„T7-RNA-Polymerase“ – Versionsunterschied

| Name = RNA-Polymerase (Phage T7)

| Bild = T7 RNA polymerase.jpg

| Bild_legende = <!-- = nach {{PDB|1I6H1MSW}} -->

| PDB = s. UniProt<!-- {{PDB2|1YY1}}, {{PDB2|ABCD}} -->

| GrößeGroesse = 883 Aminosäuren

| Symbol = 1 ([httphttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&term=1261050 Entrez])

| UniProt = P00573

| EC-Nummer = 2.7.7.6

| Kategorie = Nukleotidyltransferase

| Reaktionsart =

| Substrat = Nucleosidtriphosphat + RNA_n

| Produkte = Diphosphat + RNA_n+1

| Homolog_dbHomolog_fam = NV

Die '''T7 -RNA-Polymerase''' ist die [[RNA-Polymerase]] aus dem [[Phage]]n T7|Phagen T7]], einem [[Viren|Virus]], der das DarmbakteriumDarmbakterien der Spezies ''[[Escherichia coli]]'' befällt. Das Enzym spielt eine bedeutende Rolle in der [[Biotechnologie]] bei der Expression von rekombinanten Proteinen[[Protein]]en, vor allem in ''E. coli'', aber auch in ''[[Bacillus subtilis]]'' und in [[Pseudomonas|Pseudomonaden]] existieren Anwendungen.

== Funktion ==

Die ersten [[RNA]] -Transkripte des Bakterienvirus ([[Phagen]]) T7 werden mit der RNA -[[Polymerase]] des Wirts durchgeführt. , Darunterdarunter auch die Information für die Translation der sehr promotorspezifischen T7 -RNA -Polymerase. Die T7 eigene Polymerase erkennt nur ihren eigenen [[Promotor (Genetik)|Promotor]] und istbietet deshalb eine sehr gute Methode, den Stoffwechsel des Wirts zu assimilieren und für die eigene Reproduktion zu nutzen. Die T7 -RNA -Polymerase gilt in Kombination mit dem T7 eigenen [[Promotor]] als besonders „starkes“ EspressionsystemExpressionsystem. Das bedeutet, dass mit diesem Promotor sehr viel RNA und als Folge davon häufig viel Protein pro Kopie auf einer DNA produziert werden kann. T7 -Polymerase hat während der [[Elongation (Transkription)|Elongationsphase]] der [[Transkription (Biologie)|Transkription]] eine Nukleotidadditionsgeschwindigkeit von 200- bis 260 Nukleotiden pro Sekunde (die normale ''E. -coli'' -RNA -Polymerase erreicht etwa 40 NukleotidenNukleotide pro Sekunde).

== Der T7 -Promotor ==

Der T7 -Promotor hat eine spezifische Sequenz:

TAATACGACTCACTATAGGGAGA

Der Promotor verfügt über fast keine [[Basaltranskription]]. Das heißt, bei Abwesenheit von T7 -RNA -Polymerase wird er so gut wie nicht abgelesen.

== Anwendung in der Biotechnologie ==

Die stärkeStärke des T7 -Expressionsystems machen den T7 -Promotor und die T7 -Polymerase sehr interessant für die Expression rekombinaterrekombinanter Proteine. Daher existieren inzwischen diverse Vektoren zur Proteinexpression, die das T7 -System verwenden, wie etwa die pET -Serie der Firma MERCK/NovaGene.

In der Regel befindet sich auf einem Vektor die T7 -Promotorsequenz und dahinter (vor einer notwendigen RBS) die codierende Region für ein „''protein of intrestinterest''“. Da ein solches Expressionssystem wegen der oben genannten Gründe nicht funktionsfähig wäre (da vom Expressionsorganismus keine T7 -Polymerase produziert wird), muss die T7 -Polymerase künstlich in das System eingebracht werden. Die häufigste Methode hierzu ist die genomische Verankerung einer T7 -[[Expressionskassette]] im Produktionsorganismus. Der am häufigsten hierfür benutzte Organismus ist ''E. coli''. Bei ihm bezeichnet man den entsprechenden Genotyp, der eine genomische T7 -Polymerase anzeigt, mit (DE3), da die T7 -Polymerase mit Hilfe des DE3 Prophagen„DE3-Prophagen“ ins Genom integriert wurde. Hierbei steht die Expression der T7 -Polymerase unter Kontrolle des [[LacUV5|''lac''UV5 ]]-Promotors, der mittels [[IPTG]] oder [[Lactose]] induziert werden kann.

=== Probleme bei der Verwendung von T7 -Expressionssystemen ===

Es gibt mehrere Probleme die sich aus der Verwendung des T7 -Expressionssystems ergeben:

Die verwendete, genomisch verankerte Expressionskassette für die T7 -RNA -Polymerase ist nicht „dicht“ , man spricht hier von einer sogenannten Basaltranskription. Die Folge ist, dass so stets eine gewisse Menge an T7 -Polymerase vorhanden ist, die dafür sorgt, dass der Produktionsorganismus auch dervor der eigentlichen Induktion schon ProteinenProtein exprimiert. Das ist vor allem bei toxischen Produkten sehr nachteilig und außerdem bedeutet es eineneine unnötige metabolische Belastung des Produktionsorganismus. Auch die Addition eines ''lac'' Operators auf dem Vektor zwischen Promotor und proteincodierender Sequenz zeigt hier wenig ErfolgtErfolg.

Eine weitere Methode ist die genomische Verankerung einer T7-Lysozym -Expressionskassette (Genotyp Bezeichnung in ''E. coli'' ''pLys'') oder die Addition eines entsprechenden Plasmids . T7-Lysozym bindet an die T7 -Polymerase und hemmt diese.<ref name="PMID2023259">F. W. Studier: ''Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system.'' In: ''Journal of molecular biology.'' Band 219, Nummer 1, Mai 1991, S.&nbsp;37–44, PMID 2023259.</ref> Allerdings bedeutet diese Methode ebenfalls eine zusätzliche Belastung für den ProduktionsoProduktionsorganismus und sorgt nicht für optimale Ergebnisse im Bezug auf die Basaltranskription.

Die neusteneusten Entwicklungen sind T7 -Stämme, die nicht mehr über den (DE3) -Genotyp verfügen, das heißt die T7 -Polymerase unter Kontrolle des ''lac''UV5 -Promotors tragen, sondern unter wesentlich dichteren Promotorsystemen wie etwasetwa dem Rhamnose- oder Arabinoseoperon. Bei diesemdiesen StammenStämmen wird die T7 -Polymerase erst nach Zugabe des entsprechenden Zuckers produziert. Das führt zu einer wesentlich geringeren BasaltanskriptionBasaltranskription. Da diese Zucker im Vergleich zu IPTG relativ teuer sind, gelten solche Systeme allerdings nicht als wirtschaftlich bei der Produktion von kostengünstigen rekombinanten Produkten.

Ein zweites Problem bei der Verwendung des T7 -Systems ist die starke Überexpression des „''protein of intrestinterest''“. Die Folge hiervon ist ein hoher Produktverlust durch [[Inclusion Bodies]].