„RNA-Seq“ – Versionsunterschied

Als '''RNA-Seq''', auch „Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung“<ref name="morin2008">{{cite journal | journal=BioTechniques | volume=45 | issue=1 | pages=81–94 | year=2008 | author=Ryan D. Morin, Matthew Bainbridge, Anthony Fejes, Martin Hirst, Martin Krzywinski, Trevor J. Pugh, Helen McDonald, Richard Varhol, Steven J.M. Jones, and Marco A. Marra. | title=Profiling the HeLa S3 transcriptome using randomly primed cDNA and massively parallel short-read sequencing | | pmid=18611170 | doi=10.2144/000112900}}</ref> genannt, wird die Bestimmung der [[Nukleotide|NukleotidNukleotidabfolge]]abfolge der [[RNA]] bezeichnet, die auf Hochdurchsatzmethoden (''(Next-Generation Sequencing)'') basiert. Hierfür wird die RNA in [[cDNA]] übersetzt, damit die Methode der [[DNA-Sequenzierung]] angewendet werden kann. RNA-Seq enthüllt Informationen zur [[Genexpression]], wie zum Beispiel wie unterschiedliche [[Allel]]e eines [[Gen]]s exprimiert sind,werden und ermöglicht das Erkennen von [[Posttranskriptionale Modifikation|posttranskriptionalen Modifikationen]], odersowie die Identifizierung von [[Fusions-Gen]]en.<ref name="wang2009">{{cite journal | journal=[[Nature Reviews Genetics]] | volume=10 | issue=1 | pages=57–63 | date=January 2009-01 | author=Zhong Wang, Mark Gerstein, Michael Snyder| title=RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics | pmid=19015660 | pmc=2949280 | doi= 10.1038/nrg2484}}</ref>

Die Zelle verwendet nur einen Teil ihrer [[Gen|Gene]]. Darunter fallen die [[Haushaltsgen|Haushaltsgene]]e und die Gene der spezialisierten Zelle. Zum Beispiel haben [[Muskelfaser|Muskelzellen]] mechanische Eigenschaften, undwährend β-Zellen der [[Erythrozyt|BlutzellenLangerhans-Inseln]] könnenInsulin Sauerstoff transportierenproduzieren. Alle diese Zellen haben identische Gene, unterscheiden sich aber in Ihrerihrer [[Genexpression]]. Genexpression ist die Synthese von Proteinen aus der [[DNA]]. Die [[Genexpressionsanalyse]] oder auch Transkriptom-Analyse misst, welche Gene ein- oder ausgeschaltet sind. Wenn ein Gen angeschaltet ist, dann werden Teile des Gens in die [[mRNA]] übergeführt. Methoden der Genexpressionsanalyse, wie die des RNA-Seq, misst die Konzentration der mRNA in verschiedenen experimentellen Bedingungen (z.&nbsp;B. mit/ohne Medikamente). Die Genexpressionsanalyse folgt also der Frage, wie sich die mRNA-Konzentration durch Medikamente, in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Zelle, im gesunden oder erkrankten Zustand verhält.

Mit der RNA-Sequenz kann man den Mechanismus des [[Alternatives Spleißen|alternativen Spleißens]]<ref name="pmid19289445">{{cite journal| author=Trapnell C, Pachter L, Salzberg SL| title=TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. | journal=Bioinformatics | year= 2009 | volume= 25 | issue= 9 | pages= 1105-111105–1111 | pmid=19289445 | doi=10.1093/bioinformatics/btp120 | pmc=PMC2672628 | url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&tool=sumsearch.org/cite&retmode=ref&cmd=prlinks&id=19289445 2672628 }} </ref> sowie Fusionsgene<ref name="pmid17425505">{{cite journal| author=Teixeira MR| title=Recurrent fusion oncogenes in carcinomas. | journal=Crit Rev Oncog | year= 2006 | volume= 12 | issue= 3-43–4 | pages= 257-71257–271 | pmid=17425505 | doi= | pmc= | url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&tool=sumsearch.org/cite&retmode=ref&cmd=prlinks&id=17425505 }} </ref> besser verstehen. Alternatives Spleißen ist der Prozess, bei dem die pre-RNA in verschiedene mRNAs und somit auch in verschiedene Proteine umgewandelt wird. Fusionsgene sind Hybridgene aus zwei vorher getrennten Genen, vereint in einem Gen. Fusionsgene entstehen durch [[Translokation (Genetik) | Translokation]], interstitielle [[Deletion | interstitielle Deletion]] oder durch chromosomale [[Inversion (Genetik) | chromosomale Inversion]].

[[Datei:RNA_Seq_ExperimentRNA Seq Experiment.png|miniaturmini|Arbeitsablauf]]

Meist interessiert man sich für die [[mRNA]], die einen Entwurf für Proteine darstellt. Jedoch besteht die [[RNA]] einer Zelle zu 90&nbsp; % aus [[rRNA]]. Um die mRNA von der rRNA zu trennen, gibt es standardisierte Methoden zur [[RNA-Reinigung]], sogenannte "Ribosomal„Ribosomal DeletionDepletion Kits"Kits“. Für die spätere Sequenzierung ist es notwendig, die mRNA zu fragmentieren, da die Sequenzierungstechniken nur eine bestimmte Leselänge haben. Die Fragmentierung kann sowohl vor (RNA-Fragmentierung) als auch nach der Konvertierung in die cDNA (cDNA-Fragmentierung) erfolgen. Die cDNA-Fragmentierung erzielt bessere Ergebnisse am 5'-Ende, jedoch zeigt sich eine schlechte Qualität in der Mitte des Transkripts, wo die RNA-Fragmentierung besser abschneidet.<ref name="wang2009" />

In der Probenaufbereitung muss man abwägen, ob man die Leserichtung, also strangspezifische Informationen, berücksichtigt. Damit kann man Artefakte ausschließen, die von der [[Antisense-RNA|aRNA]] stammen. Jedoch ist das ein sehr zeit- und arbeitsintensiver Schritt.<ref name="pmid18516046">{{cite journal| author=Cloonan N, Forrest AR, Kolle G, Gardiner BB, Faulkner GJ, Brown MK et al.| title=Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. | journal=[[Nat Methods]] | year= 2008 | volume= 5 | issue= 7 | pages= 613-9613–619 | pmid=18516046 | doi=10.1038/nmeth.1223 | pmc= | url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&tool=sumsearch.org/cite&retmode=ref&cmd=prlinks&id=18516046 }} </ref> Die aRNA inhibitiert durch Basenpaarung mit der komplementären mRNA deren [[Translation (Biologie)|Translation]] in der Zelle und beeinflusst die Genexpression einzelner Gene.

Es gibt mittlerweile sehr viele Hochdurchsatzmethoden, welche den Einbau eines einzellneneinzelnen Nukleotids in die DNA in ein elektrisches Signal umwandeln. Viele dieser Methoden unterscheiden sich in der Durchführung. Hier nun ein Beispiel für die Sequenzierung auf dem Illumina Genome Analyzer II:<ref name="pmid19336255">{{cite journal| author=Wilhelm BT, Landry JR| title=RNA-Seq-quantitative measurement of expression through massively parallel RNA-sequencing. | journal=Methods | year= 2009 | volume= 48 | issue= 3 | pages= 249-57249–257 | pmid=19336255 | doi=10.1016/j.ymeth.2009.03.016 | pmc= | url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&tool=sumsearch.org/cite&retmode=ref&cmd=prlinks&id=19336255 }} </ref>

Die wohl größte Herausforderung in der Datenanalyse von RNA-Seq besteht darin, die gelesenen Fragmente (Reads) dem Referenzgenom zuzuordnen. Das mag für einen einzellneneinzelnen Read trivial erscheinen, jedoch für Millionen von Reads brauchen etablierte Alignmentverfahren wie zBz.&nbsp;B. [[BLAST-Algorithmus|BLAST]] 43 Stunden um 10 Millionen Reads mit einer Länge von 32 [[Basenpaar|bp]] dem Referenzgenom zuzuordnen.<ref name="pmid19336255" />. Deshalb war es notwendig, neue Algorithmen für das Read Mapping zu entwerfen.

Beim Read Mapping gibt es Algorithmen, die das [[Spleißen (Biologie)|Spleißen]] berücksichtigen, wie zBz.&nbsp;B. ''exon first'' oder ''seed and extend'', sowie Algorithmen, die das Spleißen nicht berücksichtigen wie zBz.&nbsp;B. ''seed methods'' oder ''Burrows-Wheeler Aligner''.<ref name="pmid21623353">{{cite journal| author=Garber M, Grabherr MG, Guttman M, Trapnell C| title=Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. | journal=Nat Methods | year= 2011 | volume= 8 | issue= 6 | pages= 469-77469–477 | pmid=21623353 | doi=10.1038/nmeth.1613 | pmc= | url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&tool=sumsearch.org/cite&retmode=ref&cmd=prlinks&id=21623353 }} </ref>.

[[Kategorie:Biologische UntersuchungsmethodeMolekularbiologie|Dna-SequenzierungDnaSequenzierung]]

[[Kategorie:Gentechnik|DNA-SequenzierungDNASequenzierung]]