tipa III (EC 3.1.21.5) razcepijo na mestih, ki so blizu prepoznavnega mesta; potrebujejo ATP (toda ga ne hidrolizirajo); S-adenozil-L-metionin stimulira reakcijo, toda ni nujen; obstaja kot del kompleksa z metilazo (EC 2.1.1.72).
• Encimi tipa IV ciljajo metilirano DNA.

TIP I

Restrikcijski encimi tipa I so bili prvi, ki so bili odkriti, prav tako so bili predstavniki te skupine prvi najdeni v dveh različnih sevih E. Coli (K-12 in B). Ti encimi cepijo na različnih mestih, ki so naključno oddaljeni (vsaj 1000 bp) stran od njihovega prepoznavnega mesta. Razcepitvi sledi proces translokacije DNA. Prepoznavno mesto je asimetrično, sestavljeno iz dveh delov (prvi vsebuje 3-4 nukleotide, drugi pa je iz 4-5 nukleotidov), med katerima je vmesnik iz 6-8 nukleotidov. Ti encimi so multifunkcionalni, sposobni so restrikcije in modifikacijske aktivnosti, odvisno od metiliranosti tarčne DNA. Za popolno aktivnost so potrebni kofaktorji: S-adenozil-L-metionin (AdoMet), ATP in magnezijevi ioni. Endonukleaze tipa I so sestavljene iz treh podenot: HsdR, HsdM in HsdS. HsdR je potrebna za restrikcijo, HsdM za pripenjanje metilnih skupin na molekulo DNA (metiltransferazna aktivnost), HsdS pa je pomembna za specifičnost prepoznave določene sekvence DNA.

TIP II

Endonukleaze tipa II so dimeri, sestavljeni le iz ene podenote. Prepoznavna mesta so ponavadi nedeljena in palindromska, sestavljena iz 4-8 nukleotidov. Molekulo DNA razcepijo na istem mestu kot jo prepoznajo (na prepoznavnem mestu), za delovanje ne potrebujejo ATP, niti AdoMet, ponavadi pa potrebujejo magnezijeve ione kot kofaktor. Predstavniki te skupine se najpogosteje uporabljajo. V 90. letih so odkrili nove encime iz te skupine, ki niso ustrezali vsem kriterijem, zato so razvili novo nomenklaturo poddružin in tako razdelili to veliko skupino na več podkategorij na podlagi odstopanj od tipičnih značilnosti skupine II endonukleaz. Te podskupine so označene s pripono poleg II. Tip IIB endonukleaz (na primer BcgI in BplI) so multimeri, sestavljeni iz večih podenot. Molekulo DNA razcepijo na obeh straneh prepoznavnega mesta, tako da to prepoznavno sekvenco izrežejo ven. Za delovanje poleg Mg2+ potrebujejo tudi AdoMet. Tip IIE endonukleaz (na primer NaeI) interagira z dvema kopijama prepoznavnih mest. Eno prepoznavno mesto nastopa kot tarčno mesto za razcepitev, medtem ko drugo deluje kot alosterični modulator, ki pospeši ali izboljša učinkovitost razcepitve. Tip IIF endonukleaz (na primer NgoMIV) prav tako interagira z dvema kopijama prepoznavnih mest, toda razcepitev poteče na obeh mestih istočasno. Tip IIG endonukleaz (na primer Eco57I) ima eno podenoto, kot je značilno za klasični tip II encimov, toda potrebuje AdoMet za delovanje. Tip IIM endonukleaz (na primer DpnI) lahko prepoznajo in razrežejo metilirano DNA. Tip IIS endonukleaz (na primer FokI) razcepi DNA na določeni razdalji od njihovega nepalindromskega asimetričnega prepoznavnega mesta. Lahko so v obliki dimerov. Tudi tip IIT endonukleaz (na primer Bpu10I in BslI) je sestavljen iz dveh različnih podenot. Nekateri restrikcijski encimi prepoznajo palindromske (simetrične) sekvence, medtem ko imajo drugi asimetrična prepoznavna mesta.

TIP III

Restrikcijski encimi tipa III (na primer EcoP15) prepoznajo dve ločeni nepalindromski sekvenci, ki sta obratno orientirani. Molekulo DNA razcepijo približno 20-30 baznih parov stran od prepoznavnega mesta. Sestavljeni so iz večih podenot, za delovanje potrebujejo AdoMet in ATP kot kofaktorje za metilacijo in restrikcijo. So komponenta restrikcijsko-modifikacijskega mehanizma pri prokariontski DNA, ki varuje organizem pred vdorom tuje DNA. Encimi tipa III so hetero-oligomerni multifunkcionalni proteini sestavljeni iz dveh podenot: Res in Mod. Mod podenota specifično prepozna sekvenco DNA in deluje kot metiltransferaza (podobno kot podenoti M inS pri tipu I). Res podenota je potrebna za restrikcijo, čeprav sama po sebi nima encimske aktivnosti. Ti encimi prepoznajo kratko 5-6 baznih parov dolgo sekvenco DNA in razcepijo 25-27 bp nižje, tako da na 5'-koncu pustijo kratko, enoverižno izboklino. Za restrikcijo potrebujejo prisotnost dveh obratno orientiranih nemetiliranih prepoznavnih mest. Ti encimi metilirajo samo eno verigo DNA (na N-6 mestu adenozilnih preostankov), kar pomeni da bo imela na novo podvojena molekula DNA samo eno verigo metilirano, kar je dovolj za zaščito te nove DNA pred restrikcijo. Ta tip encimov sodi v beta-poddružino N6-adenin-metiltransferaz, saj za delovanje potrebuje AdoMet.

UMETNI RESTRIKCIJSKI ENCIMI

Umetne endonukleaze lahko pridobivamo s fuzijo vezavne domene DNA in nukleazne domene (pogosto razcepitvena domena tipa IIS endonukleaze FokI). Takšni umetni encimi lahko ciljajo na velike predele DNA (do 36bp) in so lahko skonstruirani tako, da se vežejo na točno določeno sekvenco DNA. Kot restrikcijski encimi se najpogosteje uporabljajo nukleaze s cinkovimi prsti. Le-te so splošno uporabljene v genskem inženiringu, lahko pa se uporabljajo tudi v bolj klasičnem genskem kloniranju. Ostali umetni restrikcijski encimi temeljijo na DNA vezavni domeni TAL efektorjev.

NOMENKLATURA

Izpeljava EcoRI imena
Okrajšava	Pomen	Opis
E	Escherichia	rod
co	coli	vrsta
R	RY13	sev
I	Prvi odkrit	Vrstni red odkritja v bakteriji

Vse od prvega odkritja v 70. letih je bilo iz različnih bakterij identificiranih že več kot 100 različnih restrikcijskih encimov. Vsak encim poimenujemo po bakteriji iz katere je bil izoliran z uporabo sistema za poimenovanje na podlagi rodu, vrste in seva bakterije.

UPORABA

Izolirani restrikcijski encimi se uporabljajo pri delu z DNA v različne raziskovalne namene.

Uporabljajo se kot pomoč pri vstavljanju genov v plazmidne vektorje (pri raziskavah genskega kloniranja in ekspresije proteinov). Za optimalno uporabo plazmidov so le-ti modificirani, tako da vsebujejo polilinker, imenovan MCS (multiple cloning site), ki je bogat s prepoznavnimi sekvencami za restrikcijske encime. To omogoča prilagodljivost pri vstavljanju genskih fragmentov v plazmidni vektor. Ker se moramo izogniti razcepitvi željene molekule DNA, a hkrati razrezati konce DNA, je izbor prave endonukleaze zelo pomemben (poznati moramo restrikcijske sekvence v molekuli DNA). Pri kloniranju genskih fragmentov v vektorjih, se tako plazmidna DNA kot tudi genski vstavek razcepita z istim restrikcijskim encimov in se nato zlepita skupaj s pomočjo DNA ligaze.

Endonukleaze se uporabljajo tudi za razlikovanje genskih alelov s prepoznavanjem zamenjav ene baze v molekuli DNA, kar poznamo kot polimorfizem enega nukleotida (SNP – single nucleotide polymorphism). To je mogoče le, če SNP spremeni restrikcijsko mesto v alelu. V tej metodi se restrikcijski encim uporabi za genotipizacijo vzorca DNA, brez dragega genskega sekveniranja. Vzorec DNA se na začetku razreže z restrikcijskim encimom na posamezne fragmente, katere se z gelsko elektroforezo nato loči. Pri alelih s pravimi prepoznavnimi mesti bomo videli dva trakova DNA, saj je prišlo do razcepitve verige z restrikcijskimi encimi. Pri tistih alelih, ki imajo spremenjeno prepoznavno sekvenco, pa bomo videli le en trak DNA, saj do razcepitve ni prišlo zaradi neprepoznavnosti sekvence za endonukleaze. Število trakov nam pove genotip posameznika kot primer restrikcijskega mappinga.

Restrikcijski encimi se uporabljajo tudi za rezanje genomske DNA za gensko analizo s Southern blot metodo. Ta metoda omogoča raziskovalcem določiti število kopij genov v genomu posameznika oziroma določiti število genskih mutacij v populaciji. Uporablja se tudi v RFLP (restriction fragment lenght polymorphism).

PRIMERI

Encim	Vir	Prepoznavna sekvenca	Mesto razcepitve
EcoRI	Escherichia coli	5'GAATTC 3'CTTAAG	5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'
EcoRII	Escherichia coli	5'CCWGG 3'GGWCC	5'--- CCWGG---3' 3'---GGWCC ---5'
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	5'GGATCC 3'CCTAGG	5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'
HindIII	Haemophilus influenzae	5'AAGCTT 3'TTCGAA	5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
TaqI	Thermus aquaticus	5'TCGA 3'AGCT	5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'
NotI	Nocardia otitidis	5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG	5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5'
HinfI	Haemophilus influenzae	5'GANTCA 3'CTNAGT	5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5'
Sau3A	Staphylococcus aureus	5'GATC 3'CTAG	5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---5'
PovII*	Proteus vulgaris	5'CAGCTG 3'GTCGAC	5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5'
SmaI*	Serratia marcescens	5'CCCGGG 3'GGGCCC	5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5'
HaeIII*	Haemophilus aegyptius	5'GGCC 3'CCGG	5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5'
HgaI	Haemophilus gallinarum	5'GACGC 3'CTGCG	5'---NN NN---3' 3'---NN NN---5'
AluI*	Arthrobacter luteus	5'AGCT 3'TCGA	5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'
EcoRV*	Escherichia coli	5'GATATC 3'CTATAG	5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5'
EcoP15I	Escherichia coli	5'CAGCAGN25NN 3'GTCGTCN25NN	5'---CAGCAGN25NN ---3' 3'---GTCGTCN25 NN---5'
KpnI	Klebsiella pneumoniae	5'GGTACC 3'CCATGG	5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5'
PstI	Providencia stuartii	5'CTGCAG 3'GACGTC	5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5'
SacI	Streptomyces achromogenes	5'GAGCTC 3'CTCGAG	5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5'
SalI	Streptomyces albus	5'GTCGAC 3'CAGCTG	5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5'
ScaI	Streptomyces caespitosus	5'AGTACT 3'TCATGA	5'---AGT ACT---3' 3'---TCA TGA---5'
SpeI	Sphaerotilus natans	5'ACTAGT 3'TGATCA	5'---A CTAGT---3' 3'---TGATC A---5'
SphI	Streptomyces phaeochromogenes	5'GCATGC 3'CGTACG	5'---GCATG C---3' 3'---C GTACG---5'
StuI	Streptomyces tubercidicus	5'AGGCCT 3'TCCGGA	5'---AGG CCT---3' 3'---TCC GGA---5'
XbaI	Xanthomonas badrii	5'TCTAGA 3'AGATCT	5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

Legenda:
* = topi konci
N = C ali G ali T ali A
W = A ali T