Isotiocianato de fluoresceína

Isotiocianato de fluoresceína o fluoresceína-5-isotiocianato por sus siglas en ingles FITC (Fluorescein IsoTioCyanate) pertenece al grupo de los colorantes de xanteno. Es un fluorocromo derivado de la fluoresceína. FITC es la molécula de fluoresceína original funcionalizada con un isotiocianato de grupo reactivo ( -N = C = S ), en sustitución de un hidrógeno en el átomo de anillo de la parte inferior de la estructura. Este derivado es reactivo frente a nucleófilos incluyendo grupos amina y sulfhidrilo de proteínas. Un succinimidil-éster es un grupo funcional unido al núcleo de fluoresceína, la creación de NHS-fluoresceína , forma otro derivado reactivo amina común que tiene mucho mayor especificidad hacia las aminas primarias en la presencia de otros nucleófilos.

Los Fluorocromos son moléculas capaces de emitir fluorescencia al ser excitadas con luz ultravioleta. Cada fluorocromo presenta un espectro de absorción y de emisión caracteristicos. Entre los fluorocromos más usados en inmunohistoquímica figuran la fluoresceína, el isoticianato de fluoresceína, la rodamina B, el isotiocianato de rodamina B, el DANS y cloruro de dansilo. A pesar de que el isoticianato de fluoresceína se altera cuando se almacena durante periodos largos de tiempo es más estable que la fluoresceína.

Usos y aplicaciones

El FITC se usa para el marcado de diversas biomoléculas como inmunoglobulinas, lectinas, diversas proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligo y polisacáridos. Los productos así marcados se usan como reactivos para tinciones de hibridación de afinidad, inmuno e in situ en cortes, pero también para la tinción de células vivas y para la tinción en métodos de citometría de flujo. Los cortes de tejidos y monolayers celulares pueden teñirse con FITC según diversos métodos.

Se utiliza en una gran cantidad de aplicaciones, como la citometría de flujo, tasa de filtración glomerular, marcando la combinación de anticuerpos​ , que es la tinción más utilizada​ , técnicas de inmunofluorescencia en donde se utilizan como marcadores compuestos de fluoresceína que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto ​. El isotiocianato de fluoresceína emite luz verde amarillenta intensa.

La microscopia de inmunofluorescencia es una técnica inmunohistoquímica que consiste en conjugar colorantes fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina B de lisamina o ácido 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfónico) con anticuerpos o antígenos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia ​.

Espectroscopía

Los espectros de excitación y de emisión suelen presentar gran simetría en longitud de onda larga. Esta regla es aplicable a cualquier fluorocromo y fue descubierta por Lewshin​.

El estudio de estas curvas espectrales ponen de manifiesto que la intensidad de la fluorescencia guarda relación tanto con la intensidad de la radiación excitante como con la producción de cuantos. Toda radiación que parte de un manantial luminoso se cede en forma de pequeños paquetes de energía llamados cuantos.

En su espectro de excitación tiene un pico máximo de 492 nm y un pico minimo de 320 nm. La emisión máxima se realiza a los 518 nm, en la región verde-azulada del espectro, color que puede modificarse al introducir flitros amarillos5.

Enlaces externos

• Enlace externo a modo de ejemplo.